大菱鲆冷藏过程中新鲜度评价

李婷婷1，刘剑侠2，李学鹏2，胡文忠1，励建荣2,*

（1.大连民族学院生命科学学院，辽宁 大连 116600；

2.渤海大学食品科学研究院，辽宁省食品安全重点实验室，辽宁 锦州 121013）

摘 要：为研究大菱鲆冷藏过程中的新鲜度变化规律，以菌落总数、挥发性盐基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）含量、硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）值、腺苷三磷酸关联物和K相关值（K、Ki、H、Fr、G和P值，鱼肉新鲜度的参考指标）为指标，结合感官评定，探究大菱鲆在20 d贮藏期内的品质变化情况。结果表明：肌苷酸和Fr与贮藏时间呈显著负相关（r=－0.870，r=－0.887）；K值随贮藏时间延长显著升高直至趋于稳定（r=0.895）。因此，菌落总数、TVB-N含量、K值、感官评定适宜作为冷藏大菱鲆的新鲜度评价指标，且K值的灵敏度要高于菌落总数和TVB-N含量；TBA值不适宜作为冷藏大菱鲆的新鲜度指标；4 ℃冷藏环境下的大菱鲆货架期为12 d。

关键词：大菱鲆；冷藏；鲜度变化；ATP关联物

Freshness Evaluation of Turbot (Scophthalmus maximus) during Refrigerated Storage

LI Ting-ting1, LIU Jian-xia2, LI Xue-peng2, HU Wen-zhong1, LI Jian-rong2,*

(1. College of Life Science, Dalian Nationality of University, Dalian 116600, China;

2. Food Safety Key Laboratory of Liaoning Province, Institute of Food Science Research, Bohai University, Jinzhou 121013, China)

Abstract: In order to evaluate the freshness of turbot (Scophthalmus maximus) during refrigerated storage, the changes in total viable counts (TVC), total volatile basic nitrogen (TVB-N), thiobarbituric acid (TBA), ATP-related compounds and K value were investigated by periodical determination. The results showed that IMP and Fr exhibited a significantly negative correlation (r = -0.870, r = -0.887). K value increased significantly with the extension of storage time until reaching a stable level (r = 0.895). TVC, TVB-N and K values and sensory evaluation could be applied as indexes for freshness evaluation. Furthermore, the sensitivity of K value was higher when compared with the values of TVC and TVB-N; TBA value was not appropriate for the freshness evaluation of refrigerated turbot. Based on the microbiological, physical and chemical changes observed throughout the storage period 4 ℃, the shelf life of turbot was 12 days.

Key words: turbot; refrigerated storage; freshness change; ATP-related compounds

中图分类号：S983 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）18-0190-06

doi:10.7506/spkx1002-6630-201418037

水产品的腐败变质主要是因为体内与自溶有关的酶和与腐败有关的微生物的作用。鱼类死后，在其体内进行着一系列物理、化学和生理上的变化。在微生物腐败开始之前，鱼肌肉中的自溶酶迅速释放，随之生成一系列的化合物，在这些化合物中，ATP及其相关降解物含量是评价鱼体新鲜度的最有效指标[1-3]。此外挥发性盐基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）含量、硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）值经常配合感官评价和微生物评价共同衡量鱼体的新鲜度。

大菱鲆是冷水性的深海比目鱼类，原产于英国，主要分布于大西洋东部沿岸的北海和黑海西部，地中海沿岸也有分布[4]。近年来，大菱鲆因其优良口感和丰富的营养价值在我国北方沿海地区形成不断扩大的养殖规模，产品远销欧盟、美国和日本等地，大菱鲆的生产量、销售量和出口量均居国内前列。这种长距离的运输极易造成高水分、高蛋白的大菱鲆因滋长微生物而腐败变质，因此研究冷藏大菱鲆的新鲜度指标变化无疑具有实际的商业价值。鉴于新鲜度对水产品品质及原料的加工适性有着巨大影响，直接决定产品品质和消费者的消费嗜好，本实验以4 ℃冷藏环境下的大菱鲆为研究对象，从腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）及其降解物、TVB-N含量和TBA值的变化角度，结合微生物检测和感官评价来衡量大菱鲆冷藏过程中的新鲜度变化，以期为大菱鲆保鲜和加工提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

