高效液相色谱法测定辣椒粉中碱性橙的
不确定度评定

张金艳，胡丽芳，李伟红，郭孝培，罗林广*

（江西省农业科学院农产品质量安全重点实验室，农产品质量安全与标准研究所，江西 南昌 330200）

摘 要：为分析高效液相色谱法测定辣椒粉中碱性橙含量的不确定度，采用JJF 1135—2005《化学分析测量不确定度评定》进行评定。依据检测方法建立数学模型，分析不确定度的重要来源，其中标准溶液配制产生的不确定度是0.008 3，最小二乘法拟合标准曲线校准产生的不确定度是0.056，样品称量带来的不确定度是0.002 5，样品定容带来的不确定度是0.005 0，样品处理过程带来的不确定度是0.012，结果的重复性带来的不确定度是0.022。对各不确定度分量进行分析计算和合成不确定度，通过乘以95%概率下的扩展因子2，获得加标辣椒样品中碱性橙含量测定结果是（30±3.73） mg/kg，最小二乘法拟合标准曲线对测定结果的影响最大，其次样品处理过程和结果的重复性带来的不确定度也不容忽略。

关键词：高效液相色谱法；辣椒粉；碱性橙；不确定评定

Uncertainty Evaluation for the Determination of Basic Orange in Chili Powder by High Performance Liquid Chromatography

ZHANG Jin-yan, HU Li-fang, LI Wei-hong, GUO Xiao-pei, LUO Lin-guang*

(Key Laboratory of Quality and Safety of Agricultural Products, Agricultural Product Quality Safety and Standards Institute,

Jiangxi Academy of Agricultural Sciences, Nanchang 330200, China)

Abstract: Based on Evaluation of Uncertainty in Chemical Analysis Measurement, the uncertainties in the determination of basic orange in chili powder by HPLC were evaluated. According to the developed mathematic model, the sources of uncertainty were analyzed. The uncertainty components affecting the results were evaluated. The uncertainties from the preparation of standard solution, the calibration of the standard curve fitted by least square regression, the measurement of the sample weight, the adjustment of the sample volume, sample treatment, and the repeatability of the results were 0.008 3,
0.056, 0.002 5, 0.005 0, 0.012, and 0.022, respectively. The content of basic orange in spiked chili powder was (30 ± 3.73) mg/kg as obtained by multiplying the combined uncertainty from the uncertainty components by the expansion factor 2 at 95% possibility. It was also found that the uncertainty from the standard curve fitted by least square regression had the largest effect on the results, and the uncertainties from sample treatment and the repeatability of the results could not be overlooked.

Key words: high performance liquid chromatography; chili powder; basic orange; uncertainty evaluation

中图分类号：O06；TS207.3 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）20-0213-04

doi:10.7506/spkx1002-6630-201420042

碱性橙是一种偶氮类碱性工业染料，俗名王金黄[1]。主要用于棉制品、丝制品及其皮革等物品的印花和染色[2]。根据美国卫生研究所化学品安全与健康数据库资料表明：摄取、吸入、以及皮肤接触该物质，均会发生急性和慢性中毒伤害[3-4]。该染料碱性条件下与蛋白质有较强的吸附作用，比食用色素更易给食品染色，染色后色泽鲜艳且不易褪色，价格又较低廉，因此常被一些不法食品加工商用来对辣椒制品等食品进行染色[5-10]，该染料具有致畸性和致突变性[11-15]，危害到人体健康，被严禁作为食品添加剂使用[16-17]。

测量结果的不确定度是评价一种测量方法能力优劣的指征，并与测量结果相联系的参数[18-20]，它能对检测数据进行客观真实的评价，给出测量结果的可信程度[21-22]。高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法是检测食品中碱性橙常用的方法，在其分析过程中操作步骤比较复杂，影响因素较多，因此给出具有置信概率的检测结果，掌握对检测结果有较大影响的关键因素，是实施内部质量控制的重要工作内容，本实验根据GB/T 23496—2009《食品中禁用物质的检测：碱性橙染料：高效液相色谱法》[23]对采用HPLC法测定辣椒粉中的碱性橙过程中的不确定度来源进行全面分析，并最终给出评定结果。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

