明胶微球的制备及其对多酚的吸附效果

刘晓晓1，刘 彬1,2，开 拓1，张广峰1，杨 潇1，陈祥贵1,*

（1.西华大学生物工程学院，食品生物技术重点实验室，四川 成都 610039；2.好医生药业集团，四川 成都 610031）

摘 要：采用乳化法制备明胶微球，利用显微镜和扫描电镜进行形态表征，研究了明胶微球对不同种类多酚的吸附及解吸附作用，考察了明胶微球的重复使用率。结果表明：在pH 3.5、35 ℃条件下吸附120 min时，明胶微球对表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）、安石榴苷和原花青素表现出良好的吸附作用，而对绿原酸吸附能力弱。用蒸馏水80 ℃处理120 min，微球上吸附的多酚可较好地解吸附。当微球多酚质量比为5∶1时，除绿原酸外，其他多酚的吸附率约54%～78%、单位明胶微球多酚吸附值约107～156 μg/mg、解吸率约60%～75%。明胶微球重复利用5 次后对EGCG的吸附率和解吸率仍然可达55%以上，但重复利用8 次后微球吸附性能急剧下降。因此，明胶微球在食品中多酚的去除和回收中具有潜在的应用价值。

关键词：明胶微球；多酚；吸附；解吸附；重复利用

Preparation and of Gelatin Microspheres and Their Adsorption Capacity for Polyphenols

LIU Xiao-xiao1, LIU Bin1,2, KAI Tuo1, ZHANG Guang-feng1, YANG Xiao1, CHEN Xiang-gui1,*

(1. Key Laboratory of Food Biotechnology, School of Bioengineering, Xihua University, Chengdu 610039, China;

2. Good Doctor Pharmaceutical Group, Chengdu 610031, China)

Abstract: Gelatin microspheres were prepared by an emulsification technique and characterized with microscope and scanning electron microscope. The adsorption and desorption of various polyphenols by gelatin microspheres was investigated, and the reusability of the microspheres was also evaluated. The results showed that when the adsorption was carried out at 35 ℃ and pH 3.5 for 120 min, gelatin microspheres exhibited good adsorption efficiency for epigallocatechin gallate (EGCG), punicalagins and proanthocyanidins, but demonstrated a weak adsorption for chlorogenic acid. After being treated by distilled water at 80 ℃ for 120 min, the adsorbed polyphenols could be released effectively. When the mass ratio of polyphenols to microspheres was 5:1, the adsorption rates of the other polyphenols except chlorogenic acid were 54%–78% with the amount of polyphenols adsorbed by per unit mass of the microspheres being 107–156 μg/mg, and the desorption rates of the adsorbed polyphenols were 60%–75%. Moreover, the adsorption and desorption rates for EGCG remained at over 55% after fifth repeated reuse of the microspheres, but sharply declined after eighth reuse. This study reveals that the gelatin microspheres can be potentially applied to remove and recover polyphenols in foods.

Key words: gelatin microspheres; polyphenols; adsorption; desorption; reuse

中图分类号：TS201.2 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）20-0048-04

doi:10.7506/spkx1002-6630-201420010

多酚是一类广泛存在于水果、蔬菜中的多羟基类化合物，具有抗氧化、预防心脑血管疾病、抗癌等多种生物活性[1-4]。尽管多酚化合物具有保健作用，但它又是导致加工食品尤其是果汁、果醋果酒等产品出现褐变和浑浊的主要原因[5-8]。因此，在果汁加工过程中经常需要添加明胶除去果汁中的多酚，维持产品的感官品质[9-11]。但是，在液-液作用体系中，明胶和多酚只有在一定的比例范围内才能发生较强的相互作用形成沉淀，明胶过多或过少都不能充分地去除多酚[12]，而对不同产品中的多酚这个比例可能是不同的，这就给实际的生产实践带来不确定的因素。聚乙烯吡咯烷酮在除去食品多酚方面展示了良好的前景[13]，但也存在价格昂贵、不能回收利用等缺陷。树脂尤其是大孔树脂、壳聚糖等固相介质经常用于包括多酚在内天然产物的吸附分离[14-17]，也有活性炭、改性纤维等固相介质用于食品多酚去除的研究报道[18-19]。尽管明胶对多酚类物质存在良好的选择性，常用于食品多酚的去除，但国内外尚未见关于明胶类固相介质用于吸附和回收食品多酚的研究报道。为了克服传统方法的局限，本研究采用乳化法制备明胶微球，并进行形态表征，考察明胶微球对不同多酚的吸附作用，为食品中多酚的去除和回收提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

