食品中芥末过敏原成分LAMP检测方法的建立

程晋霞1,2，周熙诚1，马 丹1，刘 莉1，曾 静1,*

（1.北京出入境检验检疫局，北京 100026；2.北京农学院，北京 102206）

摘 要：目的：建立食品过敏原芥末成分环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）检测方法，并与实时荧光-聚合酶链式反应（real-time polymerase chain reaction，RT-PCR）检测方法比对。方法：针对白芥的主要过敏原基因Sin A1，设计LAMP引物并建立反应体系，在特异性和灵敏度方面与RT-PCR检测方法比对。结果：建立的LAMP检测方法，经特异性验证，与所测试的13 种植物，无交叉反应。通过添加实验，方法的检测灵敏度为0.5%，与RT-PCR方法检测灵敏度相当。检测了25 份实际样品，检测结果与RT-PCR检测结果一致。结论：建立的食品过敏原芥末成分LAMP检测方法简单经济，检测结果可靠，可有效缩短检测时间，适用于芥末过敏原成分的检测，具有良好的应用前景。

关键词：芥末；过敏原；环介导等温扩增；实时荧光-聚合酶链式反应

Establishment of a Loop-Mediated Isothermal Amplification Method for Detection of Mustard Allergen in Foods

CHENG Jin-xia1,2, ZHOU Xi-cheng1, MA Dan1, LIU Li1, ZENG Jing1,*

(1. Beijing Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Beijing 100026, China;

2. Beijing University of Agriculture, Beijing 102206, China)

Abstract: Objective: A loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method was established for the detection of mustard allergen in foods and was compared with real-time polymerase chain reaction (RT-PCR). Methods: The Sin A1 gene of Sinapis alba was used to design LAMP primers. The specificity and sensitivity of LAMP were compared with those of RT-PCR. Results: The specificity of LAMP method was tested with 13 different crops. The results showed that the LAMP method was highly specific to mustard. No cross-reaction was found. The limit of detection (LOD) for LAMP was 0.5% in base-material addition test, which was consistent with that of the RT-PCR method. For 25 real food samples, the LAMP results were consistent with the RT-PCR results. Conclusion: The LAMP method of established in this study was simple, economical and reliable and could effectively reduce the detection time.

Key words: mustard; allergen; loop-mediated isothermal amplification (LAMP); real-time polymerase chain reaction (RT-PCR)

中图分类号：TS207.3 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）20-0148-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201420030

过敏性疾病发病率呈逐年上升趋势，已成为重要的食品安全问题。据文献报道40%的儿童被诊断出在某种程度上患有过敏性疾病，1990—2000年在英国和爱尔兰有8 人死于此病。发达国家超过20%的人受过敏性疾病的困扰[1]，而且食物过敏目前只能预防，不能治愈[2]。芥末是常见的过敏原之一。芥末属于被子植物门，十字花科植物。芥末种子及其粉末在世界各地被广泛地用作调味料来使用。芥末中的致敏物质主要是一种由二硫键连接的重链和轻链组成的蛋白，它耐高温和消化酶的作用，从而使其在加工过程中不易受影响，而且在加工过程中，致敏蛋白很可能被某些成分隐藏，从而增加检测的难度。芥末致敏可引起过敏性皮肤炎、神经性水肿、支气管哮喘等疾病，成人和儿童都可能发病[3]。迄今，食品过敏原性的主要检测方法有皮肤实验、双盲安慰剂对照激发实验、血清IgE检测和组胺释放实验等；国内外学者近几年在不断研究建立食品中致敏原成分的快速有效检测方法。Mustorp[4]、邵娟[5]等采用实时荧光-聚合酶链式反应（real-time polymerase chain reaction，RT-PCR）方法检测食品中的芥末成分，Lee等[6]运用双抗体夹心法检测了沙拉和灌肠中残留的芥末。

近年来，随着核酸快速检测技术的研究发展，普通PCR及RT-PCR等快速、特异方法被引入食品过敏原成分的检验[7-9]，但这类方法均需要特殊仪器，不适于在广大基层实验室实施开展，使其应用受到了极大的限制。直至近年来出现的 LAMP方法[10]，具有简单、特异、快速、灵敏等优点，尤其适合在基层实验室应用与开展。已有报道采用LAMP方法检测过敏原大豆、花生等成分[11-12]。本实验采用通过荧光信号判断LAMP反应的技术和设备，建立芥末过敏原成分LAMP检测方法，并与RT-PCR方法比对，旨在建立切实可行的芥末过敏原成分LAMP检测技术，检测时间只需45～60 min即可。通过这一检测方法的建立，有助于解决我国食品安全中的过敏问题，有助于为预防芥末食品过敏的发生提供预警技术手段，保障人民群众的身体健康，有利于促进我国芥末食品国际贸易，并为规范我国食品过敏原标签管理提供一定的技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