辣椒粉 市购；碱性橙（99%） 阿达玛斯试剂有限公司；甲醇、乙醇、乙酸铵（均为优级纯） 德国Merck公司。

2690型液相色谱仪（配有可变波长紫外检测器） 美国Waters公司；FA1104N电子天平 上海天平仪器厂。

1.2 方法

1.2.1 测试过程

样品处理过程及HPLC条件按GB/T 23496—2009《食品中禁用物质的检测：碱性橙染料：高效液相色谱法》执行[23]，辣椒粉试样中的碱性橙用无水乙醇提取、浓缩、定容，HPLC-紫外检测器测定，外标法定量。称取20.0 g样品，置于50 mL离心管中，加5 g无水硫酸钠，25 mL无水乙醇超声提取30 min，3 000 r/min、离心10 min，将上层提取清液置于离心管中，再次加入10 mL无水乙醇，重复提取3 次，合并提取液，3 000 r/min、离心10 min，将上层提取清液倾倒于圆底烧瓶中，于40 ℃减压浓缩至近干，用无水乙醇溶解并转移到刻度试管中，在50 ℃条件下氮气吹干，定容至2 mL；滤膜过滤后待进样。采用C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 mm）；流动相：甲醇-（20 mmol/L）乙酸铵（65∶35，V/V）；流速：1.0 mL/min；柱温：室温；进样量：20 mL。

1.2.2 建立数学模型

（1）

式中：ω为样品中碱性橙染料的含量/（mg/kg）；C为从标准曲线得到的碱性橙的质量浓度/（mg/mL）；V为样品的最终定容体积/mL；m为样品的质量/g。

2 结果与分析

2.1 不确定度分量的主要来源及其分项评定

从测量方法可以看出，引入不确定因素主要有标准溶液的配制、标准曲线的校准、样品称量、样品定容、样品的处理过程、结果的重复性等，且数学模型都是积和商的模型，同时各影响因素相互独立，则合成的标准不确定度表征为：

（2）

2.1.1 标准溶液配制产生的不确定度分析

碱性橙标准溶液的计算公式（3）所示：

（3）

式中：m为碱性橙标准品的质量/g；P为碱性橙标准品的纯度（99±1）%；V100为100 mL容量瓶的体积/mL；f为稀释因子；Cstd为碱性橙标准溶液的质量浓度/（g/mL）。

则合成标准不确定度为：

（4）

2.1.1.1 标准品称量引入的不确定度

天平称量重现性属于A类不确定度，根据检定证书，实验用FA1104N电子天平的不确定度为0.1 mg，包含因子k=2，因此引入的不确定度为：

（5）

2.1.1.2 标准品纯度引入的不确定

碱性橙纯度按照其试剂瓶上的标签给出的含量为（99±1）%，按照B类不确定度进行评定，不确定度半宽A1=1%，可认为服从均匀分布，则：

（6）

2.1.1.3 配制100 mL标准品溶液体积的不确定度

100 mL容量瓶的标准不确定度来源有容量瓶的校准、重复性、温度的变化及其人员的读数。

1）容量瓶校准引入的不确定度，根据JJG 196—2006《常用玻璃量器检定规程》[24]给出100 mL容量瓶（A）级容量允差为（±0.1）mL，容量允差包括体积校准、重复性和人员读数，按照均匀分布进行B类不确定度评定为：

（7）

2）温度引入的不确定度，使用温度与校正温度之间的差异会引入不确定度分量，甲醇的体积膨胀系数为14.3×10—4 ℃，实验室室温在（±5）℃之间变动，按照均匀分布进行B类不确定度评定，则温度差异引入的不确定度为：

（8）

（9）

2.1.1.4 稀释过程稀释因子带来的不确定度

采用最小二乘法计算溶液中的质量浓度，使用最小二乘法拟合的前提是假定做工作曲线的标准溶液质量浓度的不确定度的影响可以忽略，故稀释过程只考虑10 mL的移液管和100 mL的容量瓶。2种稀释方法的标准不确定度来源有校正、重复性、温度、读数。10 mL的移液管的标准不确定度来源为：

1）根据JJG 196—2006《常用玻璃量器检定规程》规定，10 mL的移液管容量允差为±0.020 mL，按照均匀分布进行B类不确定度评定，则：

（10）

2）温度引入的不确定度参见2.1.1.3节公式（8），则：

（11）

3）100 mL容量瓶引入的不确定度与分析2.1.1.3节相同，Urel（V100）=0.004 168。

1∶100稀释使用10 mL的移液管和100 mL的容量瓶来完成，则：

（12）

则碱性橙标准溶液的相对标准不确定度为：

（13）

2.1.2 最小二乘法拟合标准曲线校准产生的不确定度

为校准液相色谱仪，采用6 个质量浓度水平的碱性橙标准工作液，得到相应的峰面积A，用最小二乘法拟合得直线方程A=32.8C＋0.7，相关系数r2=0.996。该过程不确定度的评定同样属于A类不确定度评定，本次评定对样品溶液进行了6 次测量，具体详见表1。

