实时荧光环介导等温扩增技术检测乳粉中的
肺炎克雷伯氏菌

陈文秀，姜 旋，马晓燕，张 伟*

（河北农业大学食品科技学院，河北 保定 071000）

摘 要：为了建立食品中肺炎克雷伯氏菌灵敏快速的检测方法，根据GenBank中已公布的肺炎克雷伯氏菌phoE基因设计引物，利用实时荧光监测仪，建立实时荧光环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技术检测食品中肺炎克雷伯氏菌的方法，可直观判定检测结果，仪器亦可自动显示检测结果。对该检测方法的特异性、灵敏度等方面进行研究，并与聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）检测方法进行比较。结果表明，实时荧光LAMP检测方法特异性强、灵敏度高。用于特异性实验的21 株实验菌株中，4 株肺炎克雷伯氏菌，呈现阳性结果，而其他17 株非肺炎克雷伯氏菌，均呈阴性结果；检测纯菌的灵敏度和检测人工污染乳粉的检出限分别为79 CFU/mL和79 CFU/g，是常规PCR检测方法的100 倍。总之，本研究建立的实时荧光LAMP检测方法灵敏度高、特异性强、耗时短、结果判定直观，实现了对肺炎克雷伯氏菌的快速检测。

关键词：肺炎克雷伯氏菌；phoE基因；实时荧光环介导等温扩增；检测；SYBR GreenⅠ

Detection of Klebsiella pneumoniae in Milk Powder by Real-Time Fluorescence Loop-Mediated
Isothermal Amplification Method

CHEN Wen-xiu, JIANG Xuan, MA Xiao-yan, ZHANG Wei*

(College of Food Science and Technology, Agricultural University of Hebei, Baoding 071000, China)

Abstract: Klebsiella pneumoniae which can cause diseases such as pneumonia was identified as a new foodborne pathogenic bacterium in recent years. Using an ESE-Quant tube scanner, a new real-time fluorescent loop-mediated isothermal amplification method for detecting K. pneumoniae was established with the primers designed based on the phoE gene sequence published in GenBank. The results showed that this method had high specificity and sensitivity than PCR method. Among 21 tested strains, 4 were identified as K. pneumoniae, and the other 17 were negative. The detection limit of K. pneumoniae in artificially contaminated milk powder was 79 CFU/g, 100 times more sensitive than the conventional PCR method. Moreover, the positive results could be directly identified immediately through the data and chart collected by the ESE-Quant tube scanner so that real-time results could be provided.

Key words: Klebsiella pneumoniae; phoE gene; real-time fluorescence LAMP; detection; SYBR Green Ⅰ

中图分类号：TS207.4 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）20-0192-06

doi:10.7506/spkx1002-6630-201420038

肺炎克雷伯氏菌是Friedlander于1883年从患大叶性肺炎病人的肺组织中分离的一种重要的条件致病菌，广泛分布于自然界。近年来，国内外相关研究表明：肺炎克雷伯氏菌可通过婴幼儿配方乳粉和一些不经过加热直接食用的食品引起食物中毒，例如凉拌菜、汉堡包、蔬菜沙拉等[1-3]。国内也有婴幼儿配方乳粉中检出肺炎克雷伯氏菌的报道[4-5]。此菌可引起人和多种动物患病，近年来已成为仅次于大肠杆菌的重要的致病菌[6]。肺炎克雷伯氏菌可在全身各部位发生感染，也能引起腹泻，特别是慢性肠炎和小儿腹泻[7]，对于新生儿和机体免疫力低者，能引起脑膜炎、败血症等。目前，国内对肺炎克雷伯氏菌的检测主要有传统分离鉴定方法、免疫学方法和分子生物学方法，传统分离鉴定以及免疫方法检测过程费时费力，而且灵敏度较低。近年来，肺炎克雷伯氏菌的分子检测方法迅速发展，基于保守序列16S rRNA或phoE基因，利用PCR技术及其相关的荧光定量PCR等分子检测技术相继建立[8-12]。

