超高效液相色谱-质谱联用技术测定茶叶中
8 种单、寡糖的含量

王川丕，诸 力，刘 新*，张颖彬，周苏娟

（中国农业科学院茶叶研究所，浙江 杭州 310008）

摘 要：建立同时定性和定量分析茶叶中鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、果糖、甘露糖、葡萄糖、蔗糖和棉子糖8 种单、寡糖的超高效液相色谱-质谱联用方法。样品经超声波辅助提取，以Waters Acquity BEH Amide色谱柱（2.1 mm×150 mm，1.7 µm）分离，以乙腈-水溶液（各含体积分数0.1%氨水）为流动相，电喷雾负离子多反应监测模式检测。结果表明，8 种单、寡糖的定量检出限为0.01～0.54 mg/L，线性范围为1.0～200.0 mg/L；添加水平在10.0mg/L和100.0 mg/L内，回收率为80.2%～103.2%。应用该方法分析包含绿茶、乌龙茶、普洱茶和红茶的20 个样品，发现大部分样品中都能检测到葡萄糖、果糖、蔗糖和棉子糖，它们的含量分别为0.39～17.64、0.53～22.83、2.07～40.70 g/kg和0.57～14.67 g/kg；但在所有样品中均未检测到鼠李糖、木糖、阿拉伯糖和甘露糖。

关键词：超高效液相色谱-质谱；茶叶；葡萄糖；果糖；蔗糖；棉子糖

Determination of Eight Saccharides in Teas by Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

WANG Chuan-pi, ZHU Li, LIU Xin*, ZHANG Ying-bin, ZHOU Su-juan

(Tea Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310008, China)

Abstract: An ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) method was developed for the qualitative and quantitative determination of eight saccharides including rhamnose, xylose, arabinose, fructose, mannose, glucose, sucrose, and raffinose in teas. Samples were extracted with the assistance of ultrasound. The extract was separated on a Waters Acquity BEH Aminde HPLC column (2.1 mm × 150 mm, 1.7 µm) using acetonitrile-water mixture (each containing 0.1% ammonia) as the mobile phase. The electrospray ionization tandem quadrupole mass spectrometric analysis was carried out in the negative ion mode using multiple reaction monitoring (MRM). The limits of detection were 0.01–0.54 mg/L and the linear ranges were 1.0–200.0 mg/L. The average recoveries were 80.2%–103.2% at spiked levels of 10.0 and 100.0 mg/L. The method was applied to analyze 20 tea samples including green tea, oolong tea, Pu’er tea and black tea. Glucose, fructose, sucrose and raffinose were detected in most of the samples, and their contents were in the ranges of 0.39–17.64, 0.53–22.83, 2.07–40.70, and 0.57–14.67 g/kg, respectively. However, rhamnose, xylose, arabinose and mannose were not detected in all the samples.

Key words: ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry; tea; glucose; fructose; sucrose; raffinose

中图分类号：TS207.3 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）20-0164-06

doi:10.7506/spkx1002-6630-201420033

糖类又称为碳水化合物，是植物光合作用的初级产物，植物中的绝大多数成分都是通过糖类合成的，所以糖类不仅是植物的贮藏养料和骨架，还是其他有机物质的前体[1]。

糖不仅是茶叶的滋味物质[2-3]，给茶汤带来甘醇的味道，而且在茶叶的制造过程中，可发生焦糖化作用和羰氨反应，生成相应的醛类、吡咯类和吡嗪类化合物等[4]，对茶叶的色泽和香气的形成有重要作用[5-9]；此外研究发现，单、寡糖具有促进人体肠胃蠕动，改善肠胃功能，抑制茶汤中儿茶素氧化[10]，增强茶汤抗氧化活性[11]的作用。因此，单、寡糖是茶叶中重要化学成分，与茶叶的滋味、汤色和香气及其生理功能密切相关，因此建立茶叶中单、寡糖的快速准确的检测方法，对提高茶叶研究水平，控制茶叶产品质量具有重要的作用。

茶叶中的游离单、寡糖因含量少、易转化，至今尚未见有系统的检测分析方法的研究报告，检测单、寡糖的方法有离子色谱法[12-13]、气相色谱法[14]、高效液相色谱法[15-19]和液相色谱-质谱联用法[20-23]。离子色谱法配合电化学检测器可以分析糖类物质，但存在色谱峰宽、分离度差、容易产生严重干扰等问题。气相色谱法需要将糖类物质进行衍生，以提高目标化合物的挥发性，操作步骤多，过程比较繁琐。由于糖类物质无紫外吸收，液相方法常采用蒸发光散射检测器或示差检测器检测，存在方法检出限低、排除干扰能力差等缺点。液相色谱-质谱联用法具有操作简单、灵敏度高、选择性好、测定周期短等优点[24-25]。

