微波消解-氢化物发生原子荧光光谱法
测定婴儿配方乳粉中硒含量

卢 丽1，韦晓群1，刘二龙2，刘江晖1，覃小燕1，姚 红1，陈文锐1,*

(1.广东检验检疫技术中心，广东 广州 510623；2.黄埔出入境检验检疫局，广东 广州 510730)

摘 要：建立微波消解-氢化物发生原子荧光光谱法测定婴儿配方乳粉中硒含量的方法。对还原剂、载流、预还原条件、铁氰化钾掩蔽效果、乳粉标准物质消解液及还原剂存放时间进行了研究。结果表明，在还原剂为1.0 g/100 mL KBH4-0.5 g/100 mL NaOH溶液，载流为8%盐酸，消解完全后的残留液中加5.0 mL 6 mol/L盐酸溶液后90 ℃加热至溶液体积约1 mL，不添加铁氰化钾做掩蔽剂，硒的线性回归方程为I=38.440 4C＋1.362 7，线性范围为1.0～10 ng/mL，相关系数为1.000，方法检出限为0.084 ng/mL，加标回收率为90.4%～109%，相对标准偏差为2.9%（n=6）。乳粉标物消解液室温保存有效时间为3 d，还原剂避光冷藏保存有效时间至少1 周。本方法与国标法相比具有简便高效、节约试剂、更有利于操作人员身体健康和环境保护等优点，可以用来快速准确检测婴儿配方乳粉中硒含量。

关键词：微波消解；原子荧光；婴儿配方乳粉；硒

Determination of Selenium in Infant formulas by Microwave Digestion-Hydride Generation
Atomic Fluorescence Spectrometry

LU Li1, WEI Xiao-qun1, LIU Er-long2, LIU Jiang-hui1, QIN Xiao-yan1, YAO Hong1, CHEN Wen-rui1,*

(1. Guangdong Inspection and Quarantine Technology Center, Guangzhou 510623, China;

2. Huangpu Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Guangzhou 510730, China)

Abstract: A method for the determination of selenium in infant formulas was developed using microwave digestion-hydride generation atomic fluorescence spectrometry. Effects of reagents, pre-reducing methods, the presence or absence of potassium ferricyanide, and reserving time of the sample digestion solution of certified reference material and the reducing agent on the test results of selenium were studied. Under the appropriate reagent and pre-reducing condition, without using potassium ferricyanide as masking agent, the linear regression equation was I = 38.440 4C＋1.362 7 in the linear range of 1.0–10 ng/mL (r = 1.000 0). The limit of detection (LOD) was 0.084 ng/mL, and the recovery rate of selenium from spiked samples was 90.4%–109%, with relative standard deviation (RSD) of 2.9% (n = 6). The digestion solution of the certified reference material GBW10017 (GSB-8 milk powder) could be stored at room temperature for three days before determination and the reducing agent was valid within at least one week under refrigeration. The method was characterized by simple operation, high efficiency, reagent-saving, easy operation and no pollution, and was suitable for rapid and accurate determination of selenium in infant formulas.

Key words: microwave digestion; hydride generation atomic fluorescence; infant formula; selenium

中图分类号：TS207.3 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）20-0208-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201420041

硒是人体必需微量元素之一[1]，它具有很强的生物活性，是一种很好的抗氧化剂，具有消除体内自由基、增强机体免疫力、延缓衰老、抗癌及预防克山病等多种功能[2-4]。除极个别地区及进行硒作业的工业场所外，硒中毒现象极少出现，这是因为饮食中硒的含量远低于硒中毒限量值，膳食中硒的摄入量不足严重影响着我国人民的身体健康[5]，已证明硒摄入不足与克山病、大骨节病和地方性克汀病黏液性水肿有关[6]。乳粉是婴儿的主要食物，婴儿食用硒含量低的乳粉可能会引起硒缺乏，对婴儿健康有重大影响，特别是对体质量较轻的新生儿，危害会更大[7]，因此建立婴儿配方乳粉中硒含量的快速、准确、简便的检测方法具有重大意义，将为婴儿乳粉中硒含量监管提供必要的技术支持。2013年4月16日，美国食品和药物管理局发布关于“婴儿配方食品中硒的监管要求”草案，将硒确定为美国婴儿配方食品中第30种要求强制添加的营养元素，并建议在婴儿配方食品中添加硒的最低限量为2.0 μg/100 kcal、最高限量为7.0 μg/100 kcal [8]。我国GB 10765—2010《婴儿配方食品》也对硒的限量做了明确规定：婴儿配方食品中硒的最低限量为2.01 μg/100 kcal（或0.48 μg/100 kJ）；最高限量为7.95 μg/100 kcal（1.90 μg/100 kJ）[9]。

