低温花生粕蛋白制备及其饮料稳定性分析

王 莹1,2，王瑛瑶2,*，刘建学1，方 冰2，李菊芳2

（1.河南科技大学食品与生物工程学院，河南 洛阳 471023；2.国家粮食局科学研究院，北京 100037）

摘 要：以低温花生粕为原料，利用碱溶酸沉法提取花生分离蛋白，继而制备花生蛋白饮料，考察自制花生蛋白饮料的稳定性，并研究其氮溶指数、乳化活性及乳化稳定性等功能特性。结果表明，最佳工艺条件为pH 9.5、碱提温度55 ℃、料液比1∶11（g/mL）、提取时间2.5 h，此条件下花生分离蛋白提取率可达90.25%。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析显示，其中包含花生蛋白所有特征条带。花生蛋白饮料的平均粒径（D[4,3]）为4.31 μm，稳定性分析仪测出粒子动态变化斜率（Slope）值为26.66%/h。低温花生粕制备的花生蛋白饮料具有良好的稳定性，这为花生粕高值化利用提供了新方向。

关键词：低温花生粕；花生分离蛋白；花生蛋白饮料；粒径；稳定性

Preparation of Peanut Protein Isolate from Low-Temperature Peanut Meal, a Byproduct from Cold-Pressed Peanut Oil Production and Its Stability in Beverage

WANG Ying1,2, WANG Ying-yao2,*, LIU Jian-xue1, FANG Bing2, LI Ju-fang2

(1. College of Food and Bioengineering, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471023, China;

2. Academy of State Administration of Grain, Beijing 100037, China)

Abstract: Alkaline extraction and subsequent acid precipitation were employed to produce peanut protein isolate from low-temperature peanut meal as a byproduct from the production of cold-pressed peanut oil, and the preparation process was investigated. The results showed that when the extraction process was carried out at 55 ℃ for 2.5 h at an alkali pH of 9.5 with a solid-to-solvent ratio of 1:11 (g/mL), the maximum extraction yield of 90.25% was obtained. SDS-PAGE analysis indicated that electrophoretic bands of the peanut protein isolate were consistent with the typical bands of peanut proteins. Then, some functional properties including nitrogen solubility index (NSI), emulsifying activity and emulsion stability of this protein isolate were analyzed. Particle size analysis showed that the average particle size D[4,3] was 4.31 μm, and the slope for dynamic particle change, as checked by a stability analyzer, was 26.66%/h. The beverage prepared from the peanut protein isolate had a significant stability. This study may provide a new direction for the value-added utilization of peanut meal protein.

Key words: cold-pressed peanut cake; peanut protein isolate; peanut protein drink; particle size; stability

中图分类号：TS201.1 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）20-0026-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201420006

花生蛋白被公认为是继大豆蛋白之后，又一优质的食用蛋白资源。低温花生粕是花生冷榨提油后的副产物，蛋白质量分数达48%以上[1]。与传统热榨工艺不同，冷榨工艺制备的花生饼粕中蛋白质变性程度小，产品后续应用空间更大[2-4]。尤其是经过适度改性后的花生蛋白，其溶解性、持水性、乳化性及乳化稳定性等功能特性表现良好，具有非常优良的食品加工特性[5-8]。

食品应用体系中，加强花生蛋白在饮料中的应用研究，一方面可以发挥花生蛋白独特风味、抗营养因子含量低等特点。另一方面可以增加饮料体系的蛋白质含量提高饮料附加值。但传统的花生蛋白饮料大多采用花生仁直接打浆、调配添加剂等工艺制成，生产成本较高，且饮品中脂肪含量高影响产品的营养价值和口感[9-12]。顺应发展的需要与迫切性，一些以花生蛋白为原料制备富含蛋白质的饮料的相关研究已经出现，但是数量和研究深度有限，且存在制备的花生蛋白加工特性不理想、饮料体系稳定性有待提高等问题。

本实验优化了从低温花生粕中提取花生分离蛋白的工艺参数，并通过比较考察了自制花生蛋白的功能特性，研究了以提取到的分离蛋白为原料制备的花生蛋白饮料的颗粒粒径分布变化和稳定性变化，探讨以低温花生粕为原料制备的花生分离蛋白在饮料体系中应用的可行性。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

电泳试剂 美国Sigma和美国Amresco公司；其他试剂均为分析纯 国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

Rapid N CUBE型全自动快速定氮仪 德国元素分析系统公司；PowerPac HC型电泳仪 美国Bio-Bad公司；JM-LB60型胶体磨 温州市七星乳品设备厂；SRH60-70型均质机 上海申鹿均质机有限公司；2000MU型激光粒度仪 英国Malvern公司；LUMiSizer型全功能稳定性分析仪 德国LUM公司。