本实验建立超高效液相色谱-质谱（ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS）技术同时测定茶叶中葡萄糖、甘露糖、果糖、木糖、阿拉伯糖、鼠李糖、蔗糖和棉子糖含量的方法，并应用该方法对绿茶、乌龙茶、普洱茶和红茶的20 个实际样品进行分析。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

葡萄糖、甘露糖、果糖、木糖、阿拉伯糖、鼠李糖、蔗糖和棉子糖（纯度98%～99%） 德国Dr.Ehrenstorfer公司；乙腈（色谱纯）、氨水（纯度25%、优级纯） 德国默克化学试剂公司。

1.2 仪器与设备

3200型三重四极杆质谱 美国AB公司；Acquity超高效液相色谱 美国Waters公司；Mill-Q去离子水发
生器 美国Millipore公司；KQ-5200型超声波清洗仪 昆山市超声仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 标准溶液的制备

1.3.1.1 标准储备溶液的制备

精确称取葡萄糖、甘露糖、果糖、木糖、阿拉伯糖、鼠李糖、蔗糖和棉子糖标准品各1.00 g于100 mL容量瓶中，以体积分数50%乙腈溶液为溶剂，配制成质量浓度10.0 mg/mL的混合标准储备溶液。

1.3.1.2 标准工作溶液的制备

取10.0 mg/mL的标准储备液添加适量体积分数50%乙腈溶液稀释成一系列质量浓度（1.0、10.0、50.0、100.0、200.0 μg/mL）的标准工作溶液。

1.3.2 样品处理

1.3.2.1 超声波辅助提取法制备未加标样品溶液

称取0.30 g样品（精确至0.1 mg），置于100 mL容量瓶中，加入25 mL纯水，超声提取15 min，过滤得到滤液，残渣用25 mL纯水重复提取1 次，合并2 次提取滤液，加入50 mL乙腈后，用纯水定容至100 mL。过0.22 μm滤膜，UPLC-MS分析。

1.3.2.2 加热提取法制备未加标样品溶液

称取0.30 g样品（精确至0.1 mg），置于100 mL容量瓶中，加入25 mL纯水，于100 ℃恒温水浴中提取15 min，过滤得到滤液，残渣用25 mL纯水重复提取1次，合并2 次提取滤液，加入50 mL乙腈后，用纯水定容至100 mL。过0.22 μm滤膜，UPLC-MS分析。

1.3.2.3 加标样品溶液的制备

取10.0 mg/mL标准储备液添加适量体积分数50%乙腈溶液稀释成质量浓度1.0、10.0 mg/mL标准工作溶液。用移液器分别吸取1 mL标准液于样品中，按1.3.2.2节未加标样品溶液的制备步骤同样处理。

1.3.3 分析条件

1.3.3.1 色谱条件

色谱柱：Acquity BEH Amide（2.1 mm×150 mm，1.7 μm）；流动相：含体积分数0.1%氨水溶液（流动相A）和含体积分数0.1%氨水-乙腈溶液（流动相B）；流速0.15 mL/min；进样量3.0 μL；柱温35 ℃；运行时间15 min；梯度洗脱程序见表1。

表 1 梯度洗脱程序

Table 1 Mobile phase gradient

1.3.3.2 质谱条件

表 2 8 种糖的监测离子对、碰撞气能量和去簇电压

Table 2 Monitoring ion pairs, collision energy and declustering potential of 8 saccharides

注：*.定量离子对。

电喷雾离子（electron spray ionization，ESI）源；离子源温度250 ℃；扫描方式：负离子模式；雾化气GS1压力50 psi；雾化气GS2压力50 psi；离子喷雾电压：
－500 V；入口电压：－8 V；出口电压：－4 V。各种糖的质谱分析参数见表2。

2 结果与分析

2.1 提取方法的选择

实验比较超声辅助提取法[26]和常规加热提取法[27]制备绿茶、乌龙茶、普洱茶和红茶样品提取溶液的效果，如表3所示。由表3可以看出，超声辅助提取法和加热提取法相比较，提取效果相近，与文献报道[27]一致，考虑到超声辅助提取法不需要加热，操作比较方便、提取时间短、提取效率高、提取液颜色浅，本实验选择超声辅助提取法制备样品溶液。

