核桃相关多酚对α-淀粉酶的作用研究进展

陆 秋1，陈朝银1,*，赵声兰2

（1.昆明理工大学生命科学与技术学院，云南 昆明 650500；2.云南中医学院，云南 昆明 650500）

摘 要：核桃含有没食子酸、咖啡酸、槲皮素等丰富的多酚。这些多酚有抗氧化、抗炎、抗肿瘤等多种生物学活性，其中香草酸、绿原酸、没食子酸、槲皮素、芦丁等许多组分对α-淀粉酶的抑制率为2%～70%，有的还具有协同作用。多酚的羟基化有利于提高其对α-淀粉酶的抑制活性，甲基化、甲氧基化会降低其抑制活性，糖基化降低抑制活性的效果则取决于糖基的共轭位点及其类型。

关键词：核桃相关多酚；α-淀粉酶；相互作用；构效关系

Progress in Understanding of the Interaction between Walnut Polyphenols and Alpha-Amylase

LU Qiu1, CHEN Chao-yin1,*, ZHAO Sheng-lan2

(1. Faculty of Life Science and Technology, Kunming University of Science and Technology, Kunming 650500, China;

2. Yunnan University of Chinese Traditional Medicine, Kunming 650500, China)

Abstract: Walnut kernels contain abundant polyphenols such as gallic acid, caffeic acid, and quercetin. These polyphenols have anti-oxidant, anti-inflammatory, anti-tumor, and other biological activities. Some phenolic compounds including vanillic acid, chlorogenic acid, gallic acid, quercetin, and rutin individually inhibit α-amylase activity by 2%–70% or exert a synergistic inhibitory effect. The activity of α-amylase is enhanced by polyphenols through hydroxylation but inhibited through methylation or methoxylation. The inhibitory effect of glycosylation on α-amylase depends on conjugation sites and type of sugar moieties.

Key words: walnut polyphenols; α-amylase; interaction; structure-activity relationship

中图分类号：R151.41 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）19-0328-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201419065

多酚是一个或两个芳族上带有一个或多个羟基取代的酚类化合物[1]。主要有酚酸类（C6-C3）[2]和黄酮类（C6-C3-C6）[3]。天然多酚作为人类饮食不可或缺的部分，主要在植物源性食品和饮料的感官及糖尿病的治疗、生理功能上发挥作用，其中对糖尿病等代谢性疾病的作用是研发热点之一[4-5]。

糖尿病（diabetes mellitus，DM）是一种因为体内胰岛素绝对或者相对不足所导致的一系列临床综合症，近年已成为继肿瘤、心脑血管病后第三位严重的慢性病，在我国已达总人口的3.5%，并逐年呈上升趋势[6]。常用的治疗糖尿病的途径之一是通过降低碳水化合物水解酶（如α-淀粉酶）的活性，限制或者延缓碳水化合物在消化道内的分解，以达到延缓葡萄糖的吸收来降低餐后血糖水平的目的[7]。医学界已将α-淀粉酶抑制剂（如阿卡波糖和伏格列波糖）列为第三类口服降糖药，但这些药物可能会诱导心脏病、肝损伤、肾肿瘤、急性肝炎等发生[8]，故人们转向植物源性α-淀粉酶抑制剂，多酚是其研发热点之一。

1 已知的核桃相关多酚及其功能

核桃位居“四大干果”之首，含有丰富的多酚。核桃带衣整仁多酚的含量为1.85%～2.75%、核桃衣含多酚则高达24.01%～57.58%、脱衣仁含多酚0.084%～0.098%[9-10]。其中已分离鉴定的有红景天苷、儿茶素、芦丁等黄酮类化合物及没食子酸、阿魏酸、绿原酸等酚酸类化合物[11]（表1）。

