PCR-DGGE技术分析不同包装条件下鱼肉表面优势菌的菌群变化

涂宗财1,2,马 达1,王 辉1,石 燕1,沙小梅1,黄小琴2

(1.南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室,江西 南昌 330047;

2.江西师范大学 功能有机小分子教育部重点实验室,江西 南昌 330022)

 

摘 要采用聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳(polymerase chain reaction-deformation gradient gel electrophoresis analysis,PCR-DGGE)技术研究3 种包装(空气、真空、气调)结合钴60辐照技术对鱼肉表面优势菌菌群的影响,分别选择6 种辐照剂量(0、2、4、6、8、10 kGy)照射4 ℃贮藏18 d后的鱼肉表面优势腐败菌群进行研究。方法:采集第18天不同包装不同剂量的草鱼肉样品,洗脱鱼肉表面菌;提取DNA,扩增16S rDNA的V3可变区,用PCR-DGGE技术鉴定优势菌,割胶回收测序。结果表明:不同包装鱼肉表面优势菌群数量和种类不同,在样品中共同的优势腐败菌为假单胞菌,在空气包装中优势腐败菌是假单胞菌、乳酸菌和沙雷菌,沙雷菌在辐照剂量高于8 kGy时被抑制。在真空包装中优势腐败菌是假单胞菌、沙雷菌、热死环丝菌和耶尔森菌,沙雷菌辐照剂量高于6 kGy时被抑制,而耶尔森菌在2 kGy以上即被抑制,热死环丝菌在6、8 kGy辐照条件下才出现,其具有很高的辐照抗性。在气调包装中优势腐败菌是假单胞菌和乳酸菌,但乳酸菌仅在气调包装2 kGy辐照和气调包装8 kGy两种辐照包装条件下是优势腐败菌。结果表明,PCR-DGGE技术可以很好地鉴别鱼肉表面优势腐败菌。

关键词:草鱼;聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳;微生物;优势菌群;气调包装;辐照

 

PCR-DGGE Analysis of Dominant Bacterial Populations on the Surface of Grass Carp Meat
under Different Packaging Conditions

 

TU Zong-cai1,2, MA Da1, WANG Hui1, SHI Yan1, SHA Xiao-mei1, HUANG Xiao-qin2

(1. State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China;

2. Key Laboratory of Functional Small Organic Molecule, Ministry of Education, Jiangxi Normal University, Nanchang 330022, China)

 

Abstract: Changes in dominant bacterial populations (DBP) on the surface of grass carp meat packaged under three different atmospheric conditions (air, vacuum and modified atmosphere packaging environment) and then irradiated by Co-60 gamma ray at six different doses (0, 2, 4, 6, 8, and 10 kGy) after subsequent storage at 4 ℃ for 18 days were investigated by polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis analysis (PCR-DGGE). The bacteria on the surface of fish meat samples were washed and collected, and their DNA was then extracted. The V3 variable region of 16S rDNA was amplified with PCR. Identification of DBP was performed with DGGE. The amounts and species composition of DBP varied with the type of packaging. Pseudomonas sp. was dominant on all fish samples. Lactic acid bacteria and Serratia sp.
were also dominant on air-packaged samples, and Serratia sp. was inhibited when the irradiation rose was more than
8 kGy. Pseudomonas sp., Serratia sp., Brochothrix thermosphact, and Yersinia sp. were identified as the dominant bacteria on vacuum-packaged samples; Serratia sp. was inhibited when the irradiation dose was above 6 kGy, Yersinia sp. could be inhibited even when the irradiation dose exceeded 2 kGy, and B. thermosphact exhibited high irradiation resistance for its occurrence even at doses of 6 and 8 kGy. For modified atmosphere packaged fish, the DPB were Pseudomonas sp. and Lactobacillus sp.; however, lactic aci bacteria were dominant only when the irradiation dose was 2 or 8 kGy. In conclusion, PCR-DGGE provides a good way to analyze dominant bacterial populations on the surface of grass carp meat.