环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技术是2000年由日本的荣研株式会的Notomi等[13-15]开发出来的一种新的核酸扩增方法。其特点是针对靶基因的6 个区域设计4 种特异引物，利用链置换DNA聚合酶（Bst DNA polymerase）在等温条件（65 ℃左右）保温几十分钟，即可完成核酸扩增反应，具有高特异性和等温快速扩增的特点，LAMP法在检测食源性致病菌方面具有良好地应用前景。由于LAMP产物由多重复靶序列的茎环状DNA和花椰菜状DNA组成，琼脂糖凝胶电泳后会呈现特有的阶梯状条带，但是这种方法耗时较长，且需要打开LAMP反应管进行电泳操作，从而增加了污染的几率，提高了假阳性率。LAMP在扩增形成大量核酸时，可产生肉眼可见的白色焦磷酸镁沉淀，也可以直接通过肉眼观察白色沉淀的存在与否判断扩增结果，这种方式简单方便，省略电泳过程，但反应产物较少，混浊度较低时，肉眼难以察觉。近年来，相继出现了用于LAMP扩增产物检测的实时浊度仪[16]和实时荧光监测仪。

Lucchi等[17]利用实时荧光监测仪建立了疟原虫基因的实时荧光LAMP检测方法。同年，Yamazaki等[18]应用实时荧光监测仪，建立了检测鉴定食源性副溶血弧菌的实时荧光LAMP反应体系。实时荧光监测仪是将LAMP扩增反应与荧光强度检测结合起来的一种便携式等温设备。其利用的是荧光染料（SYBR Green Ⅰ）与双链DNA结合后，荧光大大增强的原理[19]，即在反应体系内加入SYBR Green Ⅰ，随着反应的进行，DNA量的不断增加，荧光信号也随之增强。利用实时荧光监测仪，通过荧光信号的不断累积就可以实时监测LAMP反应的进程，可直观分析目的基因的扩增结果，仪器还可自动显示检测结果（阴性或阳性）。目前，利用实时荧光LAMP技术检测病原菌国内外鲜有报道，而利用该方法检测肺炎克雷伯氏菌的研究国内外均未见报道。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌株

实验所用菌株详见表1。

表 1 实验用菌种

Table 1 Experimental strains

1.1.2 试剂

DNA聚合酶（Bst DNA polymerase large fragment） New England Biolab公司；EasyTaq DNApolymerase和Easy Pure Genomic DNA Kit 北京全式金生物技术有限公司；甜菜碱 美国Sigma公司；dNTPs、MgSO4及DNAMarker（50、100 bp） 大连宝生物公司；LAMP引物合成于北京华大基因研究中心。

1.2 仪器与设备

实时荧光监测仪见图1A。实时荧光监测仪能有效监测LAMP扩增反应过程中反应体系中荧光强度的变化。实时荧光监测仪与适当的电脑软件相连接，扩增曲线就会被显示出来，见图1B。随着反应的进行，会出现明显的峰图，出峰时间越早，峰值越高，表明LAMP反应的扩增效率越高。在一定的反应时间内，根据仪器的扩增判定标准，曲线斜率超过固定值30，则证明发生了LAMP扩增反应，仪器自动判定检测结果为阳性，否则判为阴性[14]。该仪器一次可同时监测8管反应。

图 1 实时荧光监测仪（A）和扩增曲线（B）

Fig.1 ESE Quant TS and amplification curves

ESE-Quant Tube Scanner实时荧光监测仪 德国ESE Gmbh公司；数显超级恒温水浴锅 金堂市杰瑞尔电器有限公司；3K30高速冷冻离心机 德国Sigma公司；
T Gradient PCR扩增仪 德国Biometra公司；UVIpro凝胶成像系统 英国UVItec公司；DYY-10C型电泳仪 北京市六一厂。