表 3 提取方法对提取的影响（n=3）

Table 3 Influence of extraction methods (n = 3)

g/kg

注：表中数据为3 次重复的平均值；ND.未检测出。下同。

2.2 流动相流速的选择

实验参照文献[26-27]选择色谱柱Acquity BEH Amide，流动相选择含体积分数0.1%氨水溶液（流动相A）和含体积分数0.1%氨水-乙腈溶液。为了解流动相流速对各种单、寡糖的色谱峰强度、半峰宽和分离度的影响，在0.15、0.20、0.3、0.4 mL/min的流速条件下，进行分离实验，如图1～3所示。

图 1 流动相流速对色谱峰强度的影响

Fig.1 Effect of flow rate on chromatographic peak intensity

色谱峰强度是目标化合物的灵敏度指标。如图1所示，随着流动相流速的降低，各种单、寡糖的色谱峰强度呈现明显的上升趋势，主要原因是在液相色谱-质谱中，尤其是使用ESI源时，较低的流速减少同时离子化的化合物数量，降低待测成分与基质成分在电离过程中的竞争，从而减弱基质效应。

图 2 流动相流速对色谱半峰宽的影响

Fig.2 Effect of flow rate on chromatographic peak half width

半峰宽是色谱峰的峰形指标，半峰宽越小，说明色谱峰峰宽越窄，提高流动相流速有利于减少目标化合物在色谱柱上的轴向扩散，有利于改善目标化合物的峰形。如图2所示，随着流动相流速的提高，各种糖的色谱峰的半峰宽明显减小。

图 3 流动相流速对分离度的影响

Fig.3 Effect of flow rate on resolution of sugars

分离度（resolution，R）是反映色谱分析方法分离性能的指标，为相邻两峰的保留时间之差与平均峰宽的比值。由于峰宽难以准确测定，实验以半峰宽代替峰宽，R越大，表明相邻两组份分离越好。一般说当R＜1时，两峰有部分重叠；当R=1.0时，分离度可达98%；当R=1.5时，R可达99.7%。通常用R=1.5作为相邻两组分已完全分离的标志。

实验计算得各单、寡糖在不同流动相流速条件下的色谱峰R，如图3所示。结果发现，随流速提高，除蔗糖和棉子糖外，其他糖分离度都呈下降趋势。由于蔗糖和棉子糖的R一直大于1.5，并非分离的难点，且随流动相流速提高，色谱峰强度下降明显，综合考虑各种糖的灵敏度、峰形和分离度等因素，本实验选择0.15 mL/min作为实验流速。

2.3 色谱柱温度的选择

色谱柱的分离温度对各种单糖的色谱峰强度、半峰宽和峰形有较大的影响，因此，研究不同色谱柱温度对各种单、寡糖的分离情况，结果如图4、5所示。

图 4 色谱柱温度对色谱峰强度的影响

Fig.4 Effect of column temperature on chromatographic peak intensity

由图4可以看出，随着色谱柱温度的升高，单糖物质色谱峰强度呈上升趋势，而棉子糖和蔗糖的色谱峰强度明显下降，猜测可能是因为这2 种糖分别为双糖和三糖，在较高的色谱温度条件下，容易发生分解。

图 5 色谱柱温度对半峰宽的影响

Fig.5 Effect of column temperature on chromatographic peak half width

由图5可知，糖类为多羟基物质，具有较高的黏性，提高色谱柱温度，有利于减少黏性，改善峰形，色谱柱温度升高，峰形改善，尤其是对单糖效果明显，但考虑到双糖和三糖在较高的色谱柱温度条件下，会产生分解现象，实验选择色谱柱温度35 ℃。

2.4 质谱条件的优化

通过针泵进样，在负离子检测方式下进行母离子全扫描，得到果糖、葡萄糖、蔗糖和棉子糖等的分子离子。以每种糖的分子离子峰为母离子，进行二级质谱扫描，采集全扫描的二级质谱图，得到碎片离子信息，然后再对得到每种糖的二级质谱参数如破碎电压、碰撞能量等进行优化，使每种糖的定性离子与定量离子产生的离子对强度比例达到最大时为最佳，从而得到每种糖的最佳质谱参数（表1）。

糖为热敏性物质，易在高温条件下产生各种化学反应，本实验研究不同离子源温度条件下，色谱峰强度与离子源温度的关系，如图6所示。

图 6 离子源温度对色谱峰强度的影响

Fig.6 Effect of source temperature on chromatographic peak intensity

由图6可知，随着离子源温度的上升，各种单糖的色谱峰强度明显呈下降趋势，因此对于分析糖组分，选择较低的离子源温度分析效果较好，由于流动相为一定比例的乙腈-水溶液，离子源温度过低，会造成汽化不完全，色谱峰信噪比降低的现象，所以本实验选择离子源温度为250 ℃。

