绿原酸纳米脂质体制备与抑菌性分析

徐贤柱，魏 允，饶 华，王曼莹*

（1.江西亚热带植物资源保护与利用重点实验室，江西 南昌 330022；2.江西师范大学生命科学学院，江西 南昌 330022）

摘 要：目的：研究绿原酸纳米脂质体制备及其抑菌性。方法：采用薄膜超声法制备绿原酸纳米脂质体，并用扫描电镜和粒度仪分析测定其形貌及粒径，考察膜材比、药脂比及超声时间对包封率的影响，最后对其体外稳定性和抑菌能力进行评价。结果：胆固醇与卵磷脂质量比1∶8、绿原酸与膜材质量比1∶10、超声时间15 min所制备的绿原酸纳米脂质体呈椭圆形，形态规整，粒径在110 nm左右，分散性良好，包封率和载药量最高分别达到87.5%和36%；紫外测试表明绿原酸被成功包覆在脂质体中；体外缓释实验表明，在24 h和14 d中绿原酸纳米脂质体均释放稳定；在抑菌实验中，绿原酸纳米脂质体与绿原酸和四环素相比具有更持久的抑菌能力。结论：采用薄膜超声法制备的绿原酸纳米脂质体具有很好的形貌和分散性能，也具有很好持续抑菌能力。

关键词：绿原酸；脂质体；制备；抑菌

Preparation and Antibacterial Effect of Chlorogenic Acid Nanoliposome

XU Xian-zhu, WEI Yun, RAO Hua, WANG Man-ying*

(1. Jiangxi Provincial Key Laboratory of Protection and Utilization of Subtropical Plant Resources, Nanchang 330022, China;

2. College of Life Sciences, Jiangxi Normal University, Nanchang 330022, China)

Abstract: Objective: To investigate the preparation and antibacterial effect of chlorogenic acid (CA) nanoliposome. Methods: CA nanoliposomes were prepared by film-ultrasonic dispersion method and the products were characterized with scanning electron microscopy (SEM) and particle size analyzer. The effects of cholesterol/lecithin mass ratio, CA/film (lecithin + cholesterol) mass ratio and ultrasonication time on the encapsulation efficiency of liposomes were investigated. Finally, the stability and the bacteriostasis ability of the prepared liposomes were evaluated. Results: Oval-shaped liposomes were prepared by ultrasonication for 15 min at a cholesterol/lecithin mass ratio of 1:8 and a CA/film ratio of 1:10, which showed regular morphology, a particle size of approximately 110 nm in diameter, good dispersity, an encapsulation efficiency of up to 87.5%, and a drug loading of up to 36%. UV spectroscopy showed that CA was encapsulated successfully into nanoliposomes. In vitro test showed that the drug could be sustained-released from liposomes without a burst release and with stability for 24 h and 14 days. Comparing with CA and tetracycline, the nanoliposomes had better bacteriostasis ability. Conclusion: CA nanoliposomes prepared by film-ultrasonic dispersion method have a regular shape, good dispersion ability and persistent antibacterial ability.

Key words: chlorogenic acid; nanoliposomes; preparation; antibacterial activity

中图分类号：TS201.2 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）20-0062-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201420013

绿原酸（chlorogenic acid，CA）是从杜仲、金银花和蒲公英等植物中提取出来的一种活性物质，具有较多的生物活性，如抗菌、抗病毒、抗肿瘤、降血压、清除自由基等，是保健品、食品、药品、化妆品等的重要原料[1-6]。由于绿原酸难溶于水，在肠道中吸收差，所以应用过程中受到很大的阻碍。绿原酸是由咖啡酸与奎尼酸形成的酯，其分子结构中有酯键、不饱和双键及多元酚3 个不稳定部分，在体内易被蛋白质灭活而失去活性。