1.3 方法

1.3.1 纯菌培养

挑取一接种环肺炎克雷伯氏菌接种于新鲜无菌的营养肉汤培养基中，37 ℃、200 r/min摇床培养12 h。采用稀释平板法进行菌落计数，测定其纯培养物活菌数为7.9×108 CFU/mL。

1.3.2 模板DNA的制备

采用试剂盒法（Easy Pure Genomic DNA Kit）提取肺炎克雷伯氏菌基因组DNA，按照说明书将提取的基因组DNA溶解在200 µL的洗脱缓冲液中，经紫外分光光度计测定DNA质量浓度为40.5 ng/mL，储存在
－20 ℃备用。

1.3.3 引物设计

有研究[20]表明，选择合适的目的基因和正确的引物设计是LAMP反应成功的关键。针对肺炎克雷伯氏菌GenBank中的phoE基因（A04376.1），运用在线引物设计软件PrimerExplorerV4（http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html）进行LAMP引物设计。针对6 个区域设计4条特异引物：2条外引物（F3和B3），2条内引物（FIP和BIP）。FIP由F1的一个互补序列和正向序列F2构成。BIP由B1的一个互补序列和正向序列B2构成。扩增基因组中的位置从266～473 bp区域207 bp目的基因片断。引物的名称和具体序列见表2。每条引物在基因组中具体的位置如图2所示。

表 2 LAMP引物

Table 2 LAMP primers

图 2 引物位置

Fig.2 Primer location

1.3.4 实时荧光LAMP反应

将1.3.1节中的纯菌培养物，用生理盐水进行10 倍系列稀释，同时从每稀释度菌液中取1 mL直接用于提取肺炎克雷伯氏菌基因组DNA，做为模板。实时荧光LAMP反应经过反复优化，确定如下体系和反应条件。

实时荧光LAMP反应体系：10 µmol/L FIP和BIP各4 µL，10 µmol/L F3和B3各0.5 µL，50 mmol/L
MgSO4 0.5 µL，2.5 mmol/L dNTPs 4 µL，5 mol/L
甜菜碱1 µL，10×BstDNA聚合酶缓冲液，8 000 U/mL的Bst DNA聚合酶1、2 µL DNA模板，0.5 µL SYBR Green Ⅰ，用灭菌双蒸水补足25 µL反应体系。

实时荧光LAMP反应程序：反应温度63 ℃，反应时间90 min，但可根据反应情况，随时停止反应。此外，取扩增反应产物5 µL，与1 µL的6×loading buffer均匀混合，2%琼脂糖凝胶电泳，观察梯形条带，以便证实是否发生LAMP扩增反应。

1.3.5 PCR反应

为了比较实时荧光LAMP检测肺炎克雷伯氏菌灵敏度，进行了PCR反应，PCR反应的引物是检测肺炎克雷伯氏菌的LAMP反应的两条外引物（F3和B3），见表2。

PCR反应体系：10×EasyTaq buffer，50 mmol/L MgSO4 0.5 µL，2.5 mmol/L dNTPs 4 µL，10 µmol/L上下游引物各1 µL，5 U的EasyTaq DNA polymerase，2 µL的DNA模板并用灭菌双蒸水补足25 µL反应体系。

PCR反应程序：95 ℃预变性5 min，94 ℃变性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s。进行31 个循环，72 ℃后延伸10 min。PCR反应产物5 µL，与1 µL的6×loading buffer均匀混合，进行2%琼脂糖凝胶电泳，观察电泳结果。

1.3.6 人工污染乳粉

在人工污染肺炎克雷伯氏菌前，乳粉按FDA推荐的常规检验法证实不含肺炎克雷伯氏菌。取25 g乳粉溶于225 mL灭菌生理盐水中，然后将肺炎克雷伯氏菌人工污染到乳粉中：不同稀释度的人工污染乳粉溶液中，肺炎克雷伯氏菌的浓度分别为7.9×108～7.9×100 CFU/mL。同时从每种稀释度乳粉溶液中取1 mL分别加入l mL无水乙醇、l mL氨水和l mL石油醚，混匀，以12 000 r/min离心10 min。弃去上清液，剩余的沉淀分别用1 mL 10 mmol/L TE（pH 7.8）溶解。再用试剂盒法提取溶液中肺炎克雷伯氏菌基因组DNA，进行实时荧光LAMP实验。