2.5 总离子流图

实验采用1.3.3.1节色谱条件和1.3.3.2节质谱条件，可以较好地分离茶叶中果糖、葡萄糖、蔗糖和棉子糖等8 种单、寡糖，总离子流图如图7所示。

1.阿拉伯糖；2.葡萄糖；3.果糖；4.甘露糖；5.木糖；6.棉子糖；7.鼠李糖；8.蔗糖。

图 7 8 种糖的MRM色谱图

Fig.7 MRM chromatograms of 8 saccharides

2.6 线性范围与检出限

表 4 8 种糖的工作曲线回归方程和线性相关系数、检出限

Table 4 Linear equation with correlation coefficients, and limits of detection for 8 saccharides

按1.3.1.2节配制标准工作液分别进样3 μL，以样品的色谱峰强度（Y）对质量浓度（X，mg/L）进行线性回归，线性范围为1.0～200.0 mg/L。按3倍RSN计算定性检出限，10倍RSN计算定量检出限（表4）。

2.7 回收率和精密度

每组准确称取茶叶样品3 份，每份0.3 g，共3 组，加入8 种糖混合标准样，添加水平分别为10.0 mg/L和100.0 mg/L，按样品溶液制备方法制备后进行测定。其回收率和精密度见表5，加标回收率为80.2%～103.2%，相对标准偏差为0.7%～9.2%（n=3）。实验发现方法基质效应较小，可能是因为样品提取温度低、样品溶液中提出物质较少所致。

表 5 茶样品中8 种糖的加标回收率（n=3）

Table 5 Recoveries and precisions for 8 saccharides in tea sample (n = 3)

2.8 实际样品检测

应用本方法对浙江杭州茶叶市场销售的绿茶、乌龙茶、普洱茶和红茶4大茶类2 个茶样品进行了分析测定（表6）。

表 6 实际样品的检测结果（n=3）

Table 6 Analytical results of real samples (n = 3)）

g/kg

结果表明，在所有茶叶样品中均未检测到鼠李糖、木糖、阿拉伯糖和甘露糖，在所有茶类中均检测到葡萄糖、果糖、蔗糖和棉子糖，葡萄糖含量为0.39～17.64 g/kg、果糖含量为0.53～22.83 g/kg、蔗糖含量为2.07～40.70 g/kg，棉子糖含量为0.57～14.67 g/kg。同类型不同茶叶样品中糖含量的差异悬殊，可能是收集的茶叶样品的品种不同、制作原料的老嫩度不同和加工工艺多样化所致。

3 结 论

实验表明，本法样品操作简单、灵敏度高，明显提高了检测效率，适用于快速测定茶叶样品中鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、果糖、蔗糖和棉子糖的含量。

参考文献：

[1] 宛晓春. 茶叶生物化学[M]. 北京: 中国农业出版社, 2003: 23-25.

[2] LVOVA L, LEGIN A, VLASOV Y, et al. Multicomponent analysis of Korean green tea by means of disposable all-solid-state potentiometric electronic tongue microsystem[J]. Sensor Actuators B: Chemical, 2003, 95(1/3): 391-399.

[3] VALENTOVA H, SKROVANKOVA S, PANOVSKA Z, et al. Time-intensity studies of astringent taste[J]. Food Chemistry, 2002, 78(1): 29-37.

[4] MIZUKAMI Y, KOHATA K, YAMAGUCHI Y, et al. Analysis of acrylamide in green tea by gas chromatography-mass spectrometry[J].Journal Agriculture Food Chemistry, 2006, 54(19): 7370-7377.

[5] CHENG Y, HUYNH-BA T, BLANK I, et al. Temporal changes in aroma release of Longjing tea infusion: interaction of volatile and nonvolatile tea components and formation of 2-butyl-2-octenal upon aging[J]. Journal Agriculture Food Chemistry, 2008, 56(6): 2160-2169.

[6] CHO J Y, MIZUTANI M, SHIMIZU B I, et al. Chemical profiling and gene expression profiling during the manufacturing process of Taiwan oolong “teaoriental beauty”[J]. Bioscience Biotechnology and Biochemistry, 2007, 71(6): 1476-1486.

[7] ALASALVAR C, TOPAL B, SERPEN A, et al. Flavor characteristics of seven grades of black tea produced in Turkey[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2012, 60(25): 6323-6332.