研究表明，绿原酸作为一种抗氧化剂，可以有效保护皮肤免受紫外线的伤害，绿原酸-磷脂复合物可以显著延长保护时间达4 h以上[7]。

脂质体包裹的药物可以有效地提高其稳定性和在体内的吸收。脂质体[8-10]是由胆固醇和卵磷脂形成的一种微型腔室，具有生物相溶性好、无毒、无免疫原性等优点，修饰后，能增强靶向性，提高药物的疗效，更重要的是它还具有缓释的功能，对脂溶性药物包封性好，改变传统给药途径。关于绿原酸脂质体制备的研究还不多见，本研究采用薄膜分散超声方法制备CA纳米脂质体，考察膜材比（m（胆固醇）∶m（卵磷脂））、药脂比（m（CA）∶m（膜材））、超声时间对其包封率的影响，并对CA纳米脂质体在体外的稳定性和抑菌效果进行评价，对其形貌和粒径进行表征。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

绿原酸（色谱纯，纯度＞99%） 湖南远航生物科技有限公司；大豆卵磷脂 上海蓝季科技有限公司；胆固醇 上海伯奥生物科技有限公司；金黄色葡萄球菌、大肠杆菌 江西师范大学生命学院微生物实验室；四环素 上海生工生物工程有限公司；无水乙醇、乙醚、氯仿、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠均为市售分析纯。

1.2 仪器与设备

DelsaNano S粒度仪 美国贝克曼公司；S-3400N扫描电子显微镜、U-331紫外-可见光分光光度计 日本Hitachi公司；UV-vis8453紫外吸收光谱仪 美国安捷伦公司；旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；超声波清
洗器 昆山超声仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 CA纳米脂质体的制备

采用薄膜分散超声法[11]，按比例精确称取大豆卵磷脂、胆固醇，加入15 mL氯仿溶解，120 r/min转速、35 ℃旋转减压蒸发除去氯仿。加入乙醇溶解的CA溶液，120 r/min转速、50 ℃旋转蒸发除去乙醇。加入pH 7.2的磷酸缓冲液10 mL和适量玻璃珠，120 r/min转速、37 ℃旋转，待溶液浑浊，超声，得CA纳米脂质体。

1.3.2 CA的紫外检测

采用紫外-可见分光光度法在327 nm波长处测定[12]。

1.3.3 包封率和载药量的测定[13-14]

称取100 mg CA溶于乙醇，按上述方法制备CA纳米脂质体。5 000 r/min转速离心，去上清。用乙醇重悬脂质体，5 000 r/min转速离心，去上清，重复两次洗涤去除未包封的CA。加入质量分数1%聚乙二醇单辛基苯基醚（Triton）溶液0.5 mL使脂质体破损溶出CA，并用PBS液定容，采用紫外-可见光分光光度计测定脂质体中CA的质量，膜材质量为卵磷脂与胆固醇质量总和。包封率及载药量的计算如式（1）、（2）所示。

（1）

（2）

式中：P1为原料CA质量/mg；P2为脂质体中CA质量/mg；P3为膜材质量/mg。

1.3.4 不同条件对包封率及载药量的影响

固定药脂比1∶10、超声时间15min，考察不同膜材比（1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12）对CA纳米脂质体包封率及载药量的影响；固定膜材比1∶8、超声时间15 min，考察不同药脂比（1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12）对CA纳米脂质体包封率及载药量的影响；固定膜材比1∶8、药脂比为1∶10，考察不同超声时间（0、5、10、15、20、25 min）对CA纳米脂质体包封率及载药量的影响。

1.3.5 脂质体形貌及粒径测定[15]

CA纳米脂质体分散在无水乙醇中，毛细管取少量滴于硅片表面并通过导电胶粘贴在载物台上，乙醇挥发干后喷金，最后用扫描电子显微镜观察脂质体的形貌；在不同条件下分别制备5 个样本，用激光散射粒径仪测定脂质体的平均粒径和Zeta电位，折射指数1.33、波长633 nm、入射与散射光束夹角为90º。

1.3.6 脂质体稳定性测定[16]

将CA纳米脂质体分散在生理盐水中，一份在37 ℃条件下200 r/min转速搅拌，分别在0.5、1、2、4、8、12、24 h测定其体外释放率；另一份在4 ℃存放，分别在第2、4、6、8、10、12、14 d测定体外释放率。

1.3.7 抑菌实验[17-18]

将金黄色葡萄球菌和大肠杆菌分别接入装培养基斜面上，37 ℃培养24 h，使菌种活化，再将活化好的菌接种到平板中，37 ℃培养24 h。用生理盐水将细菌从平板洗脱制成菌悬液，菌落数调至1×108 CFU/ mL。