表 1 最小二乘法拟合标准曲线数据

Table 1 Experimental data for the calibration curve created by
linear least squares fitting

碱性橙的标准不确定度计算过程如下：

（14）

（15）

（16）

式中：SR为回归曲线的剩余标准差；A0i为各标准液的实际峰响应值；a＋bC0i为根据回归曲线计算出来的理论值；n为回归曲线的点数；p为待测样品的重复测定次数；

为待测样品质量浓度的平均值；

0为回归曲线的各点质量浓度的平均值；C0i为各标准液质量浓度。

2.1.3 样品称量带来的标准不确定度

样品称量带来的相对标准不确定度分析与2.1.1.1节相同。

（17）

2.1.4 样品定容带来的标准不确定度

样品定容用1 mL的可调移液器，则来源有校准、重复性、温度、人员读数。

1）根据JJG 646—2006《移液器检定规程》规定，1 mL的可调移液器吸取1 mL容量允差为（±1.0）%，容量允差包括体积校准、重复性和人员读数，按照均匀分布进行B类不确定度评定。

（18）

2）温度引入的不确定度，按照均匀分布进B类不确定度评定，参见2.1.1.3节，则：

（19）

（20）

2.1.5 样品处理过程差异带来的标准不确定度

样品测试的回收率，主要取决于取样的均匀性、操作人员的熟练程度、提取效率等多种因素，采用A类方法进行评定，按标准方法做了加标回收率，对加标辣椒样品（加标量为30 mg/kg）进行重复6 次测定，其结果回收参数见表2，样品处理过程带来的标准不确定度。

表 2 样品回收率测定参数

Table 2 Spiked recoveries

（21）

2.1.6 结果的重复性带来的不确定度

在重复性条件下，对样品进行了6 次独立的测试，测得辣椒粉中碱性橙含量的标准不确定度分析按照A类不确定度进行评定：

（22）

（23）

则6 次添加检测结果ω 1～6分别为25.8、27.4、26.0、27.0、26.3、27.7 mg/kg；

为26.7 mg/kg，则urel（

算）=
0.022。

2.2 计算合成不确定、扩展不确定度及报告不确定度

因各不确定度分量相互独立，故加标辣椒样品中碱性橙测定结果的合成的标准不确定度为：

（24）

（25）

则合成不确定度为U（CX）＝ω×Urel（CX）=
1.863 mg/kg。在置信概率为95%，包含因子k=2，则扩展不确定度为k×U（CX）＝3.73 mg/kg，因此本实验加标辣椒样品中的碱性橙残留量的测定结果为（30±3.73）mg/kg。

2.3 评定结果分析

图 1 各分量不确定度直方图

Fig.1 Histogram of relative uncertainty components

由图1可以看出，在重复性实验条件下测定辣椒粉中的碱性橙时，urel（C）、urel（frep）、urel（

算）是造成测定结果不确定度的主要分量，其中样品称量和样品定容过程所带来的不确定度可忽略不计，而拟合标准工作曲线（峰面积）引入的不确定值最大。要降低这一贡献值，首先在实际的测定过程中，严格控制影响外标法定量和重复测量过程中的各种影响因素，如保证仪器处于最佳的状态，待在基线相当平稳以后进行，从而获得最好的测量结果，此外在检测的过程中应尽量提高实验结果的平行性，以保证结果的准确可靠。

3 结 论

HPLC法测定辣椒粉中碱性橙含量的不确定度的贡献从大到小依次是最小二乘法拟合标准曲线带来的不确定度，结果的重复性测定带来不确定度、样品处理过程带来不确定度、标准溶液配制带来的不确定、样品定容过程带来的不确定度、样品称量过程带来的不确定度。

参考文献：

[1] International Agency for Research on Cancer. Monographs on the evaluation of carcinogenic risk to humans, supplement 7: overall evaluations of carcino-genicity: an updating of IARC monographs[R]. Lyon: IARC, 1987.