目前对食品及乳粉中硒的测定方法主要有原子吸收光谱法[6-7,10-13]、原子荧光法[2-4,14-16]、极谱法[17]、2,3-二氨基萘荧光法[18]、电感耦合等离子体质谱及电感耦合等离子体发射光谱法[19-22]等，这些方法各有优缺点。GB 5009.93—2010《食品中硒的测定》[23]使用对象范围广，操作繁琐。本实验将建立一种简单、快捷和准确的微波消解-氢化物发生原子荧光光谱法测定婴儿配方乳粉中硒方法，并考察样品消化液室温存放时间对硒检测结果的影响及还原剂冷藏保存1 周内的有效性，为进行乳粉中硒检测及相关方面更深研究的工作者提供一定的数据参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

乳粉购自广州某品牌国产乳粉及广东出入境检验检疫局进口若干批次乳粉。

100 mg/L硒标准溶液（1%盐酸溶液介质） 中国计量科学研究院；硝酸（超级纯）；硼氢化钾（纯度大于等于95%，进口分装） 广州国奥生物技术有限公司；盐酸、双氧水（30%）、氢氧化钠、铁氰化钾（优级纯）；盐酸羟胺（分析纯）；10 g/L硼氢化钾溶液200 mL：称取1.0g氢氧化钠用少量水溶解，加入硼氢化钾2.0 g，搅拌溶解，然后用水定容至刻度；铁氰化钾溶液（100 g/L）；国家标准物质GBW10017（GSB-8乳粉），证书中硒含量标示值为（0.11±0.03）mg/kg。实验用水均为Milli-Q超纯水系统（电阻率18.2 MΩ•cm）制水。

1.2 仪器与设备

AFS-930型双道原子荧光光度计 北京吉天仪器有限公司；硒高性能空心阴极灯 北京有色金属研究总院；Milestone微波消解仪、Milli-Q超纯水系统（电阻率18.2 MΩ•cm）、胜谱DS-360石墨消解仪 广州分析测试中心。所有玻璃器皿均用20% HNO3溶液浸泡24 h，并依次用蒸馏水和超纯水洗涤，待用。

1.3 方法

1.3.1 仪器工作条件

原子化器高度8 mm；负高压290 V；灯电流80 mA；载气流量400 mL/min，屏蔽气流量900 mL/min；读数方式为峰面积，测量方式为标准曲线法。

1.3.2 样品处理

婴幼儿配方乳粉基体复杂，富含蛋白质和油脂，比常规样品难消化彻底，在不影响检测准确度及精密度的情况下，尽量减少样品称样量。准确称取约0.5 g（精确至0.001 g）样品于聚四氟乙烯消解罐中，加入硝酸5.0 mL，双氧水1.0 mL，振摇混合均匀，加盖密闭后于微波消解仪上消解。微波消解参数设置见表1。

表 1 微波消解程序

Table 1 Microwave digestion program

消解完毕冷却后，将消解罐放在通风橱内，将内容物转入50 mL刻度玻璃试管，放入石墨消解仪继续加热至近干，不可蒸干。再加6 mol/L盐酸5.0 mL，90 ℃继续加热至溶液无色透明或略带黄色，将六价硒还原为四价硒，此阶段约需30 min。冷却，用去离子水定容至25 mL，摇匀备用。同时做空白实验。

1.3.3 标准溶液的配制

用8%盐酸溶液将100 mg/L硒标准溶液逐级稀释成100 μg/L的硒标准应用液。分别取0、0.10、0.20、0.50、1.0 mL标准应用液于10 mL比色管中，用8%盐酸溶液定容至刻度，混匀，制成标准工作溶液，标准溶液现用现配。