用打孔器将滤纸打成6 mm的小片并灭菌，将0.2 mL 1 mg/mL的CA溶液、CA纳米脂质体、空白脂质体、四环素分别滴加于滤纸片上，控制CA纳米脂质体中的CA含量为0.2 mg。

分别向培养基表面涂布0.2 mL菌悬液，再将滴加CA溶液、CA纳米脂质体、空白脂质体的滤纸片贴于培养基表面，每个皿贴5 片，用四环素纸片做对照，37 ℃培养24、36、48、60、72、84、96 h后测定抑菌圈直径。

2 结果与分析

2.1 不同因素对CA纳米脂质体包封率的影响

包封率和膜材比存在较大的关系，卵磷脂在成膜过程中需要胆固醇调节其通透性，当胆固醇含量过高时，会引起卵磷脂成膜不稳定，从而降低包封率；当胆固醇含量过低时，膜的通透性下降，也会降低脂质体的包封率。

从图1a可见，CA纳米脂质体包封率随着卵磷脂质量的增加而增大，当膜材比达到1∶8时，包封率达到最高87.5%。CA纳米脂质体包封率不会随药脂比的改变而存在显著性差异。

如图1b所示，超声时间对CA纳米脂质体的包封率有显著影响，当超声时间在15 min时，包封率达到最大值。随着超声时间延长有一部分脂质体会破裂导致包封率下降。

图 1 膜材比和药脂比（a）及超声时间（b）对CA纳米脂质体
包封率的影响

Fig.1 Effect of cholesterol/lecithin mass ratio and CA/film mass ratio (a), and ultrasonication time (b) on the encapsulation efficiency of liposomes

2.2 不同因素对CA纳米脂质体载药量的影响

图 2 膜材比与药脂比（a）及超声时间（b）对CA纳米脂质体

载药量的影响

Fig.2 Effect of cholesterol/lecithin mass ratio and CA/film mass ratio (a), and ultrasonication time (b) on the drug loading of liposomes

载药量直接关系到纳米脂质体的应用前景。如图2a所示，药脂比和膜材比对CA纳米脂质体载药量的影响不显著；随着超声时间延长载药量会缓慢上升，15 min达到最大载药量为36%，当超声到20 min时载药量出现显著下降，分析其析因可能是超声时间延长导致脂质体破裂，致使载药量下降明显。

2.3 CA纳米脂质体的形貌、粒径和Zeta电位

表 1 CA纳米脂质体粒径和Zeta电位

Table 1 Particle size and zeta potential of CA liposomes

采用膜材比1∶8、药脂比1∶10、超声时间15 min条件制备CA纳米脂质体，用于粒径和Zeta电位测定。从表1可以看出，CA纳米脂质体粒径与膜材比有较大的关系，当胆固醇与卵磷脂质量比在1∶8之后时，粒径可以达到110 nm左右，CA纳米脂质体粒径随着胆固醇在膜材中比例减小而变小。在药脂比中，当CA与膜材质量比为1∶2时形成的CA纳米脂质体粒径较大，随着CA比例下降到1∶4以下，其粒径的变化没有显著性。

图 3 CA纳米脂质体粒径图与扫描电镜图

Fig.3 Particle size distribution and SEM of CA liposomes

如图3所示，CA纳米脂质体形貌较好、大小较均一，从粒度分布图中可以看出CA纳米脂质体粒径主要为100～150 nm，粒径分布较窄；从扫描电镜放大2万 倍和20万 倍时看到CA纳米脂质体成椭圆形，大小均匀，分散度也较好。

2.4 紫外吸收光谱分析

采用膜材比1∶8、药脂比1∶10、超声时间15 min条件制备CA纳米脂质体，用于紫外测定。采用紫外吸收光谱仪分别测定紫外吸收光谱，其结果如图4所示。CA的最大吸收峰位于327 nm波长处，在空白脂质体中未观测到该位置有紫外吸收，而CA纳米脂质体中观察到该位置有明显吸收，这说明了CA被成功地包覆在脂质体中。