表 1 核桃仁的多酚类成分及其生理功能

Table 1 Polyphenolic constituents and bioactivity in walnut kernel

注：－.文献中未列出。下同。

1.1 黄酮类

核桃种皮中黄酮类化合物含量达15.23%～
17.33%[9]，主要有长寿花糖苷、槲皮素、芦丁、鞣花酸、桑色素、儿茶素、红景天苷等，其中以芦丁含量最高[11]。万政敏等[11]在核桃种皮中检测到8 种黄酮类化合物，其中芦丁和槲皮素含量分别为1.876‰和0.08‰，在无种皮的核桃仁中检测到7 种黄酮类物质，其中芦丁和槲皮素的含量分别为0.009‰和0.006‰。黄酮类化合物具有抗氧化、抗肿瘤、保护心血管、抗炎、抗衰老、降压、降血脂、镇咳、抗突变等多种良好的生理功能和药用价值。其中槲皮素具有祛痰、止咳、平喘、降低血压、增强毛细血管抵抗力、减少毛细血管脆性、扩张冠状动脉、抗氧化、抗癌等活性，具有抑制多种肿瘤细胞的生长、辅助降血糖等功效；芦丁具有维生素的作用，可以降低毛细血管异常通透性和脆性，作为高血压、脑溢血及动脉硬化的辅助治疗剂[11]。鞣花酸具有抗癌变、抗突变、抗菌、抗病毒、抗炎等功效[12]。核桃仁中的鞣花酸和多酚类物质能够抑制在体外培养的周边血液单细胞增殖和改变肿瘤细胞因子的产生[13]。长寿花糖苷对DPPH自由基的清除率达到31.14%[14]。魏平平等[15]研究发现红景天苷有降血清过氧化脂质（lipid peroxide，LPO）的趋势，能显著降低肝脏LPO的浓度
（P＜0.05），提高二倍体细胞中超氧化岐化酶活性，红景天苷对羟自由基和超氧阴离子自由基均有一定的清除作用，清除效率可达63.0%和75.8%，此外，红景天苷在体外能促进T细胞功能，进而促进细胞免疫（表1）。

1.2 酚酸类

采用高效液相色谱法检测到核桃仁种皮中含有17 种酚酸类成分，主要包括没食子酸、绿原酸、咖啡酸、对羟基苯甲酸、阿魏酸等，其中含量最高的是没食子酸，达到146.2 mg/100 g干样，最少的为阿魏酸，含量为6.1 mg/100 g干样[11]。现代药理学研究表明酚酸类物质具抗氧化、降血脂、抗菌消炎等广泛的生物活性[16]；其中绿原酸类化合物具有抗氧化性、抗病毒、抑菌、降脂、抗癌、抗艾滋病等多种生理活性，可作为先导化合物设计开发抗癌药物，对高血压、动脉硬化也具有一定的抑制作用[17]。同时，作为良好的抗氧化剂，绿原酸不仅应用于医药行业，在日用化工、食品等领域也有广泛的应用。张俏忻等[18]采用单细胞凝胶电泳研究发现咖啡酸、阿魏酸、香草酸对DNA有不同程度的保护作用。现已发现，阿魏酸至少具有以下功能：抗血小板凝集和血栓，清除亚硝酸盐、氧自由基、过氧化亚硝基，抗菌消炎、抗肿瘤、抗突变、增加免疫功能、增强人体精子活力和运动性等[19]。雷玲等[20]研究发现用焦性没食子酸作为杀虫活性物质鱼藤酮的抗氧化剂和光保护剂，可以阻止其降解，延长药效，且降解率与焦性没食子酸的用量成反比，焦性没食子酸很好地解决了鱼藤酮在环境中不稳定的问题。

2 已知核桃相关多酚对α-淀粉酶的作用

2.1 抑制作用

图 1 核桃相关多酚对α-淀粉酶抑制作用[21,28-33]

Fig.1 Inhibitory effect of walnut polyphenols on alpha-amylase[21, 28-33]

由图1可知，核桃相关多酚对α-淀粉酶的抑制率可达60%以上，这与许多研究得出的核桃相关多酚对α-淀粉酶具有抑制作用一致。

表 2 核桃相关多酚对α-淀粉酶的抑制作用及相互作用

Table 2 The inhibition and interaction of walnut polyphenols on
alpha-amylase

注：Ki.抑制常数；Kq.猝灭速率常数；Ksv.动态猝灭常数。

其中，IC50较好的是没食子酸、儿茶素、绿原酸，其次是咖啡酸和槲皮素（表2）。通过比较IC50可以得出，核桃相关多酚对α-淀粉酶的抑制作用大小为：没食子
酸＞儿茶素＞绿原酸＞槲皮素＞咖啡酸＞阿魏酸＞桑色素，而通过比较其抑制率则发现核桃相关多酚对α-淀粉酶的抑制作用大小为：没食子酸＞槲皮素＞桑色素＞绿原酸＞儿茶素＞阿魏酸。儿茶素的抑制率小于槲皮素、绿原酸和桑色素。

