啤酒花总黄酮测定方法的比较研究

李 涛,刘晓璠,杨小兰*

(山西大学生命科学学院,山西 太原 030006)

摘 要:以高效液相色谱法对啤酒花总黄酮含量的测定结果作为评判标准(相对准确值),比较与评价AlCl3分光光度法、Al(NO3)3分光光度法和硼氢化钠/氯醌分光光度法3 种比色法测定酒花总黄酮含量的准确性。结果表明,高效液相色谱法测定酒花总黄酮含量为(12.73±0.26) mg/g;AlCl3法测得总黄酮含量为(13.66±0.45)mg/g,与高效液相色谱法偏差率为7.3%;而Al(NO3)3法测定结果为(43.53±1.16)mg/g,与高效液相色谱法的偏差率为241.9%;硼氢化钠/氯醌法测定结果为(70.25±1.42)mg/g,与高效液相色谱法的偏差率为451.8%。提出AlCl3分光光度法比其他2 种比色法更适用于酒花总黄酮含量的测定,该方法误差小,准确性好。

关键词:酒花;总黄酮;分光光度法;高效液相色谱法;黄腐酚

 

Comparative Study on Assays for Determination of Flavonoids in Hops (Humulus lupulus L.)

 

LI Tao, LIU Xiao-fan, YANG Xiao-lan*

(College of Life and Science, Shanxi University, Taiyuan 030006, China)

 

Abstract: The accuracy of three spectrophotometric assays for the determination of flavonoids in hops
(Humulus lupulus L.) using respectively AlCl3, Al(NO3)3 and sodium borohydride/chloranil (SBC) was evaluated by comparison with the reference data (relatively more accurate) from HPLC analysis. The results showed that the total content of flavonoids in hops was (12.73 ± 0.26) mg/g by HPLC, compared to (13.66 ± 0.45) mg/g, (43.53 ± 1.16) mg/g, and (70.25 ± 1.42) mg/g with a relative deviation of 7.3%, 241.9% and 451.8%, respectively, as spectrophotometrically assayed using AlCl3, Al(NO3)3 and SBC. Therefore, the AlCl3-based assay is proposed to be more suitable for the determination of flavonoids in hops with smaller errors.

Key words: Humulus lupulus L.; total flavonoids; colorimetric methods; high performance liquid chromatography (HPLC); xanthohumol (XN)

中图分类号:TS261.7 文献标志码:A 文章编号:1002-6630(2014)18-0089-04

doi:10.7506/spkx1002-6630-201418017

啤酒花(Humulus lupulus L.)为大麻科葎草属多年生蔓性草本植物,简称酒花,是啤酒工业的原料[1],它赋予啤酒特有的苦味与香味。酒花亦作为一种植物药被国内外广泛使用[2]。近年来,啤酒花中黄酮类物质逐渐受到人们的重视,研究表明,酒花黄酮具有抗病毒[3]、抗菌[4-5]、抗肿瘤[6]、抗氧化[7-8]等活性。

目前,总黄酮的测定方法主要有分光光度法和高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)法。分光光度法主要有AlCl3分光光度法[9]、Al(NO3)3分光光度法[10]和硼氢化钠/氯醌(sodium borohydride/chloranil,SBC)分光光度法[11],其基本原理为黄酮类化合物进行络合显色,通过标准对照测定总黄酮的含量。分光光度法所用设备简单,操作容易,广泛用于植物总黄酮的测定,但该方法专一性差,由于一些酚类物质的干扰使得测定结果偏高[12]。HPLC法具有分析速度快、灵敏度高、结果准确的特点,该法可以通过相应的对照品直接测定总黄酮含量,也可以通过水解后测定黄酮苷元含量,再通过转化系数求得总黄酮含量,但该方法样品前处理复杂,且仪器昂贵不能广泛应用[13]。本实验采用HPLC法和AlCl3、Al(NO3)3和SBC 3种分光光度法对酒花总黄酮含量进行测定,以HPLC法的测定结果作为评判标准(相对准确值),比较3种分光光度法测定结果的偏差率。目的是确定一种最适合于酒花黄酮测定的分光光度法,为酒花的开发利用研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