[2] 林钦, 郑小严, 何树坤, 等. 高效液相色谱法同时检测食品中的碱性橙、碱性嫩黄O和碱性桃红T染料含量[J]. 食品科学, 2009, 30(14): 194-196.

[3] FAMER J J, ASBURY M A, HICKMAN F W, et al. Entero bacter skazakii: a new species of “Enter obacteriaceae” isolated form clinical specimens[J]. International Journal of SystBacterio, 1980, 30: 569-584.

[4] ADRIAN S, MARIE-GABRIELLE O, JAN-OLAF G. Changing incidence of gastric and oesophageal cancer subtypes in central Switzerland between 1982 and 2007[J]. European Journal of Epidemiology, 2009, 24(10): 603-609.

[5] 曹鹏, 乔旭光, 娄喜山, 等. 固相萃取结合超高效液相色谱-串联质谱法同时检测食品中的6 种工业染料[J]. 分析化学, 2011, 39(11): 1670-1675.

[6] 林黛琴, 万承波, 邱萍, 等. 液相色谱-串联质谱法快速测定食品中4 种黄色工业染料[J]. 质谱学报, 2013, 34(3): 170-177.

[7] 卢士英, 邹明强. 食品中常见的非食用色素的危害与检测[J]. 中国仪器仪表, 2009, 8(7): 45-50.

[8] 文红. 食品中禁用物质: 碱性橙染料国家标准检测方法的研制[D]. 武汉: 华中农业大学, 2009.

[9] 王翔. N-亚硝胺化合物和非法食品添加剂碱性橙Ⅱ的GC/MS检测方法研究[D]. 上海: 复旦大学, 2009.

[10] 汪丽娜, 陈小珍, 莫卫民, 等. 碱性橙21、22和罗丹明B的多级质谱裂解规律探析[J]. 质谱学报, 2013, 34(2): 96-109.

[11] 杨琳, 陈青俊, 梁晶晶, 等. 高效液相色谱法测定辣椒制品中的碱性橙和碱性玫瑰精含量[J]. 食品科学, 2012, 33(24): 303-306.

[12] 林赛君, 屠海云, 孙岚, 等. 高效液相色谱-串联质谱法同时测定食品中五种黄色化工染料[J]. 色谱, 2011, 29(1): 79-82.

[13] 朱晓军, 颜春荣, 董璨, 等. 固相萃取-液质联用同时检测豆制品中4 种红黄色系工业染料[J]. 食品安全质量检测学报, 2012, 3(3): 190-194.

[14] 夏立娅, 韩媛媛, 匡林鹤, 等. 薄层色谱扫描法同时检测豆制品中碱性橙、皂黄、柠檬黄和日落黄以及辣椒粉中酸性橙Ⅱ、丽春红2R和罗丹明B[J]. 分析实验室, 2010, 29(6): 15-18.

[15] 刘小川, 李永刚, 刘潇, 等. 固相分散-液相色谱质谱联用法检测辣椒粉中的碱性橙和碱性玫瑰精[J]. 食品安全质量检测学报, 2014, 5(2): 492-496.

[16] 卫生部. GB 2760—2011 食品添加剂使用标准[S]. 北京: 中国标准出版社, 2011.

[17] 卫生部. 食品中可能违法添加的非食用物质和易滥用的食品添加剂名单(第1～5批汇总)[EB/OL]. (2011-04-27) [2014-01-21]. http://www.bioon.com/bioindustry/foods/481964.shtml.

[18] 曹宏燕. 分析测试中测量不确定度及评定第三部分: 分析测试中主要不确定度分量的评定[J]. 冶金分析, 2005, 25(3): 82-87.

[19] 王承忠. 测量不确定度原理及在理化检验中的应用[J]. 理化检验: 物理分册, 2003, 39(1): 57-60.

[20] 李慎安. 测量不确定度表达百问[M]. 北京: 中国计量出版社, 2000: 99-104.

[21] 国家质量技术监督局计量司组. 测量不确定度评定与表示指南[M]. 北京: 中国计量出版社, 2005: 1-25

[23] 中国国家标准化管理委员会. GB/T 23496—2009 食品中禁用物质的检测: 碱性橙染料: 高效液相色谱法[S]. 北京: 中国标准出版社, 2009.

[24] 中国国家标准化管理委员会. JJG 96—2006 常用玻璃量器检定规程[S]. 北京: 中国标准出版社, 2006.