明胶为生化试剂，液体石蜡、司盘80、戊二醛、丙酮、柠檬酸、柠檬酸钠、酒石酸亚铁均为分析纯
成都市科龙化工试剂厂；表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）、安石榴苷、原花青素、绿原酸、没食子酸 成都曼斯特生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

UV-2600型紫外-可见分光光度计 日本岛津公司；TDL-408离心机 星科科技公司；电子分析天平 上海
良平仪器仪表有限公司；GSr-2恒温水浴锅 北京医疗设备厂；精密增力电动搅拌器、pHs-3C型精密数字式酸度计 上海雷磁仪器厂；KQ-100DE型超声波清
洗器 昆山市超声仪器有限公司；Eclipse Ti-S倒置荧光显微镜 日本尼康公司；DHG-9070A电热恒温鼓风干燥箱
上海齐欣科学仪器有限公司；S-3400电子扫描显微镜 日本日立公司；微量移液器 美国Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 多酚含量测定

采用酒石酸亚铁分光光度法测定多酚含量，参照GB/T
8313—2008《茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法》中茶多酚的测定方法[20]。

1.3.2 明胶微球的制备与形态表征

1.3.2.1 微球的制备

微球的制备参考文献[21-25]，精密量取30 mL液体石蜡于250 mL锥形瓶中，加入450 μL 0.05 g/mL司盘80，搅拌；水浴加热至55～60 ℃，加入10 mL
0.05 g/mL明胶溶液，60 ℃条件下乳化10 min。乳化结束后，冰浴，使温度降至10 ℃以下，加入50 μL质量分数50%的戊二醛，撤去冰浴，固化2 h，用丙酮洗3～4 次后，将制得的微球浸于10 mL丙酮中，4 ℃条件下放置一段时间，滤去丙酮，晾干即得。

1.3.2.2 微球的形态表征

制得微球样品后，取少量在载玻片上，用蒸馏水固定后，放在倒置显微镜下观察微球形态，测定微球直径并拍照，得到微球光学照片。再取少量明胶微球粉末黏在双面导电胶上，在真空下喷金3 min（根据微球的含水量确定时间），在扫描电子显微镜下观察其形态，测定微球直径，拍照，得到微球电子扫描照片。

1.3.3 明胶微球的静态吸附

1.3.3.1 微球多酚质量比对吸附的影响

采用pH 3.5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（0.1 mol/L）将不同种类的多酚（EGCG、安石榴苷、绿原酸、原花青素）分别配制成0.88 g/L的多酚溶液，取多酚溶液10 mL，按照不同的微球多酚质量比（0.5∶1、1∶1、5∶1、25∶1、50∶1）分别加入不同质量的明胶微球，混匀。于35 ℃恒温水浴锅中吸附120 min。2 000 r/min离心10 min，取上清液，测定多酚含量。以浸泡相同质量明胶微球的pH 3.5磷酸缓冲液为空白对照，计算吸附率。吸附率和吸附值分别用式（1）、（2）计算。