酒花(青岛大花) 新疆绿金啤酒花有限责任公司;芦丁(纯度95%)、儿茶素(纯度96.0%)、槲皮素(纯度98%)、山奈酚(纯度98%)、黄腐酚(纯度98%) 美国Sigma公司;甲醇、乙腈(均为色谱纯) 美国Fisher Scientific公司;其他药品均为分析纯 天津光复科技发展有限公司。

1.2 仪器与设备

高效液相色谱仪(1525系列双泵系统、2487双波长紫外检测器、Breeze软件操作系统) 美国Waters公司;sp-2102UVpc紫外-可见分光光度计 上海光谱仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酒花总黄酮的提取

1.000 g粉碎酒花,用石油醚加热回流60 min,除去色素及脂(酯)类[2]。过滤后将啤酒花中残留石油醚挥干。加入50 mL体积分数70%甲醇30 ℃超声提取1 h,离心后过滤分离得上清液,按上述条件重复提取1 h,将2 次上清液混合定容至100 mL作为酒花黄酮提取液。

1.3.2 HPLC法测定酒花总黄酮

1.3.2.1 盐酸水解-HPLC法测酒花黄酮苷

样品水解处理[14]:取酒花黄酮提取液10 mL,加10 mL甲醇,5 mL体积分数25%盐酸(以浓盐酸为基准)溶液,置水浴中80 ℃回流水解2 h后,迅速冷却至室温,全部转移至100 mL容量瓶中,用甲醇稀释至100 mL,作为水解样品。将未水解样品与水解样品均用0.45 μm滤膜过滤,用HPLC进行游离黄酮苷元和水解产生黄酮苷元的测定。采用0.008、0.016、0.032、0.048、0.064 μg/mL
5个梯度的槲皮素和山奈酚混标溶液制作标准曲线。所有测定均进行5 次平行测定,结果数据以平均值±标准差表示。

色谱条件[15]:Symmetry C18柱(4.6 mm×150 mm,5 μm);检测波长370 nm;柱温40 ℃;流速1.0 mL/min;进样量10 μL;流动相组成及洗脱程序见表1。

表 1 盐酸水解-HPLC法测黄酮苷元梯度洗脱程序

Table 1 Mobile phase gradient program for the analysis of flavonoid aglycone by hydrochloric acid hydrolysis-HPLC method

时间/min

CH3OH体积分数/%

质量分数0.1% H3PO4溶液体积分数/%

0~20

55

45

20.1~30

55~50

45~50

 

 

1.3.2.2 酒花中黄腐酚(xanthohumol,XN)含量的测定[16]

采用1.3.2.1节色谱条件,流动相组成及洗脱程序见表2。采用2、4、8、16、24 μg/mL 5个梯度的XN标准品使用最小二乘方直线回归法制作标准曲线,以质量浓度为横坐标,峰面积为纵坐标。所有测定均进行5 次平行测定,结果数据以平均值±标准差表示。

表 2 HPLC测XN梯度洗脱程序

Table 2 Mobile phase gradient program for XN analysis by HPLC method

时间/min

乙腈体积分数/%

体积分数1%的冰醋酸溶液体积分数/%

0~20

50~80

50~20

20.1~30

80

20

 

 

1.3.3 分光光度法测定酒花总黄酮

1.3.3.1 AlCl3法[9]

精确吸取0.2 mg/mL芦丁标准液0.25、0.50、1.0、2.0、3.0、4.0 mL和一定量的样品酒花黄酮提取液分别置于10 mL试管中;加入0.1 mol/L AlCl3溶液2 mL、1 mol/L乙酸钾溶液3 mL,用体积分数70%甲醇定容至10 mL,室温放置30 min,同时以体积分数70%甲醇做空白对照,在波长420 nm处测吸光度[5]。以芦丁标准液的质量浓度为横坐标,以吸光度为纵坐标,绘制芦丁标准曲线。以样品的吸光度通过标准曲线计算其总黄酮含量。进行5 次平行测定,结果数据以平均值±标准差表示。

1.3.3.2 Al(NO3)3法[10]

分别取0.2 mg/mL的芦丁标准液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL和一定量的样品酒花黄酮提取液置于7 只试管中,用体积分数70%的甲醇补足体积到5 mL,后各加入0.3 mL质量分数5%NaNO2溶液,混合后静置5 min;再加入0.3 mL质量分数10%的Al(NO3)3溶液,混合后静置6 min;最后加入4 mL 1mol/L NaOH溶液,加入0.4 mL体积分数30%甲醇使总体积为10 mL,混合后静置10 min,在波长510 nm处测定吸光度。以芦丁标准液的质量浓度为横坐标,以吸光度为纵坐标,绘制芦丁标准曲线。以样品的吸光度通过标准曲线计算其总黄酮含量。进行5 次平行测定,结果数据以平均值±标准差表示。