养殖大菱鲆活鱼，产地辽宁省大连市，购于锦州市林西路水产市场，每批次共24 条，每条鱼的质量为（700±50）g。

高温蒸煮袋，购于江苏省连云港市伟希铝塑包装公司。

1.2 仪器与设备

AF-10制冰机 斯科茨曼制冰机系统（上海）有限公司；MLS-3030CH立式高压灭菌锅 三洋电机（广州）有限公司；LRH系列生化培养箱 上海一恒科技有限公司；SW-CJ-2FD超净工作台 苏景集团苏州安泰技术有限公司；UV-2550紫外-可见分光光度计 尤尼柯（上海）仪器有限公司；DK-S24电热恒温水浴锅 上海
森信实验仪器有限公司；Kjeltec-8400全自动定氮仪 丹麦
Foss公司；1200高效液相色谱 美国安捷伦科技公司；Biofuge Stratos台式高速离心机 美国Thermo Fisher
公司。

1.3 方法

1.3.1 贮藏实验

将鲜活大菱鲆鱼置于洁净泡沫箱中，泡沫箱放于（2.0±0.5）℃冷库中，采用层鱼层冰的方式冷冻致死，然后用无菌蒸煮袋包装，包装方式为空气包装（非真空非气调包装），于（4.0±0.5）℃冰箱中贮藏。在第0、4、8、12、16、20天取样测定微生物指标、化学指标、感官品质的变化。

1.3.2 样品处理

大菱鲆背部沿脊椎分开左右两边，一边有内脏，一边无内脏。微生物指标、感官评定的采样位置为背部无内脏一侧。微生物取样严格无菌操作，取样工具使用前灭菌处理，取样环境无菌；其他指标取背部剩余肌肉部分，避开内脏区域，以免内脏破裂影响肉质，绞碎去皮即可。

1.3.3 菌落总数测定

按GB 4789.2—2010《食品微生物学检验：菌落总数测定》进行测定，采用平板倾注法计算菌落数测定。

1.3.4 TVB-N含量测定

参考FOSS应用子报[5]测定鱼肉中的TVB-N含量。具体方法为：用无氮称量纸精确称取10 g左右（精确到0.1 mg）绞碎样品到750 mL的蒸馏管中，加入1 g MgO和3 滴消泡剂，再加入50 mL蒸馏水到蒸馏管中，用手摇晃混合。

仪器设定的条件为：1%硼酸接收液30 mL，蒸馏时间为5 min，用0.1 mol/L盐酸标准滴定液。每批样品扣除试剂空白，TVB-N含量单位为mg N/100 g。

1.3.5 TBA值测定

参考Siu等[6]的TBA值测定方法，称取10 g搅碎鱼肉于烧杯中，加入25 mL蒸馏水和25 mL 10%三氯乙酸，均质，静置30 min过滤。取5 mL上清液于比色管中，然后向比色管中加入5 mL的TBA溶液（0.02 mol/L）。将上述混合液在（80±1）℃的恒温水浴加热40 min，然后冷却至室温，在532 nm波长处测定吸光度。TBA值用丙二醛的质量分数表示，单位为mg MDA/kg。

1.3.6 ATP相关降解产物测定

实验参考John[7]的方法，经修改后的大菱鲆ATP关联物的提取方法为：取5 g绞碎的鱼肉于烧杯中，向烧杯中加入25 mL高氯酸（0.06 mol/L），充分匀浆后，于1 940×g离心10 min，取出上清液，将其pH值调节至6.5～6.8范围内。然后于1 940×g再次离心10 min后，取上清液，定容至25 mL。使用前用0.45 μm的滤膜过滤。若长期不用，可于－80 ℃冻藏。

色谱条件：色谱柱BDS C18（250 mm×4.6 mm），以0.04 mol/L KH2PO4和0.06 mol/L K2HPO4混和溶液作为流动相。进样量为20 µL，液相流速为1 mL/min，柱温为37 ℃，紫外检测器波长为254 nm。