Key words: grass carp; polymerase chain reaction-deformation gradient gel electrophoresis analysis (PCR-DGGE); microorganisms; dominant bacterial population; modified atmosphere package; irradiation

中图分类号:TS201.2 文献标志码:A 文章编号:1002-6630(2014)20-0143-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201420029

鱼类食物难以保存,极易受各种理化因素、微生物等影响而发生腐败,研究表明冻结温度以上的细菌活动是引起鱼类腐败变质的主要原因之一[1]。在适宜环境下,能在鱼肉表面大量繁殖、并在种间竞争中占优势的菌种即是优势菌种[2]。研究鱼类优势腐败菌生长和繁殖规律、探究细菌群落动态变化并采取相应有效抑制细菌增殖的保鲜和贮藏方式,对捕捞、加工、贮藏、运输、销售过程中鱼类产品品质的保障和货架期的延长至关重要。常用的保鲜技术包括低温保鲜、气调保鲜、冰温气调保鲜、辐照保藏、化学保鲜等[3],尤其是辐照保藏技术,因其具备降低食品病原体污染和保留食品完好风味的双重优点而广受青睐,成为重要的保藏手段。气调包装(modified atmosphere packaging,MAP)保鲜技术是用一种或几种气体代替食品包装袋内的空气,从而抑制产品腐败、延长食品保鲜期的一种新型保鲜技术[2]。在国内外MAP技术已经被开发用于生鲜肉、水产品、凝乳、鲜奶酪、果蔬和即食食品的保藏[4]。在我国,水产品气调保鲜包装在商业上的应用仍处于研究和起步阶段。结果表明MAP与低温结合可以显著地延长水产品的货架期,而且MAP对水产品的保鲜效果优于相同条件下的空气包装和真空包装[5]。

监测鱼肉表面优势腐败菌的方法有传统培养基培养鉴别法、聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳(polymerase chain reaction-deformation gradient gel electrophoresis analysis,PCR-DGGE)、聚合酶链式反应-温度梯度凝胶电泳等[3,6]。在分子生物技术出现之前,人们了解鱼肉表面腐败微生物主要依靠纯培养的方法。由于这些方法过于简单和表面化,无法提供全面有效的信息。鱼肉的加工、贮藏、运输过程中的温度不同,以及微生物需氧/好氧、适冷/适热、革兰氏阴性/革兰氏阳性、共生寄生等复杂因素影响,传统的培养方式很难满足鱼肉贮藏过程中优势腐败菌的鉴定,这给深入了解鱼肉贮藏微生物的种类、特性等造成了障碍[7]。随着分子生物学技术的发展,DGGE技术被越来越多的引进微生物领域。PCR-DGGE技术直接利用DNA和RNA对微生物的组成遗传特异性进行表征,不但避免了传统的培养菌种分离耗时耗力,而且还可以鉴定出利用传统方法无法分离出来的菌种[8-9]。此外,PCR-DGGE方法直接从鱼肉表面提取微生物的DNA,可以保持特定微生物多样性的原始状态,通过PCR大量扩增DNA片段,得出鱼肉表面微生物的群落结构结果更精确[10]。本研究旨在运用PCR-DGGE技术鉴定出辐照气调技术保鲜冷藏终点(菌落总数大于等于1×106 CFU)[11],即冷藏18 d草鱼的优势腐败菌种类,以便于有针对性的选择防腐剂,为延长草鱼的货架期提供准确有效的信息。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

草鱼 江西南昌天虹超市江大店;聚氯乙烯-聚乙烯薄膜、玻璃珠、乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid,EDTA)、1×磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,PBS)、0.5×TBE缓冲液(Tris 0.05 mol/L,硼酸0.04 mol/L,EDTA 1 mmol/L)、
1×TAE缓冲液(Tris 0.04mol/L,冰乙酸11.4 mL,EDTA 1 mmol/L)、丙烯酰胺、双丙烯酰胺、去离子甲酰胺 北京索莱宝科技有限公司;细胞裂解液、苯酚、氯仿、无水乙醇、冰乙酸、异戊醇和异丙醇(均为分
析纯) 国药集团化学试剂有限公司;RNA酶、Taq酶 碧云天生物技术公司。

1.2 仪器与设备

HZ-600型气调包装机(V(N2)V(CO2)=11) 上海青葩食品包装机械有限公司;Primo R型超速离心机 美国Thermo公司;DYCP型琼脂糖凝胶电泳系统 北京六一仪器厂;S1000型PCR仪、750-0200型DGGE电泳仪 美国Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 鱼肉样品的制备