图 4 紫外测试图

Fig.4 UV spectra

2.5 CA纳米脂质体稳定性

在膜材比1∶8、药脂比1∶10、超声时间15 min条件制备CA纳米脂质体，将其置于生理盐水中，在37 ℃、200 r/min转速搅拌和4 ℃条件下分别测定其体外释放率。图5a为24 h内测定，可以看出，在前1 h内释放率上升较快，随后变缓，在24 h内总释放率在7.2%。图5b为14 d内测定结果，可以看出，4 d内释放率上升较为显著，随着时间延长，释放率也开始下降，14 d内总释放率没有超过2.8%。可见CA纳米脂质体性质比较稳定，体外释放速率较慢。

图 5 24 h（a）和14 d（b）CA纳米脂质体体外释放率

Fig.5 Stability of CA liposomes in 24 h (a) and 14 days (b)

2.6 抑菌性分析

以四环素为对照，使用膜材比1∶8、药脂比1∶10、超声时间15 min条件制备的CA纳米脂质体，分别对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌做抑制实验，比较对两种细菌的抑制作用。

图 6 对金黄色葡萄球菌（a）和大肠杆菌（b）的抑菌作用

Fig.6 Inhibitory effect of CA liposomes on Staphylicoccus aureus and Escherichia coli

从图6可以看出，CA抑菌效果比较显著，与四环素相比无明显差异，抑菌圈直径均大于15 mm，空白脂质体对两种细菌都没有明显的抑制效果。

CA纳米脂质体有明显的抑菌效果，在24 h内与CA、四环素相比有明显的降低，但在48 h后，CA和四环素的抑菌作用下降较为显著，CA纳米脂质体抑菌作用下降缓慢，抑菌效果明显更强。分析其原因可能是CA、四环素在培养基上随着时间延长其质量浓度下降导致抑菌作用下降，而CA纳米脂质体具有缓释作用，随着时间的延长缓释效果显现，所以到后期的抑菌效果会明显更强。

3 结 论

绿原酸是一种难溶于水、易溶于乙醇的活性物质，采用脂质体包裹可以使其均匀的分散于水溶液中。纳米脂质体的制备方法很多，通过不同方法和条件控制包封率、粒径、缓释效果等指标。同本研究使用的方法相比，冷冻干燥法制备的脂质体在贮存过程中易发生聚集和药物渗漏等，脂质体的稳定性和缓释效果差；冻融法制备脂质体在反复冻融的过程中产生的冰晶容易破损脂质体膜，影响包封率；复乳法制备的脂质体粒径较大，难以达到纳米级；反相蒸发法制备的脂质体体积较大，而且更适用于水溶性药物，所以没有选择此方法[19]。对纳米脂质体进行修饰是未来靶向控释给药研究的方向[20]。

本实验采用薄膜分散超声法制备的CA纳米脂质体有较好的分散度，粒径控制在110 nm左右，经过扫描电镜观察，脂质体成椭圆形；经紫外光谱吸收测定，CA和CA纳米脂质体在327 nm波长处有一个最大吸收峰，而空白脂质体在此处没有，说明CA已经成功包被其中；包封率和载药量分别达到87.5%和36%。在体外37 ℃24 h和4 ℃14 d的实验中可以看出，CA纳米脂质体具有较好的稳定性，其释放率都不超过10%，同时也具备了缓释功能。

在抑菌实验中，CA和CA纳米脂质体都有较好的抑菌效果，CA纳米脂质体的抑菌能力略低于CA，分析其原因可能是CA纳米脂质体游离出CA的速率会比CA慢，导致其开始时抑菌能力较CA低，但是随着CA纳米脂质体中CA缓慢释放，其抑菌时间会比CA长，这是因为脂质体具有缓释的功能。

CA是一种难溶于水的活性物质，在使用过程中通常被这一性质所阻碍，通过脂质体包被，为CA的应用提供新的途径。

参考文献：

[1] SHI Haitao, DONG Lei, JIANG Jiong, et al. Chlorogenic acid reduces liver inflammation and fibrosis through inhibition of toll-like receptor 4 signaling pathway[J]. Toxicology, 2013, 303(1): 107-114.

[2] 刘英, 王之盛, 周安国, 等. 橙皮苷和绿原酸的体内外抗氧化效应研究[J]. 食品科学, 2009, 30(23): 196-199.