1.3 方法

1.3.1 花生分离蛋白的制备

低温花生粕经粉碎、过筛备用。利用碱溶酸沉法[13]提取花生分离蛋白。经2次碱提和1次酸沉步骤获得花生分离蛋白。蛋白提取工艺流程：

相对于蛋白提取全过程来说，第1次碱提步骤对蛋白提取率的贡献最大，所以针对这一步骤进行工艺优化，以花生分离蛋白的提取率为考察指标。影响提取率的因素主要有碱提温度、pH值、料液比、提取时间，在每个因素下分别取5 个梯度进行测定（表1）。在单因素试验确定的范围内，用L9（34）正交试验表对第1次碱提工艺进行优化，考察各因素对蛋白提取率的影响。花生粕、渣及分离蛋白干燥后称质量，并用全自动快速定氮仪测定蛋白质量。蛋白提取率计算如式（1）所示：

（1）

表 1 低温花生粕提取分离蛋白的因素水平

Table 1 Coded levels for variables affecting extraction of peanut meal protein

1.3.2 蛋白功能特性的测定

氮溶指数（nitrogen solubility index，NSI）的测定参考Govindaraju等[14]的方法。

（2）

乳化活性（emulsifying activity index，EAI）与乳化稳定性（emulsion stability index，ESI）的测定参考Wu等[15]的方法。

（3）

ESI/min=

A0×Δt

ΔA

（4）

式中：T=2.303（公式常数）；C为单位体积中蛋白质量浓度/（g/mL）；φ为乳状液中油的体积分数/%；L为比色皿光径（1cm）；Δt=10 min；ΔA=A0－A10。

1.3.3 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）

配制浓缩胶和分离胶质量分数分别为5%和12%。样品配制成适当质量浓度并经SDS处理，100 ℃煮沸5 min后，取20 μL点样。电压设定前30 min为80 V，后改为120 V至结束[16]。

1.3.4 功能性植物蛋白饮料的制备

将自制花生蛋白粉配制成一定质量浓度蛋白溶液。按一定量加入其他设定的组分（包括乳化剂、稳定剂、抗氧化剂等），并依据植物蛋白饮料功能和消费人群定位，添加功能性组分。经过高速剪切、胶体磨、高压均质（35 MPa、90 s）、高温灭菌（121 ℃、15 min）、无菌灌装后得到花生蛋白饮料。

1.3.5 粒径分析

用激光粒度分析仪测定蛋白饮料粒径分布。室温条件下，以水为分散介质，将被测样品（悬浮状溶液）加入到分散介质中进行测定。粒径大小用体积平均粒径D[4,3]表示[17-18]。

1.3.6 稳定性评价

利用全功能稳定性分析仪LUmisizer对花生蛋白饮料的稳定性进行分析[19]。仪器采用Stocks理论及离心原理来分析饮料的沉淀及悬浮状态。将装有样品的专用测试杯放入检测槽，设定运行条件：温度25 ℃、离心转速3 500 r/min、光散射系数1.00、扫描频率10 s/次、扫描次数200 次。通过SEPView 5.1软件对每个样品产生的光信号进行分析，计算得到斜率（Slope）值，用此值表征体系的稳定性。

2 结果与分析

2.1 花生分离蛋白制备工艺的优化及性质分析

由单因素试验得出的各因素较优结果如图1所示，在此基础上为了获得最佳工艺参数，以分离蛋白的提取率为指标，对影响花生分离蛋白提取率最重要的4 个因素设计四因素三水平正交试验。

图 1 单因素试验结果

Fig.1 Experimental results from the single factor design

表 2 低温花生粕提取分离蛋白正交试验设计及结果

Table 2 Orthogonal array design and results for extraction of
peanut meal protein

正交试验结果如表2所示，4 个因素的极差大小顺序为：A＞C＞B＞D，其中pH值对提取率的影响最大，而提取时间影响最小。根据表2 的结果确定花生分离蛋白的提取最佳工艺条件为A3C3B3D3，即在pH 9.5、碱提温度55 ℃、料液比1∶11、提取时间2.5 h条件下花生分离蛋白的提取率最高。对该工艺条件进行验证，得到的花生分离蛋白的提取率可达90.25%，与正交试验结果相当，证明所得优化结果是可靠的。