实验样品包括芥末、小米、芝麻、花生、青豆、芹菜、麦片、玉米、红豆、杏仁、核桃、大米、土豆和5 类市售样品（调料类、小食品类、蔬菜类、农作物类、坚果类）均为市购。

甜菜碱（5 mol/L） 美国Sigma公司；dNTP（10 mmol/L） 上海生工生物工程有限公司；MgSO4（50 mmol/L） 北京索莱宝科技有限公司；Bst DNA聚合酶（8 U/μL）、10×ThermoPol缓冲液（1×ThermoPol缓冲液含0.1% TritonX-100、10 mmol/L (NH4)2SO4、10 mmol/L KCl、20 mmol/L Tris-HCl） 美国NEB公司；钙黄绿素荧光染料 广州迪澳生物技术有限公司；TaqMan Gene Expression Master Mix（2×） 美国Life公司；十六烷基三甲基溴化铵（hexadecyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）提取液：100 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0），20 mmol/L Na2EDTA，1.4 mol/L NaCl，20 g/L CTAB；CTAB沉淀液：5 g/L CTAB，40 mmol/L
NaCl；1×TE缓冲液 生工生物工程（上海）股份有限公司；三氯甲烷 国药集团化学试剂有限公司；蛋白酶K（20 mg/mL） 天根生化科技有限公司；10×PBS缓冲溶液（NaCl 80 g、NaHPO4×12H2O 29 g、KCl 2 g、KH2PO4 2 g、先溶于900 mL去离子水，待充分溶解后再加去离子水至1 L，室温保存）使用时进行1∶10稀释；DL 2000 DNA Marker 日本TakaRa公司。

LAMP扩增仪 德国Qiagen公司；7900实时荧光定量PCR仪 美国Life公司；凝胶电泳成像仪 美国Bio-Rad公司；恒温加热块、微量移液器（10、100、200、1 000 μL） 德国Eppendorf公司。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取

芥末DNA提取方法主要参考王玮[13]、Scaravelli[14]等的方法，即CTAB法，稍作修改，具体步骤如下：称取200 mg样品于2 mL离心管中，加入1.5 mL CTAB提取缓冲液和10 μL 20 mg/mL蛋白酶K溶液，60 ℃振荡孵育过夜。将上述裂解物于12 000×g 离心10 min，小心转移上清液至新的2 mL 离心管中；加入750 μL三氯甲烷后用力振荡，12 000×g 离心15 min，将上清液转移到新的2 mL 离心管中；加入2 倍体积的CTAB沉淀液，室温静置1 h 后，12 000×g 离心15 min，弃去上清液；加入350 μL 1.2 mol/L NaCl溶液将沉淀充分悬浮，再加入350 μL三氯甲烷，涡旋振荡混匀，12 000×g离心10 min；小心转移上清液至新的1.5 mL 离心管中后加入0.8 倍体积异丙醇，－20 ℃静置1 h，12 000×g离心10 min，弃去上清液；用70%乙醇溶液洗涤沉淀2～3次后，12 000×g离心10 min，小心倾倒乙醇，沉淀挥发干燥，加100 μL TE溶液溶解沉淀DNA，立即使用或
－20 ℃保存备用。

1.2.2 LAMP方法

1.2.2.1 LAMP引物设计

引物设计靶基因选择白芥管家基因Sin A1基因[5,13]（GenBank No.S54101）。应用引物设计软件PrimerExplorer 4.0设计的引物序列包括：外侧上游引物F3（5’-CCGGCCCATTTAGGATTCC-3’）、外侧下游引物B3（5’- ACTGCTGGAGTAGTGGTGG 3’）、内侧上游引物FIP（5’-CTGCATTGCCTGCTTGTGGAGGTTTCAGCAAGCACAACACC-3’）、内侧下游引物BIP（5’-CCGGTAGTGGTCCAAGCTGGATCTGCTGTGGTCCCTGTG-3’）、环状上游引物LF（5’-CCATTGTTGGCAAGCTCTCA-3’）、环状下游引物LB（5’-CCCTCGACGATGAGTTTGATTT -3’）。

1.2.2.2 LAMP 检测体系初步建立

配制反应体系25 μL，包括：MgSO4、dNTPs、甜菜碱、内引物、外引物、环引物、Bst DNA聚合酶、1×ThermoPol缓冲液以及适量的DNA模板；混匀，于65 ℃温育60 min。