1.3.7 反应产物的酶切分析

取5 μL LAMP反应产物，加入1 μL限制性内切酶EcoRⅠ、2 μL 10×反应缓冲液及灭菌的双蒸水12 μL。37 ℃水浴2 h。然后加入2μL 10×loading buffer终止酶活。进行2%琼脂糖凝胶电泳，观察电泳结果。

2 结果与分析

2.1 建立实时荧光LAMP检测方法

按1.3.4节所述LAMP反应体系和条件进行扩增反应，除实验管外，设置阳性对照和阴性对照。扩增反应结束后，进行电泳，证实是否发生LAMP扩增反应，结果见图3。由图3A可知，随着扩增反应的进行，荧光强度逐渐增强，当反应时间接近40 min时，实验管和阳性对照管荧光强度开始大幅度增强。当反应时间达到55 min左右时峰值分别达到最高。而阴性对照管，直到扩增结束也没有出现明显的峰值。由图3B可知，扩增反应结束后，进行琼脂糖凝胶电泳，实验管和阳性对照管电泳后，出现LAMP反应典型的阶梯状条带，而阴性对照管，未出现阶梯状条带。因此，实时荧光LAMP的检测结果和电泳检测的结果一致，表明实验管和阳性对照管确实发生了LAMP扩增。

1～3.分别为实验管、阳性对照管、阴性对照管；M. 50 bp Marker。图B同。

A.实时荧光LAMP检测

B.琼脂糖凝胶电泳检测

图 3 肺炎克雷伯氏菌结果

Fig.3 Detection of Klebsiella pneumoniae

2.2 实时荧光LAMP产物的酶切分析结果

确定LAMP扩增反应特异性的最好方法就是电泳后测序，但由于LAMP反应电泳条带为梯形带，给测序带来极大的困难。研究发现对LAMP 产物进行酶切分析，在一定程度上也可以达到鉴定产物特异性的目的。EcoRⅠ的酶切位点位于引物B1c和B2之间。 通过理论推导可知，对肺炎克雷伯氏菌的实时荧光LAMP反应产物进行酶切，理论上产生的片段大小主要为154 bp和239 bp。 在本实验中，肺炎克雷伯氏菌实时荧光LAMP产物用限制性内切酶EcoRⅠ进行消化后，产生的片段大小与理论值相符，见图4。

M. 100 bp DNA Marker；1、2.用限制性内切酶EcoRⅠ酶切后的产物。

图 4 LAMP产物的酶切分析结果

Fig.4 Enzyme digestion analysis of LAMP products

2.3 实时荧光LAMP特异性实验结果

1.肺炎克雷伯氏菌（CICC 21519）；2.肺炎克雷伯氏菌（实验室保存）；3.阴性对照；4.出血性大肠埃希氏菌（CICC 215313）；5.甲型副伤寒沙门氏菌（CMCC 50001）；6.鼠伤寒沙门氏菌（CMCC 50115）；
7.肠炎沙门氏菌（CMCC 50041）；8.宋内氏志贺氏菌（CMCC 51334）。

1.肺炎克雷伯氏菌（实验室保存）；2.痢疾志贺氏菌（CMCC 51135）；
3.鲍氏志贺氏菌（CMCC 51522）；4.单核细胞增生李斯特氏菌（CMCC 54001）；5.绵羊李斯特氏菌（CICC 21663）；6.蜡样芽孢杆菌（CMCC 63302）。