为了进一步明确最佳工艺条件对制备出的花生分离蛋白组分的影响，将自制的花生分离蛋白（laboratory peanut protein isolate，LPPI）与市售花生分离蛋白（market peanut protein isolate，MPPI）进行SDS-PAGE分析。由图2可知，LPPI具有伴花生球蛋白Ⅰ（61 kD）、花生球蛋白（19.7～47.5 kD）、伴花生球蛋白Ⅱ（14.3～18 kD）等所有特征条带，说明本研究工艺条件不会对花生分离蛋白的组分产生影响，花生分离蛋白在制备过程中各亚基组分未发生损失。在等质量浓度上样的条件下，与MPPI相比，LPPI的各条带颜色较深，表明LPPI各条带所对应的亚基含量较MPPI高，这可能是由于实验室制备得到的LPPI纯度较高。

a. LPPI；b. MPPI；c. Marker。

图 2 花生分离蛋白SDS-PAGE图谱

Fig.2 SDS-PAGE of peanut protein isolate

在确定最佳提取工艺的基础上，针对花生分离蛋白在饮料加工领域的实际应用，对自制花生分离蛋白的部分功能特性进行研究分析。选取LPPI、MPPI及市售大豆分离蛋白（market soy protein isolate，MSPI），比较分析了3 种分离蛋白的NSI、EAI、ESI。

表 3 花生分离蛋白的功能特性

Table 3 Functional properties of peanut protein isolate

如表3所示，LPPI的NSI要高于MPPI和MSPI，说明LPPI在水中的溶解能力较好，更适合应用于以水相为溶剂的蛋白饮料体系中。这可能因为低温花生粕所提取花生分离蛋白变性程度低且具有良好的溶解性。

本研究中制备的花生蛋白饮料是一个包括油水两相的复杂体系，因此蛋白质的乳化性能也是影响蛋白饮料稳定性的一个重要因素。蛋白质本身具有两亲性，其乳化活性及乳化稳定性的大小直接影响到溶液的稳定状态。由表3可以看出，MSPI具有最高乳化活性，MPPI和LPPI略低。根据Wu等[15]的方法可知单位蛋白溶液可以乳化的油越多乳化活性越高，因此LPPI单位蛋白能乳化的油相对较少，适合低脂体系的应用。但是，LPPI具有较高乳化稳定性，根据这些功能特性指标可以看出LPPI是合适的饮料制备原料。

2.2 自制花生蛋白饮料的稳定性评价

植物蛋白饮料是由多种成分组成的营养型饮料，是一个含脂肪和蛋白的热力学不稳定体系。在饮料的制作和贮藏过程中容易出现脂肪上浮、蛋白质变性、沉淀分层等不稳定现象。所以蛋白饮料的稳定性是评价饮料品质的关键指标，评价稳定性的方法有很多，例如，静置观察、黏度检测、离心观察、显微镜观察、粒径分布、电泳、Zeta电位、光谱分析等等。应根据不稳定现象产生的原因选择准确、快速、直观的方法评价蛋白饮料稳定性。

2.2.1 SDS-PAGE凝胶电泳分析

对自制及市售的花生蛋白饮料进行SDS-PAGE分析，测定各饮料的蛋白含量，以相同的蛋白质量浓度上样。如图3所示，饮料中蛋白（c、d道）与自制花生分离蛋白（a道）相比，伴花生球蛋白Ⅰ条带颜色变浅几乎消失；花生球蛋白的不同亚基含量发生显著变化，存在条带变浅、模糊等现象；伴花生球蛋白Ⅱ条带模糊。这些现象可能是因为在饮料制作过程中，机械力作用与高温高压灭菌使部分蛋白亚基变性或降解，从而使各组分质量浓度发生变化。也有研究显示[20]，花生球蛋白的耐热性优于伴花生球蛋白Ⅰ而不及伴花生球蛋白Ⅱ，这一结论与花生蛋白饮料中各花生蛋白亚基条带变化程度基本一致。另外，市售饮料蛋白电泳图谱中花生球蛋白和伴花生球蛋白Ⅱ的条带明显含量较低，可能是由于其加工工艺中包括酶解等环节，使得蛋白分子降解成分子质量较小的肽而在此电泳条件下无法显现。

a.LPPI；c.市售花生蛋白饮料；d.自制花生蛋白饮料；e.Marker。

图 3 花生蛋白饮料SDS-PAGE图谱

Fig.3 SDS-PAGE of peanut protein beverages

2.2.2 粒径分析

植物蛋白饮料体系复杂，包含蛋白质、脂肪、糖类等多种成分，几种物质之间相互作用共同维持体系稳定性。粒径分析是检测饮料体系稳定性的有效手段之一。对于植物蛋白饮料而言，溶液中的蛋白粒子粒径越大越容易产生聚集分层现象，破坏体系的稳定性。同时从营养价值方面考虑，蛋白粒子粒径越小其相应的蛋白质吸收率越高[21]。