1.2.2.3 反应体系的优化

选择Mg2+、dNTPs和甜菜碱这几个参数，进行反应体系的优化。Mg2+浓度选择2、4、6、8、10 mmol/L，dNTPs浓度选择1.4、1.6、1.8、2.0、2.2 mmol/L、甜菜碱浓度选择0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mol/L，进行LAMP反应，于65 ℃温育60 min，反应结束后电泳观察扩增效果，确定最佳反应体系。

1.2.2.4 结果判定

实时荧光曲线变化：若有“S”型扩增曲线且扩增值超过设定的阈值为阳性（有核酸扩增），若扩增曲线的扩增值未超过设定的阈值为阴性（无核酸扩增）。

电泳检测：LAMP法的扩增产物是各种不同长度的茎-环状结构DNA，因此阳性反应通过2%琼脂糖电泳检测呈梯形条带，而阴性反应则没有梯形扩增条带出现，可作为辅助检测方法。

1.2.3 RT-PCR方法

1.2.3.1 RT-PCR引物设计

同样选择白芥管家基因Sin A1基因，应用引物设计软件Primer Express 3.0设计引物序列包括：上游引物P1（5’-CACCTGAGAGCTTGCCAACA -3’）、下游引物P2（5’-GACCACTACCGGACTGCATTG-3’）、探针P（5’-FAM-TGGCTCCACAAGCAG -TAMRA-3’）。

1.2.3.2 RT-PCR反应体系

25 μL反应体系中包括2×TaqMan Gene Expression Master Mix 12.5 μL；其他成分终浓度依次为上游引物P1、下游引物P2各0.4 μmol/L，探针P为0.2 μmol/L；
DNA模板3 μL；其余体系用焦磷酸二乙酯（diethypyrocarbonate，DEPC）水补足。反应程序为：第一步，预变性进行一个循环，95 ℃、10 min；第二步，PCR反应，进行40个循环，95 ℃变性15 s；后60 ℃延伸1 min，设DEPC水为阴性对照。

1.2.3.3 结果判定

在阴性对照无Ct值显示或Ct值为40，且阳性对照的Ct值不大于30的前提下判断此次实验有效，若检测样本Ct
值不大于35，判断为阳性，否则判断为阴性。

1.2.4 LAMP扩增产物的电泳检测

取2 μL扩增产物和0.4 μL上样缓冲液混匀点样于含0.8 μg/L溴化乙锭的2%～3%琼脂糖凝胶中，电压150 V约20～30 min后置于凝胶成像系统中成像，电泳图片显示LAMP特征性梯状条带为阳性，无任何条带为阴性。

1.2.5 特异性实验

采用本方法所建立的LAMP和RT-PCR检测方法对芥末、小米、芝麻、花生、青豆、芹菜、麦片、玉米、红豆、杏仁、核桃、大米、土豆共13 种植物进行检测，并对结果进行判断，比较两种检测方法的特异性。

1.2.6 灵敏度实验

取不含芥末成分的玉米粉为基质样品，进行人工添加实验，添加水平分别为0.1%、0.5%、1%和2%。按1.2.1节中提供的核酸提取方法提取核酸，用纯芥末核酸作为阳性对照模板，DEPC水作为阴性对照模板，然后分别用LAMP方法和RT-PCR方法进行检测。

1.2.7 实际食品样品的检测

采购5 类市售样品包括调料类、小食品类、蔬菜类、农作物类、坚果类，总共25 份样品。采用本实验所建立的LAMP和RT-PCR检测方法对其进行检测，并对结果进行判断。

2 结果与分析

2.1 反应体系的优化

通过对LAMP反应体系中的Mg2+、dNTPs和甜菜碱进行优化，结果发现Mg2+浓度在4～8 mmol/L的范围内对检测效果没有明显影响，可以获得较强的扩增效率，选用4 mmol/L（图1）；dNTPs浓度在1.4～2.2 mmol/L范围内所得的检测效果没有明显差异，选用1.4 mmol/L（图2）；甜菜碱浓度对反应体系影响不大（图3），在选0.8 mol/L条件下，反应体系更稳定，于65 ℃反应60 min时所得效果最佳，故此作为本研究所推荐的反应体系。