ATP及其降解产物标准品HPLC图谱的测定：ATP、腺苷二磷酸（adenosine diphosphate，ADP）、腺苷酸（adenosine monophosphate，AMP）、肌苷酸（inosine monophosphate，IMP）、肌苷（hypoxanthine ribonucleoside，HxR）和次黄嘌呤（hypoxanthine，Hx）单标样品以及它们的混合标样在上述色谱条件下进行测定，以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线。

1.3.7 K、Ki、H、Fr、G值和P值

（1）

（2）

（3）

（4）

（5）

（6）

式中：K、Ki、H、Fr、G值和P值均为以ATP降解物为基础，经过相关数学运算获得的数值，是用以衡量鱼体新鲜度的参考指标。ATP、ADP、AMP、IMP、HxR、Hx分别代表三磷酸腺苷、二磷酸腺苷、腺苷酸、肌苷酸、次黄嘌呤核苷、次黄嘌呤含量/（μmol/g）。

1.3.8 感官评价

大菱鲆冷藏过程中的品质优劣以4 个等级划分，分别为高品质（E）、较好品质（A）、一般品质（B）和货架期品质（C）。评价方法参考Minia等[8]并做细微修改，评价过程挑选6 位有经验的感官评定员，分别从体表、气味、鳃、眼睛、肌肉和肉味6 方面进行评价。

表 1 冷藏大菱鲆感官评定参考表

Table 1 Criteria for organoleptic evaluation of refrigerated turbot

1.4 数据处理

采用Origin 7.5绘图，SPSS 17.0进行方差分析。
P＜0.01为差异极显著，P＜0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 大菱鲆冷藏过程中菌落总数的变化

图 1 大菱鲆在冷藏过程中菌落总数的变化

Fig.1 Changes in total viable counts (TVC) of Scophthalmus maximus during refrigerated storage

大菱鲆在冷藏过程中的菌落总数变化情况如图1所示。其初始值为2.6（lg（CFU/g）），在贮藏至第12天时菌落总数值达到5.49（lg（CFU/g）），在贮藏至20 d时达到7.59（lg（CFU/g））。本实验所测得的初始值较崔正翠[9]、Zwietering[10]等的初始值偏低，这可能与鱼类生存及捕获环境、捕获季节以及捕获方法有关。按照GB 18406.4—2001《农产品安全质量无公害水产品安全要求》相关规定，菌落总数应不大于6（lg（CFU/g）），以此判断水产品货架期终点。由图1可知，在贮藏的最初12 d内，通过菌落总数表明大菱鲆保持着较好的品质。在整个贮藏期内，大菱鲆的菌落总数值与贮藏时间呈显著正相关（r=0.984）。

2.2 大菱鲆冷藏过程中TVB-N含量的变化

图 2 大菱鲆在冷藏过程中TVB-N含量的变化

Fig.2 Changes in total volatile basic nitrogen (TVB-N) of Scophthalmus maximus during refrigerated storage

研究[11-12]表明，新鲜屠宰的鱼肉中TVB-N含量一般维持在5～20 mg N/100 g，当肌肉中TVB-N含量达到30～35 mg N/100 g时样品已到达冷藏鱼类的感官拒绝极限。由图2可知，TVB-N含量在贮藏期内由最初的10.23 mg N/100 g上升到最终的59.64 mg N/100 g，一直表现出持续升高的趋势。在贮藏至12 d时TVB-N含量达到26.15 mg N/100g，贮藏至16 d时达到40.45 mg N/100g，达到感官拒绝期。一般认为，TVB-N类化合物主要是由于细菌的分解代谢产生的，所以贮藏至16 d时较高的菌落总数值（6.88（lg（CFU/g）））与较高的TVB-N含量有很好的相关性（r=0.953）。相似的结论也在众多的国外研究中有所体现[13-14]。

2.3 大菱鲆冷藏过程中TBA值的变化

图 3 大菱鲆在冷藏过程中TBA值的变化

Fig.3 Changes in thiobarbituric acid (TBA) of Scophthalmus maximus during refrigerated storage