在南昌市天虹超市购买鲜活草鱼0 ℃贮藏1 d后,去皮去筋,将鱼肉切成2 cm×2 cm×0.5 cm(长×宽×高)规格的鱼块,并用气调包装机进行包装,每袋包装两块鱼块(10 g左右),真空、气调(V(N2)V(CO2)=
11)和空气包装各6 袋,其中气调和空气的气体体积为100 mL(1 atm)。再分别送去江西科苑辐照有限公司进行辐照,辐照剂量为0、2、4、6、8、10 kGy包装好并经辐照照射的样品,空气包装用0、2、4、6、8、10 kGy辐照;真空包装用0、2、4、6、8、10 kGy辐照;气调
V(N2)V(CO2)=11)包装用0、2、4、6、8、10 kGy辐照。

1.3.2 鱼肉表面细菌DNA的提取、纯化[12-13]

称取鱼肉样品10 g,加50 mL PBS 50 mmol/L缓冲液进行冲洗,3 000 r/min离心10min,取上清液于8 000 r/min
离心10 min,用1 mL PBS冲洗沉淀。称0.4 g玻璃珠,加600 μL的细胞裂解液,细胞破碎时间为45 s,
10 000 r/min离心10 min,取上清液。加250 μL的0.5 mol/L
的EDTA溶液,在-20 ℃的条件下静置10 min。
10 000 r/min离心10 min,取上清液。加入500 μL的苯酚-氯仿-异戊醇(25241,V/V)混匀后在8 000 r/min离心5 min,取上清液。加入同等体积的异丙醇,-20 ℃静置80 min。10 000 r/min离心10 min,弃去上清液,加1 mL 75%乙醇洗涤,37 ℃消化4 h。用0.8%的琼脂糖凝胶进行DNA条带检测,粗提DNA置于-20 ℃条件下保藏。DNA样品在0.8%琼脂糖凝胶中电泳30 min,以0.5×TBE为缓冲液。

1.3.3 PCR扩增

1.3.3.1 扩增方法

纯化后的基因组DNA作为聚合酶链式反应的模版,利用美国Bio-Rad公司的PCR仪扩增V3可变区。

1.3.3.2 反应体系[14]

10×PCR缓冲液5 μL、dNTP 4 μL、引物1为2 μL(10 mmol/L)、引物2为2 μL(10 mmol/L)、牛血清蛋白2 μL(3%)、模版2 μL(1 ng/mL)、去离子水50 μL

1.3.3.3 反应条件

预变性94 ℃、5 min,94 ℃、30 s,55 ℃复性30 s,72 ℃延伸30 s,进行35 个循环;72 ℃延伸10 min,温度降至为4 ℃。用1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测,片段大小约为217 bp[15-16]。

1.3.4 变性凝胶电泳

DGGE胶的质量分数范围是35%~65%,在电压140 V的条件下电泳10 h。跑胶结束后进行银染,加入少量的去离子水,然后照胶[17-18]。

1.3.5 图谱分析

采用Quantity One软件分析图谱。分析每个泳道条带数目,根据条带的灰度值可以判断灰度值大的条带为优势菌,对每条泳道中的优势菌进行割胶回收[19]。

1.3.6 测序分析

割胶回收的DNA片段,并对该片段进行扩增。反应体系和条件与1.3.3节扩增V3可变区一致。扩增片段送往北京华大生物技术有限公司进行分析。

1.3.7 测序比对

测得的基因序列与NCBI数据库比对,选择同源性值最高的为测序的结果。

2 结果与分析

2.1 细菌16S rDNA V3可变区的扩增结果

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M. DNA Marker。

图 1 V3可变区的琼脂糖凝胶电泳图

Fig.1 Agarose gel electrophoresis of V3 variable region

图1是以不同辐照剂量和包装条件下鱼肉所洗涤下来的细菌DNA为模板,对16S rDNA V3可变区进行PCR扩增,扩增以后经过1%琼脂糖凝胶电泳以后的成像图。16S rDNA V3可变区的基因片段为217 bp[20]。由图1可知所有18 个样品都有与目标片段一致的片段,片段大小为220 bp左右。

2.2 细菌DGGE图谱主要条带的DNA序列分析

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772447.jpg 

a.空气包装;v.真空包装;NC.气调包装;数字分别代表辐照剂量。

A.软件分析前图;B.软件分析后图。

图 2 泳道中标记待测序的优势条带

Fig.2 Lane markers for sequencing of dominant bands

图2A、B是鱼肉表面优势腐败菌的DGGE电泳条带运用Quantity One软件分析前、后的图,由于6泳道基因条带数目最多,因此以其为基准,其他泳道进行匹配。横线标记表明匹配的条带。图中的灰度值与DNA含量呈正比,灰度值越大表示DNA含量越高,Quantity One会自动根据灰度值识别条带,当灰度值不小于65%时,其显示为图2B。图2A割胶分析图,按图中的顺序,依次序割胶,整张图片的灰度值大致是空气包装0~8 kGy灰度值大致变化不大;a10灰度值增大;v0~NC10灰度值逐渐下降,这可能的原因是随着辐照剂量的增加细菌被抑制后,产生小部分变异的11、12、13 DNA的菌落,这3 种细菌继而成为空气处理10 kGy的优势腐败菌。