M. 2 000 bp Marker；1～6. Mg2+浓度分别为2、4、6、8、10、12 mmol/L；NC.阴性对照。

图 1 Mg2+浓度对LAMP反应的影响

Fig.1 Effect of Mg2+ concentration on the LAMP reaction

M. 2 000 bp Marker；1～5. dNTPs浓度分别为1.4、1.6、1.8、2.0、2.2 mmol/L；NC.阴性对照。

图 2 dNTPs浓度对LAMP反应的影响

Fig.2 Effect of dNTPs concentration on the LAMP reaction

M. 2 000 bp Marker；1～6.甜菜碱浓度分别为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mol/L；NC.阴性对照。

图 3 甜菜碱浓度对LAMP反应的影响

Fig.3 Effect of betaine concentration on the LAMP reaction

2.2 检测特异性

采用本实验所建立的LAMP和RT-PCR检测方法对芥末、小米、芝麻、花生、青豆、芹菜、麦片、玉米、红豆、杏仁、核桃、大米和土豆共13 种植物进行检测，结果见表1。该结果表明本研究所建立的LAMP检测方法具有良好的特异性，该结果与RT-PCR结果相同。LAMP检测图谱见图4A，RT-PCR检测图谱见图4B。

表 1 LAMP与RT-PCR检测特异性

Table 1 Specificity of LAMP and RT-PCR

注：＋.阳性；－.阴性。下同。

出现扩增曲线的是芥末，未出现扩增的是小米、芝麻、花生、青豆、芹菜、麦片、玉米、红豆、杏仁、核桃、大米、土豆及阴性对照。

图 4 LAMP（A）和RT-PCR（B）特异性实验结果

Fig.4 Amplification curves showing the specificity of LAMP (A) and RT-PCR (B)

2.3 检测灵敏度

取不含芥末成分的玉米粉为基质样品，进行人工添加实验，添加水平分别为0.1%、0.5%、1%和2%。分别用LAMP方法和RT-PCR方法进行灵敏度检测，检测结果见图5。该结果表明，LAMP检测方法与RT-PCR检测方法具有相同的检测灵敏度，均达到0.5%。

PC. 阳性对照；NC. 阴性对照。

图 5 LAMP（A）和RT-PCR（B）灵敏度实验结果

Fig.5 Sensitivity of LAMP (A) andRT-PCR (B)

2.4 实际食品样品的检测

表 2 实际样品检测结果

Table 2 LAMP and PCR results for real samples

购买不同种类的实际样品进行LAMP、RT-PCR两种方法的检测，检测结果如表2所示。5 类食品样品包括调料类、小食品类、蔬菜类、农作物类、坚果类，总共25 份样品，两种检测方法的检测结果一致，均与样品标示相符，准确率达到100%。

3 讨 论

食物过敏已成为重要的食品安全问题[15-17]。芥末是常见的食品过敏原之一。本研究根据白芥管家基因Sin A1基因设计6 条LAMP引物，优化并建立了LAMP反应体系和反应条件。在反应体系中加入含有MnCl2的钙黄绿素荧光染料，反应结果可在白光下肉眼观察否产生绿色钙锰复合物来判断靶基因存在与否，亦可通过LAMP实时荧光信号直接判定结果。

采用本实验所建立的LAMP和RT-PCR检测方法对芥末、小米、芝麻、花生、青豆、芹菜、麦片、玉米、红豆、杏仁、核桃、大米和土豆共13 种植物进行检测，结果表明本研究所建立的LAMP检测方法具有良好的特异性，该结果与RT-PCR结果相同。芥末在世界各地被广泛地用作调味料来使用，按种子的颜色又分为白芥末、棕芥末和黑芥末，为了进一步验证芥末LAMP引物的特异性，对白芥、棕芥、黑芥多份样品进行了特异性验证，发现均有扩增。表明其特异性良好。在灵敏度实验中，取不含芥末成分的玉米粉为基质样品，进行人工添加实验，添加水平分别为0.1%、0.5%、1%和2%。分别用LAMP方法和RT-PCR方法进行灵敏度检测，结果表明，LAMP检测方法与RT-PCR检测方法具有相同的检测灵敏度，均达到0.5%。为了进一步验证本研究建立的过敏原芥末LAMP检测方法的应用性，对5 类食品样品包括调料类、小食品类、蔬菜类、农作物类、坚果类，共25 份实际样品进行检测，其检测结果与实时荧光PCR检测结果一致，均与样品标示相符，准确率达100%。总之，本研究建立的食品过敏原芥末成分LAMP检测方法简单经济，检测结果可靠，可有效缩短检测时间，适用于芥末过敏原成分的检测，具有良好的应用前景。但LAMP 是近年来兴起的一种新型的核酸扩增技术，所以必然伴随着某些不足：LAMP法只能有两种结果：扩增和不扩增。靶序列长度控制在300 bp以下，一旦产生非特异性扩增，则不易鉴别。这些都无法同PCR媲美，故改进和完善LAMP必将成为科研人员的新目标。

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