1.3.3.3 硼氢化钠/氯锟法

按照He Xiangjiu等[11]的方法进行,将一定量酒花黄酮提取液氮气干燥,回收于1 mL四氢呋喃-乙醇溶液中作为样品。以儿茶素为标准对照,使用四氢呋喃-乙醇作为溶剂配制成不同质量浓度酒花黄酮的样品溶液。每1 mL样品溶液或1 mL儿茶素标准溶液的试管中加入0.5 mL 50 mmol/L NaBH4溶液和0.5 mL 74.56 mmol/L AlCl3溶液,室温振荡30 min,再追加0.5 mL NaBH4溶液到每个试管中,继续在室温条件下振荡30 min,然后将冷乙酸溶液(4 ℃、2.0 mL、0.8 mol/L)加入到每个试管中,避光振荡15 min后,再将1 mL 20 mmol/L氯醌添加到每个试管中,100 ℃水浴加热60 min,反应后迅速冷却试管,并将最终体积用甲醇定容为4 mL。然后,每管加入1 mL 1 052 mmol/L香兰素,混匀后加入12 mol/L盐酸2 mL,避光反应15 min。最终反应液在波长490 nm处测量吸光度。以儿茶素标准液的质量浓度为横坐标,以吸光度为纵坐标,绘制儿茶素标准曲线。以样品的吸光度通过标准曲线计算其总黄酮含量。进行5 次平行测定,结果数据以平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 HPLC法测定酒花总黄酮

2.1.1 盐酸水解-HPLC法测定酒花黄酮苷含量

黄酮游离苷元在自然界中不稳定而很难存在,因此,黄酮多以糖苷形式稳定存在[17]。对照品HPLC色谱图见图1。本实验对未水解的酒花样品中游离苷元进行测定。结果表明,酒花中不含游离黄酮苷元,这与王鹏等[18]的研究结果相同。因此,采用经水解的酒花样品测得的苷元均为黄酮苷水解后所产生的苷元,其测定结果见图2。图2中峰1保留时间为5.21 min,与图1对照品槲皮素保留时间(5.21 min)相同,可确定为槲皮素。图2中峰2保留时间为8.41 min,与图1对照品山奈酚保留时间(8.41 min)相同,可确定为山奈酚。测定结果显示,酒花中仅含槲皮素和山奈酚2 种黄酮苷元,这与王仿等[19]的结果一致。槲皮素标准曲线:Y=3.75×106X-28 416.3(R2=0.998 8)。山奈酚标准曲线:Y=8.47×106X-115 426.1(R2=0.992 6)。由标准曲线计算得酒花黄酮提取物中槲皮素苷元(P1)的含量为(0.031 0±0.000 3)mg/mL,山奈酚苷元(P2)的含量为(0.012 7±0.000 6)mg/mL。

767473.jpg 

图 1 对照品HPLC色谱图

Fig.1 HPLC chromatogram of the reference

767488.jpg 

1.槲皮素;2.山奈酚。

图 2 水解样品HPLC色谱图

Fig.2 HPLC chromatogram of the hydrolyzed sample

1993年,Sticher首次提出通过转换因子由黄酮苷元计算得到黄酮苷含量,山奈酚转换因子为2.64,槲皮素转换因子为2.51[20]。由公式(1)得到酒花中总黄酮苷含量为(11.134±0.234)mg/g。

767428.jpg (1)

式中:P1为水解液中槲皮素苷元含量(0.031 0×10-3
mg/mL);P2为水解液中山奈酚苷元含量(0.012 7×10-3
mg/mL);r1为槲皮素苷元转换因子为2.51;r2为山奈酚苷元转换因子为2.64;m酒花为酒花质量/g;
V提取液为提取溶液的体积/mL。

2.1.2 HPLC法测酒花中XN含量

HPLC法测得XN对照品保留时间为9.780 min
(图3),标准曲线:Y=61 829X+33.102,R2=0.998。酒花样品的XN测定色谱图见图4,由标准曲线计算出酒花中XN含量为(1.300±0.025)mg/g。