[8] TSAI P J, HUANG T C, CHEN S H, et al. Thermally generated volatiles in roselle tea[J]. Flavor Chemistry of Ethnic Foods, 1999, 5(4): 185-195.

[9] CHEN Y S, TASY H R, YU T H. Studies on the formation of special aroma compounds of Pouchung tea made from different varieties[J]. Food Flavors, 1998, 40(9): 431-442.

[10] SHPIGELMAN A, ZISAPEL A, COHEN Y, et al. Mechanisms of saccharide protection against epigallocatechin-3-gallate deterioration in aqueous solutions[J]. Food Chemistry, 2013, 139(1/4): 1105-1112.

[11] SHARMA V, KUMAR H V, RAO L J M. Influence of milk and sugar on antioxidant potential of black tea[J]. Food Research International, 2008, 41(2): 124-129.

[12] 陈晖, 易瑞灶, 谢荣伟, 等. 基于离子色谱法的海藻糖检测方法研究[J]. 中国海洋药物, 2012, 31(1): 34-37.

[13] 于泓, 牟世芬. 高效阴离子交换色谱-积分脉冲安培检测法分析糖类化合物影响因素的研究[J]. 分析科学学报, 2007, 6(7): 637-641.

[14] 蔡凯, 向章敏, 张婕, 等. 气相色谱法同时测定初烤烟叶中的4 种水溶性糖[J]. 分析试验室, 2012, 33(1): 91-94.

[15] SHANMUGAVELAN P, KIM S Y, KIM J B, et al. Evaluation of sugar content and composition in commonly consumed Korean vegetables, fruits, cereals, seed plants, and leaves by HPLC-ELSD[J]. Carbohydrate Research, 2013, 380: 112-117.

[16] MA C M, SUN Z, CHEN C B, et al. Simultaneous separation and determination of fructose, sorbitol, glucose and sucrose in fruits by HPLC-ELSD[J]. Food Chemistry, 2014, 145(10): 784-788.

[17] ZAKHAROVA A M, GRINSHTEIN I L, KARTSOVA L A. Determination of carbohydrates and sweeteners in foods and biologically active additives by high-performance liquid chromatography[J]. Journal of Analytical Chemistry, 2013, 68(12): 1081-1084.

[18] SHINDO T, SADAMASU Y, SUZUKI K, et al. Method of quantitative analysis by HPLC and confirmation by LC-MS of sugar alcohols in foods[J]. Food Hygiene Safe Science, 2013, 54(5): 358-363.

[19] MONOSIK R, MAGDOLEN P, STREDANSKY M, et al. Monitoring of monosaccharides, oligosaccharides, ethanol and glycerol during wort fermentation by biosensors, HPLC and spectrophotometry[J]. Food Chemistry, 2013, 138(1): 220-226.

[20] 徐虹, 张海静, 宋焕禄. 高效液相色谱-质谱法同时测定食品中5 种单、双糖的含量[J]. 食品科学, 2011, 32(12): 234-238.

[21] 王浩, 刘艳琴, 杨红梅, 等. 液相色谱-质谱联用技术测定无糖食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖[J]. 分析化学, 2010, 38(6): 873-876.

[22] 李静芳, 张素文, 彭美纯, 等. 高效液相色谱法检测乳制品中果糖、葡萄糖、蔗糖和乳糖的含量[J]. 食品工业科技, 2011, 32(6): 391-393.

[23 LIU Z R, LOU Z Y, DING X, et al. Global characterization of neutral saccharides in crude and processed Radix Rehmanniae by hydrophilic interaction liquid chromatography tandem electrospray ionization time-of-flight mass spectrometry[J]. Food Chemistry, 2013, 141(3): 2833-2840.

[24] 王超, 马强, 王星, 等. 液相色谱-串联质谱法同时测定化妆品中的16 种激素[J]. 分析化学, 2007, 35(9): 1257-1262.

[25] 李美华, 徐仲杰, 李帅. 超高效液相色谱-串联质谱法测定无糖食品中木糖的含量[J]. 化学世界, 2012, 53(10): 595-597.

[26] 程勇, 李庆廷, 李剑政, 等. Prevail糖柱-HPLC-ELSD法测定烟草中水溶性糖[J]. 烟草科技, 2010(3): 32-37.

[27] 马书民, 王明泰, 韩大川, 等. 液相色谱串联质谱法测定食品中甘露糖醇、麦芽糖、木糖醇、山梨糖醇[J]. 中国食品添加剂, 2011(5): 206-210.