多酚对α-淀粉酶的作用主要是抑制作用，少数研究报道其具有激活作用。如张冬英等[29]采用碘-淀粉比色法发现没食子酸对α-淀粉酶有较强的抑制作用，在质量浓度为10 g/L时其抑制率达63.76%，而丁阳平等[27]利用同样的方法研究发现没食子酸能增强α-淀粉酶的活力，在质量浓度为2 g/L时其对酶活的增强率接近最大值，达到162%。然而，核桃相关多酚对α-淀粉酶的作用有不少空白尚需进一步研究，如香草酸、长寿花糖苷、红景天苷、对羟基苯甲酸、鞣花酸等对α-淀粉酶的作用尚未见报道。

2.2 协同作用

Adisakwattana等[34]研究发现含没食子酸17%～21%、儿茶酸12%～15%和槲皮素4.885%～6.553%的肉桂树皮提取物与阿卡波糖对淀粉酶的抑制具有协同作用。Li等[35]发现主要含芦丁的苦荞麦麸皮提取物和主要含槲皮素、异槲皮素和芦丁的苦荞麦麸皮提取水解物对淀粉酶都有抑制作用，但是水解物的抑制作用大于其原粗提物，这表明槲皮素、异槲皮素和芦丁之间可能存在协同作用，其具体作用机制尚未研究清楚。

2.3 相互作用

采用计算机模拟实验表明α-淀粉酶抑制剂主要占据酶与黄酮骨架B环上的羟基之间形成的氢键的对接位点[21]。采用荧光光谱和酶动力学研究槲皮素、异槲皮素和芦丁与α-淀粉酶之间的相互作用，表明与α-淀粉酶的结合常数（Ka）为异槲皮素＞槲皮素＞芦丁[35]。Xiao Jianbo等[36]采用荧光光谱法计算得到槲皮素、芦丁、没食子酸与α-淀粉酶的结合常数（Ka）分别为为0.275 4×105、2.138×105、0.177 8×105 L/mol，没食子酸、槲皮素、芦丁与α-淀粉酶的结合点数都为1[35]。如表2所示，芦丁、槲皮素对α-淀粉酶都有竞争性抑制作用，与儿茶素相同，对α-淀粉酶都为静态猝灭作用。而由没食子酸与奎宁酸酯化形成的复合物单宁对α-淀粉酶为非竞争性抑制作用[37]。芦丁、槲皮素和底物淀粉都能够同时与α-淀粉酶结合，形成酶-底物复合物，从而发挥其抑制活性[25]。

2.4 作用机制

Rohn等[38]揭示植物多酚抑制α-淀粉酶的机制在于多酚和酶相关活性位点的共价结合使酶结构上的自由氨基和硫醇家族以及色氨酸残基减少，氨基酸侧链的封闭抑制了酶的活性。采用配位体对接计算得出槲皮素对α-淀粉酶的抑制作用取决于多酚配体羟基中的氢键、结合位点的催化残基以及稳固与活性位点的相互作用的共轭π系统的构型[21]。与大多数糖化酶一样，α-淀粉酶主要利用活性位点羧酸来催化水解反应。其中Asp197、Glu233、Asp300是主要的催化残基，且研究认为多酚对α-淀粉酶的强抑制作用主要基于与这3 个氨基酸残基侧链的稳定结合[39-40]。动力学研究也强调催化结合位点上的Asp197、Glu233、Asp300以及配基中的羟基对其抑制活性的重要性（代替这些残基导致其抑制活性大幅度下降）[39]。
Lo Piparo等[21]将槲皮素（quercetin）A环6位羟基化得到六羟黄酮（quercetagetin），对α-淀粉酶的抑制率由82.1%上升到97.6%，抑制率提高15.8%。将山奈酚（kaempferol）B环3’位羟基化后得到槲皮素，将槲皮素B环5’位羟基化后得到杨梅酮（myricetin），其对
α-淀粉酶的抑制率也升高[32,41]。Sales等[42]研究表明绿原酸的IC50为（1.4±0.03）mmol/L，而异绿原酸的IC50为（0.56±0.027）mmol/L，这表明分子中羟基的位阻对其抑制率有很重要的影响，同时发现能形成醌类、内酯类或具有4-氧吡喃环结构的物质对α-淀粉酶具有抑制作用。这些研究表明黄酮3位羟基对其抑制活性具有重要意义，黄酮类的羟基化有利于提高其对淀粉酶的抑制活性[39]，多酚的抑制作用随着碳环上羟基数目的增多而增强[43]。