（1）

式中：C1为吸附前多酚溶液质量浓度/（mg/mL） ；C2为吸附后离心上清液中多酚质量浓度/（mg/mL）。

（2）

式中：x为单位明胶微球吸附值/（μg/mg）；X为明胶微球吸附值（吸附前后溶液中多酚质量的差值）/μg；m为明胶微球质量/mg。

1.3.3.2 吸附时间对吸附的影响

在10 mL 0.88 g/L的不同多酚溶液中加入44 mg明胶微球，混匀。设置0、5、15、30、45、60、90、120、150、180、210、240 min的时间梯度，35 ℃条件下发生吸附作用，2 000 r/min离心10 min，取上清液测多酚含量。

1.3.3.3 吸附温度对吸附的影响

在10 mL 0.88 g/L的不同多酚溶液中加入44 mg明胶微球，混匀。设置25、30、35、40、45、50、55 ℃的温度梯度，静态吸附120 min，2 000 r/min离心10min，取上清液测定多酚含量。

1.3.4 明胶微球的静态解吸

取1.3.3.1节中与不同多酚发生吸附的明胶微球，向其中均加入10 mL蒸馏水，于80 ℃恒温水浴锅中作用120 min。2 000 r/min离心10 min，取上清液，测定多酚含量。以蒸馏水浸泡、质量相同未发生相同吸附的明胶微球为空白对照，如式（3）所示计算解吸率。

（3）

式中：C1为吸附前多酚质量浓度/（mg/mL）；C2为吸附后上清液多酚质量浓度/（mg/mL）；C3为解吸后多酚质量浓度/（mg/mL）。

1.3.5 明胶微球的重复利用

在10 mL 0.88 g/L的EGCG溶液中加入44 mg明胶微球，混匀，35 ℃静态吸附120 min，2 000 r/min离心10 min，取上清液，测定多酚含量。取出明胶微球，向其中加入10 mL蒸馏水，混匀。80 ℃静态解吸120 min，2 000 r/min离心10 min，取上清液，测定多酚含量。对明胶微球如此重复利用10 次。

2 结果与分析

2.1 明胶微球的形态表征

a

b

a.倒置显微镜照片；b.扫描电子显微镜照片。

图 1 明胶微球的形态表征

Fig.1 Microscopic observations of gelatin microspheres

根据1.3.2.1节方法制备明胶微球，用显微镜进行观察，同时对制得的微球用扫描电镜作形态表征。图1a可见，微球基本呈球状，偶有不规则形状，大小不很均匀，但直径均在微米级水平，细小微球趋于聚集。电镜扫描观察表明（图1b），微球形态表面光滑，表明制备质量较好，可用于进一步的实验中。

2.2 明胶微球静态吸附

2.2.1 微球多酚质量比对吸附的影响

表 1 微球多酚质量比对多酚吸附的影响

Table 1 Adsorption of gelatin microspheres for polyphenols with different mass ratios

由表1可知，随着质量比的提高，微球对多酚的吸附率逐渐提高。微球对EGCG、安石榴苷、原花青素和绿原酸都有一定的吸附作用。其中，微球对安石榴苷的吸附作用最大，对绿原酸的吸附作用较小。当质量比达到5∶1时，微球对EGCG、安石榴苷和原花青素的吸附率均达到50%以上。当质量比达到25∶1时，微球对EGCG、安石榴苷和原花青素微球的吸附率可达到90%左右。当质量比超过25∶1后，多酚吸附率增加速率变缓。

从单位明胶微球吸附值分析，当质量比为1∶1时，单位明胶微球吸附的多酚量最大，其中安石榴苷达到488.6 μg/mg；随着质量比的增加，单位明胶微球吸附的多酚量迅速下降，但当质量比为5∶1时明胶微球对EGCG、安石榴苷、原花青素的单位吸附值仍然维持在较高水平（大于100 μg/mg）。

EGCG、安石榴苷、原花青素和绿原酸相对分子质量分别为458.38、1084.72、594.52、354.31。多酚相对分子质量越大，被明胶微球吸附越容易，这与明胶与多酚在液相相互作用的趋势一致。