1.3.4 样品分析

在仪器工作条件下，以盐酸溶液作为载流，以硼氢化钾溶液作还原剂，分别对标准溶液、空白溶液和样品溶液进行测定。如样品溶液需稀释，适当补加盐酸。

2 结果与分析

2.1 KBH4-NaOH溶液质量浓度的选择

KBH4是使Se还原并生成H2Se的还原剂，若质量浓度过低，则还原不完全，从而导致分析结果偏低；反之，则会生成大量的氢气而降低测试灵敏度，实验发现当KBH4质量浓度达5 g/100 mL时，荧光值为零，为此，考察了KBH4质量浓度对硒荧光强度的影响。配制一系列不同质量浓度的KBH4溶液（均含0.5 g/100 mL NaOH溶液），使其质量浓度分别为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 g/100 mL，考察对2.0 μg/L的硒标准溶液荧光强度的影响，结果见图l。结果表明，荧光强度随KBH4质量浓度的增加先增加后降低，当质量浓度约为1.0 g/100 mL时，荧光强度达到最大值。故选用1.0 g/100 mL KBH4-0.5 g/100 mL NaOH溶液作还原剂。

图 1 KBH4质量浓度对硒荧光强度的影响

Fig.1 Effect of KBH4 concentration on fluorescence intensity of selenium

2.2 载流溶液体积分数的选择

图 2 盐酸体积分数对硒荧光强度的影响

Fig.2 Effect of HCl concentration on fluorescence intensity of selenium

配制不同体积分数的盐酸（浓盐酸基础上稀释）溶液作为载流，考察对2.0 μg/L硒标准溶液荧光强度的影响。图2表明，荧光强度随着盐酸体积分数的增大先增大后趋于稳定，盐酸体积分数在3%～15%之间荧光强度变化不大。盐酸体积分数过高会腐蚀原子荧光仪的塑料胶管，导致接口密封不好或漏液，体积分数太低会影响方法的灵敏度和精密度，本实验选择体积分数为8%盐酸作为载流液。

2.3 预还原条件的选择

乳粉样品中的硒经HNO3-H2O2消解后转变为Se（Ⅵ），Se（Ⅵ）不能直接与KBH4反应生成H2Se。只有将Se（Ⅵ）预还原为Se（Ⅵ）才能进行测定。若Se（Ⅵ）不能被完全预还原为Se（Ⅵ），其测定结果将会偏低。本实验采用以下两种预还原方法：1）在消解后残留液中加浓盐酸5.0 mL[3]，80 ℃加热至溶液体积约1 mL；2）参考GB 5009.93—2010方法，并加以细化。在消解后残留液中加5.0 mL浓度为6 mol/L 盐酸溶液[23]，80 ℃继续加热至溶液体积约1 mL。对一国产婴儿乳粉进行方法比对，结果见表2。精密度的计算参照GB 5009.93—2010[23]，按两次独立测试结果的绝对差值与算术平均值比值计。

表 2 某国产婴儿乳粉中硒的检测（n=2）

Table 2 Comparison of the results obtained by two methods for Se determination in a domestic infant formula (n = 2)

由表2可见，方法1精密度较差，可能是因为反应十分剧烈，飞溅损失导致。此外，两种方法下样品消化液冷却定容后均稍有混浊，可能是预还原温度过低。对实验条件进行改进，方法1加浓盐酸的同时加饱和盐酸羟胺溶液1 mL，将方法1和方法2的预还原温度均升为90 ℃。改进后预还原反应平稳，没有爆沸现象发生，定容后样品消化液均无色澄清。用国家标准物质GBW10017（GSB-8 乳粉）对改进后的两种预还原方法进行比对测试，结果见表3。由表3可见，两种方法下硒的检测结果均在标示值（0.11±0.03） mg/kg范围之内，相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）均小于10%，方
法1加入盐酸羟胺后消除了反应爆沸现象，具体反应机理还有待考究，但盐酸羟胺有毒和有腐蚀性，故选用方法2进行预还原。

表 3 乳粉标物中硒的检测（n=2）

Table 3 Comparison of the results obtained by two methods for Se determination in certified standard reference material (n = 2)

2.4 铁氰化钾的影响

GB 5009.93—2010[23]及文献[14-16]报道均采用铁氰化钾作掩蔽剂，本实验参照GB 5009.93—2010第一法中的微波消解后加铁氰化钾做掩蔽剂对4 个进口婴儿配方乳粉及乳粉标物进行硒含量的测试（n=2），同时进行不加铁氰化钾做掩蔽剂的测试，结果见表4。数据经SPSS 17.0配对设计t检验，两种方法的测定结果无显著性差异
（P＞0.05）。本方法选择不加铁氰化钾，与吴庆晖等[4]用原子荧光光谱法测定食用菌中硒的研究结果一致。