表 3 核桃相关多酚结构变化对其抑制α-淀粉酶的影响

Table 3 Effect of polyphenol structure change on the inhibition of α-amylase activity

黄酮类的糖基化降低抑制活性的效果取决于糖基的共轭位点及其类型。黄酮A、B、C环的羟基化显著影响其对α-淀粉酶的亲和力[36]。Kim等[44]研究表明单糖配苷形式的槲皮素（槲皮糖苷）对α-淀粉酶的抑制活性大于多糖配苷形式（芦丁）的抑制活性，Ye Xiaoping等[28]研究发现200 μg/mL的槲皮素对α-淀粉酶的抑制率为65.4%，强于相同剂量下芦丁对α-淀粉酶的抑制作用（抑制率为9.6%）。同时得到19 μg/mL的山奈酚对α-淀粉酶的抑制率为17.4%，而400 μg/mL的二葡糖苷山奈酚对α-淀粉酶的抑制率为8.8%，说明山奈酚对α-淀粉酶的抑制作用明显强于其糖基化形式，表明黄酮类物质的糖基化降低其对α-淀粉酶的抑制作用，并取决于共价结合位点以及糖配基的种类。黄酮糖基化后抑制作用降低的原因可能是分子量和极性的增大，分子转向了非平面结构，羟基被糖基取代后产生位阻现象，降低黄酮与α-淀粉酶的相互作用[36]。Hara等[45]研究发现没食子酰基儿茶素对α-淀粉酶的抑制能力大于非没食子酰基儿茶素；邻苯二酚儿茶素抑制能力大于邻苯三酚儿茶素；2,3-反式结构的儿茶素抑制活性大于2,3-顺式结构儿茶素。此外2,3-位不饱和键的存在与4-位羰基化共轭结构可以增强抑制能力。多酚A、B、C环上的所有原子形成一个sp2杂化结构，这使得所有原子形成一个大的共轭系统，猜测这个大的共轭系统骨架是这些化合物作用于α-淀粉酶所必需的[46]。

多酚的甲基化和甲氧基化会显著降低其对α-淀粉酶的抑制活性[34]。Lo Piparo等[21]将槲皮素（quercetin）7位甲氧基化得到鼠李黄素（rhamnetin），对α-淀粉酶的抑制率由82.1%下降到8.1%。氢键在黄酮类化合物结合到酶上起重要作用，黄酮类的甲基化和甲氧基化减少了氢键的供体与受体，降低了极性，增加了其渗透到蛋白质中色氨酸疏水区域然后包埋在折叠蛋白内部的能力[36]。C2-C3双键羟化及4位甲氧基化可降低其对酶的亲和力2～4 个数量级[47-48]。

3 结 语

综上所述，多酚黄酮的羟基化有利于提高其对α-淀粉酶的抑制作用，甲基化、甲氧基化、糖基化均降低其抑制作用。在淀粉和糖原消化中起重要作用的α-淀粉酶活性的抑制被认为是治疗碳水化合物吸收障碍疾病（如糖尿病和肥胖）的一种手段。抑制α-淀粉酶的活性可以延迟寡糖和二糖释放葡萄糖的速度，从而降低葡萄糖的吸收和餐后血糖水平。近年来膳食多酚对α-淀粉酶的抑制作用引起研究者的极大关注。目前，核桃相关多酚单体对α-淀粉酶作用的研究仍然处于起步阶段，许多组分尚无与该酶相互作用的报道。探索核桃相关多酚对α-淀粉酶的抑制作用可为糖尿病临床治疗和食物预防提供一定的理论基础，同时有利于了解核桃的营养生理功能，进而提高这一绿色资源的综合利用率。

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