TBA值被广泛应用于衡量脂肪氧化的程度。但鱼体的脂肪氧化与鱼的种类、贮藏温度、脂肪含量等众多因素有关[15]。对冷藏大菱鲆而言，该值表现出先升高后降低的趋势。与此类似，较低的TBA含量也在其他多种鱼中观察到，例如海鲈鱼[14]中。早在1993年，Auburg[16]就指出TBA值并不能很好地表征脂肪的氧化情况，原因在于丙二醛可以和鱼体的其他成分发生反应，这些成分可能是胺类、核苷和核苷酸、蛋白质、磷脂类氨基酸以及醛类化合物，这些物质的产生终止了脂肪氧化的进程，其相互作用也因鱼的种类不同而表现出很大差别，故从图3的数据显示了在初始4 d的贮藏期过后冷藏大菱鲆TBA值不断下降的现象。根据研究结果表明TBA值不能够反映冷藏大菱鲆的新鲜度变化。

2.4 ATP相关降解产物

鱼类死亡后其肌肉核苷酸会发生一系列的变化，肌肉内ATP依次降解为ADP、AMP、IMP、HxR和Hx，随着ATP向Hx转化，HxR和Hx所占比例越来越多，而鱼的新鲜度则越来越差。图4为大菱鲆20 d冷藏过程中ATP关联物的变化情况。由图4可知，IMP的初始含量为2.04 μmol/g，其在鱼肉中的含量在0～8 d的贮藏期内急剧下降，随后下降趋势较为平缓，至贮藏末期趋于稳定；在此过程中，HxR值呈现上升趋势，且一直保持在较高水平；AMP值有小幅度的下降，但其在鱼肉中的含量一直保持在0.5～1.0 μmol/g之间。ATP、ADP和Hx值较小，基本保持在0.0～0.25 μmol/g之间。有研究发现水产品死后ATP向IMP的降解与其体内的肌肉内源酶有关，而其快速降解则有赖于其体内ATP酶的高活性[17]。Watabe等[18]认为这种现象是由于水产动物在死后最初阶段，肌细胞中肌浆网的Ca2+吸附能力下降，使Ca2+大量释放到胞液中，促使肌原纤维内Ca2+的浓度增加，进而激活了肌原纤维ATP酶的活性，使ATP迅速降解。此外，有研究认为，ATP降解为ADP、AMP和IMP最快可在数小时内完成，从而使IMP达到峰值，而IMP进一步降解为HxR和Hx的过程却相对缓慢，视鱼种和贮藏条件的不同可以持续几天至十几天乃至更长时间[19]。如图4所示，本实验未观测到ATP、ADP的快速降解过程，而IMP不断下降，HxR不断积累，在贮藏末期略有下降，Hx也呈现不断累积增长的趋势。

图 4 大菱鲆冷藏过程中ATP关联物的变化

Fig.4 Changes in ATP-related compounds of Scophthalmus maximus during refrigerated storage

IMP是ATP降解的中间产物，也是鱼虾等水产品的重要鲜味物质，新鲜鱼类的鲜味口感与高含量的IMP紧密相关。但HxR和Hx的累积却会使鱼肉产生苦味和异味，因此近年来有学者提出采用Hx作为鱼肉鲜度评价的指标[20]。但本研究中，Hx的累积量在整个贮藏期内还不足0.25 μmol/g，显然不足以衡量鱼体的新鲜与否。这可能与鱼种和贮藏温度有关[21]，不同鱼种分解产生HxR和Hx的含量有所差异，不同贮藏温度也会影响两者的累积方式。