[3] GAO Ruifeng, FU Yunhe, WEI Zhengkai, et al. Chlorogenic acid attenuates lipopolysaccharide-induced mice mastitis by suppressing TLR4-mediated NF-κB signaling pathway[J]. European Journal of Pharmacology, 2014, 729(4): 54-58.

[4] 彭密军, 彭胜, 吴吉林, 等. 杜仲素抗氧化活性研究[J]. 食品科学, 2010, 31(19): 84-86.

[5] YUKI S, SHIROU I, TOSHIMITSU K, et al. In vitro and in vivo antioxidant properties of chlorogenic acid and caffeic acid[J]. International Journal of Pharmaceutics, 2011, 403(1): 136-138.

[6] 李旭, 刘停, 陈时建, 等. 杜仲叶绿原酸提取工艺优化及对自发性高血压大鼠的降压作用[J]. 食品科学, 2013, 34(14): 30-34.

[7] BHATTACHARYYA S, MAJHI S, SAHA B P, et al. Chlorogenic acid-phospholipid complex improve protection against UVA induced oxidative stress[J]. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology, 2014, 130(1): 293-298.

[8] YAN Fei, LI Lu, DENG Zhiting, et al. Paclitaxel-liposome-microbubble complexes as ultrasound-triggered therapeutic drug delivery carriers[J]. Journal of Controlled Release, 2013, 166(3): 246-255.

[9] ZHANG Junlin, WU Jin, WANG Xueqing, et al. A novel octreotide modified lipid vesical improved the anticancer efficacy of doxorubicin in somatostatin receptor 2 positive tumor models[J]. Molecular Pharmaceutics, 2010, 7(4): 1159-1168.

[10] LI Shihong, GOINS B, ZHANG Lujun, et al. Novel multifunctional theranostic liposome drug delivery system: construction, characterization, and multimodality MR, near-infrared fluorescent, and nuclear imaging[J]. Bioconjugate Chemistry, 2012, 23(6): 1322-1332.

[11] SHAIKH I M, TAN K B, CHAUDHURY A, et al. Liposome co-encapsulation of synergistic combination of irinotecan and doxorubicin for the treatment of intraperitoneally grown ovarian tumor xenograft[J]. Journal of Controlled Release, 2013, 172(3): 852-861.

[12] 梁萱, 赵建军, 梁永锋. 人工种植金银花中绿原酸含量测定和提取工艺研究[J]. 西北药学杂志, 2013, 28(3): 228-230.

[13] 袁菊, 张亚宁, 范云鹏, 等. 响应面分析法优化蜂胶黄酮脂质体制备工艺[J]. 食品科学, 2012, 33(20): 16-20.

[14] 凌家俊, 古锦辉, 谢毅, 等. 羟基喜树碱磁性脂质体的制备及其靶向性特征试验[J]. 中国实验方剂学杂志, 2012, 18(16): 19-23.

[15] 赵波, 范俣辰, 王学清, 等. iRGD修饰的阿霉素主动靶向脂质体的细胞毒与抗肿瘤效果评价[J]. 药学学报, 2013, 48(3): 417-422.

[16] 李翔, 张婧, 王东凯, 等. 叶酸受体靶向两亲性嵌段共聚物修饰多烯紫杉醇脂质体的制备及体外性质考察[J]. 药学学报, 2012, 47(9): 1219-1226.

[17] 贾梅珍, 冯昕. 蒲公英中绿原酸的提取及抑菌活性的初步研究[J]. 食品工业, 2013, 34(10): 14-17.

[18] ZHAO Mouming, WANG Haiyan, YANG Bao, et al. Identification of cyclodextrin inclusion complex of chlorogenic acid and its antimicrobial activity[J]. Food Chemistry, 2010, 120(4): 1138-1142.

[19] 郑杭生, 黄绳武, 李范珠, 等. 盐酸青藤碱脂质体的制备工艺研究[J]. 中草药, 2013, 44(4): 408-413.

[20] PETRALITO S, SPERA R, PACELLI S, et al. Design and development of PEG-DMA gel-in-liposomes as a new tool for drug delivery[J]. Reactive and Functional Polymers, 2014, 77(4): 30-38.