对图2A中的优势腐败菌进行分析,并比对割胶,割1~15号条带,并用50 μL去离子水浸泡,并置于4 ℃过夜,PCR扩增16S rDNA V3可变区。扩增后经1%琼脂糖电泳检测,结果见图3。由图3可示,条带1~15的PCR产物测序结果与NCBI数据库中进行Blast比对,结果见表1。

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1~15.待测序菌;M. DNA Marker。

图 3 回收DNA的PCR扩增产物电泳图

Fig.3 PCR amplification products of recycled DNA for identified sequences

2.3 冷藏18 d鱼肉贮藏过程中优势菌的分析

表 1 16S rDNA V3可变区基因序列比对结果图

Table 1 Sequence alignment of V3 variable region of 16S rDNA gene

条带

细菌

相似度/%

1

耶尔森菌(Yersinia sp.)

93

2

沙雷菌属(Serratia liquefaciens ATCC 27592 plasmid)

98

3

沙雷菌属(Serratia plymuthica 4Rx13)

84

4

乳酸菌属(Lactobacillus sp.

97 

5

假单胞菌属(Pseudomonas syringae pv. phaseolicola 1448Achromosome)

95

6

假单胞菌属(Pseudomonas poae RE*1-1-14)

94

7

假单胞菌属(Pseudomonas sp.)

91

8

假单胞菌属(Pseudomonas fulva 12-X chromosome)

92

9

假单胞菌属(Pseudomonas stutzeri A1501 chromosome)

91

10

假单胞菌属(Pseudomonas syringae pv.)

94

11

假单胞菌属(Pseudomonas synxantha BG33R chromosome)

97

12

肺炎杆菌属(Klebsiella pneumoniae subsp. sp.)

91

13

假单胞菌属(Pseudomonas sp. UW4 chromosome)

90

14

假单胞菌属(Pseudomonas syringae pv.)

91

15

热死环丝菌(Brochothrix thermosphacta

96

 

 

由表1可知,条带1~4所代表的微生物分别是耶尔森菌(Yersinia sp.)、沙雷菌属(Serratia sp.)、乳酸菌属(Lactobacillus sp.),5~11、13、14为假单胞菌属(Pseudomonas sp.),12为肺炎杆菌属(Klebsiella pneumonia sp.),15为热死环丝菌属(Brochothrix thermosphacta sp.)。

2.3.1 耶尔森菌

DGGE图谱中条带的亮度大小代表微生物的数量多少,条带越亮微生物的数量越多[21]。耶尔森菌(Yersinia sp.)
是食物中的一种病原微生物,食品安全要求其在食品中不能被检出。由图2可见,耶尔森菌所对应的条带1在空气包装0、6、8 kGy;真空包装0 kGy;气调包装6 kGy中出现是这几种处理条件的优势腐败菌。空气和真空的无辐照样品均出现条带1,空气包装6、8 kGy也出现条带1,可能是由于随着辐照剂量的增加引起了不利变异从而产生了耶尔森菌,该菌能在低温和较高辐照剂量下逐渐生长,因此要求鱼肉包装贮藏时严格管理卫生,降低病原微生物的污染。

2.3.2 沙雷菌

沙雷菌(Serratia sp.)是能产生非水溶性黄、紫和红色素的革兰氏染色阴性小杆菌,一般存在于土壤、水、植物、动物以及人类的肠道和呼吸道中。DNA中的G+C克分子含量为53%~59%,沙雷菌属所对应的条带是2、3,由表2及图2可知,a0、a2、a6、v0、v2、v4的优势菌都是沙雷菌属,而且随着辐照剂量的增大其条带灰度值逐渐减小,但在国内外文献关于鱼肉优势腐败菌中出现沙雷菌属的报道几乎没有。因此,在本实验中出现该菌种,可能是由于鱼肉在洗和包装的过程中,肠道和呼吸道没有用无菌水清洗干净导致的沙雷菌污染所致。