2.5 K、Ki、H、Fr、G值和P值

K值是以分析肌肉中ATP及其降解产物的含量为基础，通过进一步计算得到的一个指标，它能够反映水产品在低温贮藏前期的新鲜度变化。图5反映了冷藏过程中K、Ki、H、Fr、G值和P值的变化情况。K、Ki、H、Fr、G和P的初始值分别是22.66%、30.24%、0.34%、69.76%、23.68%和23.62%；贮藏至20 d时这系列值分别达到69.90%、99.15%、8.73%、0.85%、79.72%和74.49%。在整个贮藏过程中，K、Ki、G值和P值在贮藏初期迅速增加，之后趋于稳定；Fr值迅速下降，之后趋于稳定；H值有小幅度的上升，但其涨幅远小于K、Ki、G值和P值。K值的变化趋势与Özogul等[22]的研究结果极为相似。Alasalvar等[23]研究发现K、Ki、G值与冰藏欧洲海鲷新鲜度变化具有高度相关性（r =0.99）。Özogul等[22]认为4 ℃贮藏的野生白鲶鱼的K、Ki、G值和H值快速上升是由于IMP迅速消耗导致。一般认为，K值在20%以下时为一级新鲜度，20%～40%为二级新鲜度，60%～80%为初期腐败[24]。本研究中新鲜屠宰后的大菱鲆其K值达到22.66%，偏离了一级新鲜度的标准（＞20%），这可能与鱼种和屠宰方式有关。K值的大幅度升高在0～8 d的贮藏期内表现明显，第8天的K值达到62.63%，因此推测大菱鲆在4 ℃冷藏至第8天时已出现初期腐败，但这种腐败作用于鱼体内部肌肉中，可能还未被其他检测手段检测到。本研究认为K值及其相关值可作为评价大菱鲆新鲜度的指标，且具有高度灵敏性。但是Özyurt等[25]则研究认为K值和Ki值不适宜作为冰藏土耳其梭鲈的新鲜度指标，这说明K值能否作为评价鱼体新鲜度的指标与鱼种有关。

图 5 大菱鲆冷藏过程中K、Ki、H、Fr、G值和P值的变化

Fig.5 Changes in K, Ki, H, Fr, G and P values of Scophthalmus maximus during refrigerated storage

2.6 感官评定

由表2可知，大菱鲆在4 ℃冷藏过程中，其各个测定指标在前8 d保持较好品质，但在第12天时，鳃和眼睛已达到货架期品质。这说明，在外观的直观评价中，鳃和眼睛是指示大菱鲆品质的首要指标；而大菱鲆的肌肉品质之所以在第4天时仍保持着和第0天时的高品质可能与鱼类死后，贮藏初期的僵直情况有关。崔正翠等[9]研究认为，养殖大菱鲆在3 ℃贮藏时其较好品质期在197 h，这与本实验的8～12 d基本吻合。

表 2 大菱鲆冷藏过程的感官评价

Table 2 Organoleptic evaluation of Scophthalmus maximus during refrigerated storage

2.7 大菱鲆各指标的相关性分析

由表3可知，大菱鲆在低温贮藏过程中菌落总数、TVB-N值、Hx、H值和G值与贮藏时间呈极显著正相关（P＜0.01）；IMP、ATP、HxR、K值、Ki值、Fr值和P值与贮藏时间显著相关（P＜0.05）。其中菌落总数与贮藏时间的相关性最大（r=0.984）；其次为H值（r=0.972）和TVB-N含量（r=0.957）；ATP相关降解物中，除ADP和ATP与贮藏时间相关性不明显外，均与贮藏时间表现出较强的相关性；K值等相关值除Fr与贮藏时间呈显著负相关之外（r=－0.887），其他均呈正相关。此外，K值和Ki值，P值和G值，Fr值与IMP值，P值与Ki值，P值与K值均表现极显著正相关，相关性高达0.999。由此推测，在大菱鲆的冷藏过程中，对K值及其相关值而言，K值或Ki值在衡量鱼体新鲜度上可以互相取代，G值和H值随贮藏时间的延长增长趋势较其他值更为明显，宜选择K值（Ki值）、G值和H值共同衡量大菱鲆新鲜度。

3 结 论

大菱鲆在4 ℃冷藏过程中，其菌落总数、TVB-N含量随着贮藏时间延长而不断升高，与贮藏时间呈极显著相关；TBA变化情况与贮藏时间无相关性，但其与菌落总数和TVB-N含量均呈显著负相关，这说明脂肪氧化与细菌的大量繁殖以及蛋白质分解有关；ATP关联物（ADP、AMP除外）在鱼肉中的含量随贮藏时间变化明显，且HxR的累积速度远高于Hx的累积速度。ATP关联物和K值等相关值（包括Ki、G和H值）能够在一定程度上反映鱼体新鲜程度，且其灵敏性要高于菌落总数和TVB-N含量；根据菌落总数值、TVB-N含量、K值等相关值和感官评定的结果，表明大菱鲆在8～12 d出现初期腐败，贮藏至12 d已完全达到货架期水平。

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