婴儿配方乳粉中存在的主要基体元素是钾、钙、钠、镁、锌、铁等。钠、钾、钙的含量约为硒含量的10 000～20 000 倍，镁的含量约为硒含量的3 000 倍，铁、锌含量约为硒含量的200 倍，与标物中基体元素含量基本一致。实验证明这些共存离子的存在对硒含量的测定无干扰，原因可能是在氢化物反应过程中，被测元素以硒化氢气体的形式从被测溶液中分离，这种气液分离方式有效地避免了样品中共存元素的干扰。

表 4 铁氰化钾掩蔽剂对硒含量的影响

Table 4 Effect of potassium ferricyanide content on the determination of selenium content

2.5 样品消化液及KBH4还原剂放置时间的影响

图 3 样品消化液室温放置时间对硒检测结果影响

Fig.3 Effect of reserving time of the digestion solution on the test result of selenium

将2.3节中乳粉标物微波消化液室温分别存放1、2、3、4、6 d，分别进行硒含量的测定，检测结果见图3。由图3可见，样品消化液室温存放第1～3天硒的检测结果基本稳定，第4天会明显降低。原因可能为：在本实验的酸性条件下，硒离子在前3 d内不会被盛放的玻璃试管吸附，或吸附与解吸平衡，第4天吸附量超过了解吸量，导致硒含量降低。1.0 g/100 mL KBH4-0.5 g/100 mL NaOH溶液作为还原剂0～4 ℃冷藏保存1 周内（从冰箱拿出一定量当天使用，不再重复冷藏），分别在第1、2、3、4、5、6、7天进行硒工作曲线绘制，相关系数均大于0.999，且对应的质量浓度点荧光强度基本不变，即冷藏、避光保存条件下，1.0 g/100 mL KBH4-0.5 g/100 mL NaOH溶液作为还原剂至少1 周内不会分解致质量浓度有较大变化。

2.6 标准工作曲线和方法检出限

在最佳消解及测试条件下，对1.3.3节标准溶液进行测定，并绘制工作曲线，线性回归方程和相关系数为：I=38.440 4C＋1.362 7，r=1.000 0。对样品空白溶液连续测定11 次，按测定结果的3 倍标准偏差对应的质量浓度计算方法检出限，检出限为0.084 ng/mL。

2.7 方法的重复性实验和加标回收实验

准确称取某品牌进口婴儿配方乳粉12 份，其中6 份进行重复性实验，另外6 份进行3 个水平两平行加标回收实验，加标量及检测结果见表5和表6。按1.3节进行样品预处理，同时做空白实验，上机测定。该方法的RSD为2.9%，加标回收率为90.4%～109%。

表 5 重复性实验

Table 5 Repeatability (RSD)

表 6 加标回收率实验（n=2）

Table 6 Spiked recovery and RSD (n = 2)

3 结 论

本实验建立了微波消解-氢化物发生原子荧光法测定婴儿配方乳粉中硒含量的方法。对还原剂、载流、预还原条件、铁氰化钾掩蔽效果、样品消化液和还原剂存放时间这些条件因素进行了研究。实验用t检验统计学方法证明GB 5009.93—2010中铁氰化钾不具有掩蔽效果，铁氰化钾是一种强氧化剂，有毒，与酸反应生成极毒气体，对操作人员健康及环境有较大危害。本方法不采用铁氰化钾做掩蔽剂，简化了操作流程，提高了工作效率，适于批量样品中硒含量的检测，减少了对操作人员和环境的危害。

实验还证明乳粉标物消化液室温可存放3 d，硼氢化钾还原剂0～4 ℃避光保存，有效期至少1 周。本实验具有三大意义：1）当大批样品消化后无法短时间内完成检测或仪器突发故障样品消解液需延时检测等意外情况发生时，可对检测数据的准确性进行合理评估。2）GB 5009.93—2010中没有对样品消解液有效检测时间及还原剂的有效保存期进行明确规定，本实验对国家标准的相关内容进行了一定补充；3）一次可配制足用1 周的硼氢化钾还原剂，不必现用现配，具有高效、节俭和环保的意义。

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