2.3.3 乳酸菌

在真空和气调包装的条件下,乳酸菌属(Lactobacillus sp.)数量明显上升[22],乳酸菌对应的条带是4,由图2可知,乳酸菌是a2、a4、a6、a8、a10、NC2以及NC8的优势腐败菌。乳酸菌在以上包装条件中条带都很深,是其优势腐败菌,乳酸菌是一种兼性厌氧菌,文献报道乳酸菌在空气和真空中数量迅速增长,从图2可见,气调包装乳酸菌也依然是优势腐败菌,这可能是由于气调中N2和CO2的比例不足以抑制乳酸菌的生长。

2.3.4 假单胞菌属

假单胞菌属(Pseudomonas sp.)是需氧型微生物、细菌一科,无核、革兰氏阴性杆菌、不形成芽孢,化能有机营养,严格好氧,呼吸代谢,从不发酵。文献[22-23]报道假单胞菌是真空、空气包装的优势腐败菌。假单胞菌所对应的条带是5~11、13、14,其在各包装条件中数量迅速增长,尤其是在真空包装和空气包装中,气调包装也有少量的假单胞菌,但条带的颜色整体较浅,随着辐照剂量的增加假单胞菌的亚种和数量都在明显的减少,这与文献[24]中报道的一定剂量辐照可以抑制细菌生长结论一致。

2.3.5 肺炎杆菌

肺炎杆菌(Klebsiella pneumonia sp.)是一种病原微生物,在国内外文献中还没有鱼肉贮藏过程中出现肺炎杆菌的报道,肺炎杆菌所对应的条带是12,由图2可知,肺炎杆菌仅出现在v0中且条带较浅,可认定其不是优势腐败菌。

2.3.6 热死环丝菌

热死环丝菌(Brochothrix thermosphacta)是革兰氏阳性菌,细胞无荚膜,不运动、不生孢子。热死环丝菌是兼性厌氧菌,主要出现于肉产品,广泛分布于环境中[25]。由图2可知,热死环丝菌所对应的条带是15,并在v4、v8、v10中出现,且在v4、v10条带很深,也就意味着细菌数量较多,可认定为是v4、v10的优势腐败菌。

3 讨论与结论

本研究运用PCR-DGGE技术鉴别不同包装和辐照剂量鱼肉在贮藏过程中的优势腐败菌种类和分布的研究,结果表明不同包装和辐照剂量的冷藏鱼肉中优势菌分布呈现以下不同的变化。

在空气包装中,假单胞菌和乳酸菌随着辐照剂量的增加,DGGE条带越深,说明这两种细菌对辐照有好的抗性;沙雷菌在0~6 kGy剂量下是优势腐败菌,但在8 kGy以上便被抑制,条带逐渐变浅并消失;耶尔森菌在6~8 kGy剂量下是优势腐败菌,它可能由其他细菌在辐照下变异所产生,并在高剂量(10 kGy)辐照条件下被杀灭,具体原因还需进一步研究证实。

在真空包装中,假单胞菌一直存在并且是其优势腐败菌;沙雷菌在v0~v4剂量下是优势腐败菌,但随着辐照剂量的增加,沙雷菌被抑制;耶尔森菌在v0条件下是优势腐败菌但随着辐照剂量的增加,其被抑制直至消失;热死环丝菌出现在v4、v8、v10辐照剂量下,证明热死环丝菌对于高辐照有很强的抗性。

在气调包装,6 种剂量辐照后,鱼肉表面菌群的16S rDNA DGGE条带颜色都较浅,假单胞菌是6 种剂量辐照后鱼肉表面的优势腐败菌;乳酸菌在NC2和NC8中出现,是其优势腐败菌;耶尔森菌出现在NC6,耶尔森菌在其他剂量中都没有出现,其是不是NC6的优势腐败菌需进一步证实。

PCR-DGGE技术能够很好地鉴别鱼肉表面优势腐败菌,鉴别结果表明辐照合并气调包装鱼肉表面细菌抑制效果要好于空气包装和真空包装,不同辐照剂量合并空气和气调包装中优势菌是乳酸菌和假单胞菌;不同辐照剂量合并真空包装中优势菌是假单胞菌、热死环丝菌。

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收稿日期:2013-10-25

基金项目:国家重点基础研究发展计划(973计划)项目(2012CB126314);江西省重大科技创新研究项目(20124ACB00600)

作者简介:涂宗财(1965—),男,教授,博士,研究方向为食物资源开发与高效利用。E-mail:tuzc_mail@aliyun.com