767525.jpg 

图 3 XN标准品HPLC色谱图

Fig.3 HPLC chromatogram of XN reference

767545.jpg 

图 4 酒花中XN HPLC色谱图

Fig.4 HPLC chromatogram of XN in hops

2.1.3 酒花总黄酮计算结果

先前的研究已表明,酒花中的黄酮类化合物主要是黄酮苷和异戊烯基类黄酮,而异戊烯基类黄酮的主要组成为XN,其含量占异戊烯基类黄酮的80%[21]。因此,由公式(2)得出酒花总黄酮含量为(12.73±0.26)mg/g。

酒花总黄酮含量/(mg/g)=黄酮苷含量+XN含量/80% (2)

2.2 3 种分光光度法测定结果的比较

本研究中,AlCl3分光光度法测得芦丁标准曲线为y=3.793 1x-0.000 5,R2=0.999 7;Al(NO3)3法测得芦丁标准曲线为y=1.196 2x+0.020 8,R2=0.995 8;SBC法测得儿茶素标准曲线为y=0.027 6x+0.125 4,R2=0.995 0。采用公式(3)计算3 种分光光度法与HPLC法相比的偏差率。

767455.jpg (3)

结果表明,AlCl3法测定的酒花总黄酮含量为(13.66±0.45)mg/g,与HPLC法相比偏差率为7.3%;Al(NO3)3法测定的酒花总黄酮含量为
(43.53±1.16)mg/g,与HPLC法相比偏差率达241.9%;而SBC法测定的酒花总黄酮含量为(70.25±1.42)mg/g,
与HPLC法相比有最大的偏差率为451.8%。结果表明,AlCl3法测定的总黄酮含量与Al(NO3)3法和SBC法相差甚远,从理论上分析,黄酮分子中的羰基与其邻位羟基或2 个邻二酚羟基均能与金属离子Al3+配位,生成稳定的5、6元环的有色络合物[22]。但是,Al(NO3)3法是在碱性条件下,显色反应可以发生在非黄酮类多酚类化合物原儿茶素、原儿茶醛、原儿茶酸、咖啡酸、绿原酸、羟基苯甲酸类等的邻二酚羟基部位,导致黄酮测定结果偏高[23]。因此,Al(NO3)3法并非是测定黄酮类化合物专属,而对多酚类物质均有显色反应。据文献报道,酒花中含有4%~12%的多酚[24],
主要为原花青素、黄酮苷和异戊烯基黄酮[18],其中原花青素占总多酚的50%以上[24]。酒花原花青素具有邻二酚羟基结构,可以与Al(NO3)3发生显色反应后在波长510 nm处有很强吸收,导致酒花总黄酮测定结果偏高。而AlCl3法的测定环境是酸性,在此条件下,只与黄酮分子中的羰基与其邻位羟基之间反生显色反应,其显色机理见图5[23]。

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图 5 AlCl3法的显色机理

Fig.5 Mechanism of color development of aluminum chloride method

由此可见,AlCl3法可以避免邻二酚羟基结构的非黄酮类化合物的干扰,对黄酮类化合物的测定专属性较强[25]。所以AlCl3法测定酒花总黄酮具有更好的专属性,更高的准确度。而SBC法中的四氢硼钠反应是鉴别二氢黄酮类化合物专属性较高的反应[11],以儿茶素表示,用于测定酒花黄酮含量误差较大。

3 结 论

本实验采用盐酸水解-HPLC法测定酒花黄酮苷元,通过转换因子计算得到实际的黄酮苷含量,通过HPLC法测定酒花XN含量折算出异戊烯基类黄酮含量,二者之和为酒花总黄酮含量,所得结果更接近真实值。以此作为评判标准,对AlCl3分光光度法、Al(NO3)3分光光度法和SBC分光光度法3 种比色法测定酒花总黄酮结果进行了比较评价。结果表明,AlCl3分光光度法比其他2 种比色法更适用于酒花总黄酮的测定。

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收稿日期:2013-11-27

基金项目:国家自然科学基金面上项目(31171748);山西省科技攻关项目(20090321097)

作者简介:李涛(1989—),女,硕士研究生,研究方向为食品生物技术。E-mail:1020486956@qq.com

*通信作者:杨小兰(1956—),女,教授,学士,研究方向为食品生物技术。E-mail:1454552647@qq.com