1.肺炎克雷伯氏菌（实验室保存）；2.小肠结肠炎耶尔森氏菌（CICC 21669）；3.小肠结肠炎耶尔森氏菌（CMCC 52302）；4.金黄色葡萄球菌（ATCC 14458）；5.产气荚膜梭菌（ATCC 13124）；6.普通变形杆菌（CMCC 49027）；7.阪崎肠杆菌（ATCC 51024）；8.副溶血性弧菌（ATCC 17802）。

图 5 实时荧光LAMP反应的特异性检测结果

Fig.5 Specificity of real-time fluorescent LAMP

对表1所列的21 株实验菌株分别用试剂盒法提取基因组DNA，以灭菌双蒸水模板做为阴性对照，进行实时荧光LAMP扩增，以验证检测方法的特异性。结果见图5。只有肺炎克雷伯氏菌出现明显的峰值，其他致病菌株均未出现，表明本研究建立的检测方法特异性较强。

2.4 纯菌检测实验的灵敏度

将肺炎克雷伯菌纯菌培养物进行梯度稀释，进行实时荧光LAMP检测，确定检测方法的灵敏度，同时以PCR检测为对照，结果见图6和图7。

1～8.菌液浓度为7.9×107、7.9×106、7.9×105、7.9×104、7.9×103、7.9×102、7.9×101、7.9×100 CFU/mL。

图 6 实时荧光LAMP反应的灵敏度检测结果

Fig.6 Sensitivity of real-time fluorescent LAMP

由图6可知，当纯菌培养物浓度为7.9×107～7.9×101 CFU/mL时，实时荧光LAMP反应曲线出现明显峰值，呈阳性结果，仪器亦显示阳性结果。当纯菌培养物浓度为7.9×100 CFU/mL时，反应曲线平缓，未出现峰值，呈阴性结果，仪器亦显示阴性结果。因此，本实验所建立的肺炎克雷伯氏菌实时荧光LAMP检测方法的灵敏度为79 CFU/mL。

M. 100 bp DNA Marker；1.阴性对照；2～9.菌液浓度为7.9×108、7.9×107、7.9×106、7.9×105、7.9×104、7.9×103、7.9×102、7.9×101 CFU/mL。

图 7 PCR反应的灵敏度检测结果

Fig.7 Sensitivity of PCR

由图7可知，当纯菌培养物的菌液浓度稀释到7.9×102 CFU/mL时，PCR反应不再出现目的条带，即PCR反应的灵敏度为7.9×103 CFU/mL。因此，实时荧光LAMP检测肺炎克雷伯菌的灵敏度为PCR检测的100 倍。

2.5 人工污染检出限的确定

原始菌液浓度为7.9×108 CFU/mL，人工污染乳粉后，每个稀释度分别提取DNA，进行LAMP扩增，结果见图8。当稀释液菌浓度为7.9×100 CFU/mL时，虽然曲线略有抬头，但是峰值并不明显。即使出现明显的峰值，如果出峰时间晚于最早出峰时间的一倍以上，可以认定为阴性结果。即所建立的肺炎克雷伯氏菌LAMP检测实样的检出限达到79 CFU/g。

1～8.菌液浓度为7.9×107、7.9×106、7.9×105、7.9×104、7.9×103、7.9×102、7.9×101、7.9×100 CFU/mL。

图 8 实时荧光LAMP检测人工污染乳粉的检出限

Fig.8 Detection limit of artificially contaminated milk powder by LAMP

3 结 论

本研究通过对肺炎克雷伯氏菌phoE基因全序列的分析，利用LAMP引物设计软件设计引物，并且利用荧光染料荧光显色的特性，通过向反应体系中添加SYBR GreenⅠ，利用实时荧光监测仪成功地建立了检测肺炎克雷伯氏菌的实时荧光LAMP检测方法，检测纯菌的灵敏度和检测人工污染乳粉的检出限分别为79 CFU/mL和79 CFU/g；与普通PCR检测方法相比较，实时荧光LAMP方法检测灵敏度是常规PCR的100 倍，且缩短了检测时间，检测结果直观。因此该方法灵敏度高、耗时短、特异性强、操作简便，具有广阔的应用前景。

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