2.2.2 吸附时间对多酚吸附的影响

图 2 残留多酚质量浓度随吸附时间的变化关系图

Fig.2 Residual concentration of polyphenols as a function of adsorption time

由图2可以看出，随着吸附时间的延长，溶液中残留多酚质量浓度逐渐降低，但绿原酸的变化不明显。对于EGCG、安石榴苷、原花青素3 种多酚，在0～60 min时，多酚质量浓度变化速率较快；在60～120 min时，多酚质量浓度变化速率减小。当吸附时间超过120 min后，残留的EGCG质量浓度变化趋缓，表明此时微球对多酚的吸附已近饱和。

2.2.3 吸附温度对多酚吸附的影响

图 3 残留的多酚质量浓度随吸附温度的变化关系图

Fig.3 Residual concentration of polyphenols as a function of adsorption temperature

图3结果表明，当吸附温度为25～55 ℃时，溶液中残留多酚质量浓度呈先下降后上升的趋势，但变化都不很显著，其中绿原酸质量浓度变化最小。在35～45 ℃范围内，残留的安石榴苷质量浓度变化不大。温度过低不利于分子的扩散和碰撞，从而在既定的时间内吸附量不高，温度过高多酚分子的运动加剧，导致解吸附。故可选35 ℃作为微球吸附多酚的最佳温度。

2.3 明胶微球多酚的解吸附

表 2 明胶微球多酚的解吸

Table 2 Desorption of gelatin microspheres for polyphenols

表2数据表明，随着微球多酚质量比的升高，微球上吸附多酚的解吸率下降。当质量比为0.5∶1时，明胶微球吸附的多酚几乎可100%解吸，当质量比为1∶1时，明胶微球吸附的多酚解吸率可达90%左右，当质量比为5∶1时，明胶微球吸附多酚解吸率约为60%～75%。当质量比进一步提高，解吸率迅速下降。因此，微球多酚质量比对解吸率具有重要影响，其原因是质量比越大，明胶微球上的多酚结合位点越多，多酚结合更紧密，因此也就更难解离。

2.4 明胶微球的重复利用

图 4 重复利用次数与吸附/解吸率的关系

Fig.4 Effect of reuse on adsorption and desorption ratee

图4结果表明，明胶微球对多酚的吸附率随着明胶微球利用次数的增加呈先增大后减小的趋势。当明胶微球被第4次利用时，吸附率达到最大值，被利用次数增大，吸附率开始下降。在利用次数为1～8时，明胶微球对多酚的吸附率均在40%以上，最高可达72.6%。解吸率最高可达62.5%。明胶微球第5次利用时，其吸附率为59.1%，解吸率为57.7%；第6次利用时，其吸附率为52.4%，解吸率为51.3%。第8次利用后，明胶微球吸附性能显著下降，但解吸率基本稳定。随着重复利用次数增加，微球的结构逐渐破坏，导致吸附性能下降，但微球上还残留部分未解吸的多酚，可在后续过程中逐渐释放出来，因此使得解吸率能保持相对稳定。

3 结 论

通过吸附实验发现，明胶微球对EGCG、安石榴苷和原花青素表现出良好的吸附作用，而对绿原酸吸附能力较弱。微球上被吸附的多酚可较好地解吸附。

微球多酚质量比对多酚的吸附和解吸附有显著影响，随着微球多酚质量比的升高，多酚吸附率升高而解吸率下降。当质量比为1∶1时，单位明胶微球吸附的多酚量最大。当质量比为5∶1时，除绿原酸外，其他多酚的吸附率约54%～78%、单位明胶微球多酚吸附值约107～156 μg/mg、解吸率约60%～75%。

采用EGCG考察了微球多酚质量比为5∶1时明胶微球的重复利用性能，结果表明重复利用5 次后多酚吸附率和解吸率仍然可达55%以上，但重复利用8 次后微球吸附性能急剧下降。本研究表明明胶微球在食品中多酚的去除和回收中具有潜在的应用价值。

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