为了考察本研究中饮料的稳定性，将新鲜制备的花生蛋白饮料与存放一个月后饮料中蛋白粒子粒径大小进行比较（图4）。由图4可知，新鲜制备花生蛋白饮料粒径主要分布在1.12～3.83 μm，平均粒径D[4,3]为4.31 μm。放置1 个月后，部分蛋白粒子微弱积聚，在9.75 μm左右产生一个小峰，平均粒径D[4,3]变为5.57 μm。一个月前后的粒径分布曲线变化差异较小，可以说明体系的稳定性保持良好。市售饮料产品分别在0.638 μm和6.417 μm有2 个粒径峰，D[4,3]为16.771 μm。常温放置一个月后，小粒径峰面积减小，向大粒径峰发生位移，D[4,3]为20.148 μm。由此看出，两种蛋白饮料各自在一个月内的粒径分布曲线差异性不大，表明两种饮料体系都比较稳定。

1.自制花生蛋白饮料；2.放置一个月后的自制花生蛋白饮料；3.市售花生蛋白饮料；4.放置一个月后的市售花生蛋白饮料。

图 4 自制花生蛋白饮料与市售产品粒径分析

Fig.4 Particle size analysis of LPPI and MPPI

将自制与市售蛋白饮料之间的粒径分布曲线进行比较分析，可明显看出自制蛋白饮料的粒径偏小，大多集中在1～3 μm。而市售产品粒径较大，主要分布在10 μm附近。这种现象产生的原因可能是原料及生产工艺不同，市售蛋白饮料以花生仁为原料直接打浆调配而成，具有天然的不易被破坏的蛋白-脂肪复合大颗粒；自制蛋白饮料是由提取出来的花生分离蛋白粉和添加剂调制而成，经过机械处理后体系中的颗粒普遍均一且粒径偏小。

2.2.3 稳定性分析

A.仪器测量原理；B.自制花生蛋白饮料空间与时间分离透射（消光）轮廓图；C.市售花生蛋白饮料空间与时间分离透射（消光）轮廓图；D.两种饮料的Slope值比较（a.自制花生蛋白饮料；b.市售花生蛋白饮料）。

图 5 花生蛋白饮料的稳定性分析

Fig.5 Stability analysis of peanut protein beverages

德国LUMi全功能稳定性分析仪采用Stocks理论及朗伯-比尔定律来分析乳状液的稳定性。分层、沉降、絮凝、聚合或相分离等过程的信息数据都可以通过连续的剖面图表征出来。仪器测量原理如图5A所示，待测液体在离心的同时，仪器发射近红外光对整个管体同步扫描，根据光的透过率得到被测液体在时间和空间上连续的分离透射（消光）轮廓图（图5B、C），可形象直观地看出被测体系的稳定性变化趋势。另外还可以用传输总透过率对时间作图得到的曲线Slope值（图5D），表示一定时间内光透过率的变化快慢，粒子动态变化能快速反映体系稳定性，Slope值越高，相转变速率越快，稳定性越差。反之，Slope值越低，稳定性越好。

实验中采用相同检测条件（同1.3.6节），以自制花生蛋白饮料和市售花生蛋白饮料为研究对象，进行稳定性的光学扫描分析，扫描图谱见图5B、C，图中110～130 mm为离心管液面至底部扫描区域。从图5不难看出，在设定扫描时间内，自制花生蛋白饮料（图5B）扫描全过程中标准透过率的变化幅度较低，而市售花生蛋白饮料（图5C）扫描全过程中标准透过率的变化幅度较大。表明自制饮料在离心速率为3 500 r/min条件下稳定性较好。另外，用饮料相转变速率也可比较溶液体系的稳定性，实验结果见图5D，Slope值大小为市售饮料（42.37%/h）＞自制饮料（26.66%/h）。综上说明自制花生蛋白饮料具有良好的稳定性。

3 结 论

在pH 9.5、碱提温度55 ℃、料液比1∶11（g/mL）、提取时间2.5 h条件下花生分离蛋白的提取率最高达90.25%，其功能特性与市售蛋白相近。SDS-PAGE分析显示，由低温花生粕蛋白制备的饮料含有花生蛋白所有的特征条带，并且蛋白亚基保留质量浓度高于市售饮料产品。自制饮料粒径偏小，同时稳定性分析Slope值为26.66%/h，相对较低。因此，由低温花生粕制备饮料产品具有良好稳定性。

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