茶叶和饮料中咖啡因的快速电化学测定

陈立新1，江 帆2，党丽敏1，周 原1

（1.湖南工程学院化学化工学院，湖南 湘潭 411104；2.深圳出入境检验检疫局工业品检测技术中心，广州 深圳 518067）

摘 要：应用电化学方法在玻碳电极对茶叶和饮料中的咖啡因进行测定研究。讨论不同环境底液及其pH值、扫描速度、静止时间对峰电流的影响，并研究电化学检测咖啡因的重复性、稳定性和干扰实验。结果发现，咖啡因在pH 6.60的磷酸二氢钠-磷酸氢二钾缓冲底液中于＋1.486 V左右产生一个明显的氧化峰。方波伏安法和差分脉冲伏安法的线性范围分别为2.0×10－6～2.0×10－3、1.8×10－6～1.0×10－3 mol/L，检出限分别为3.0×10－7、
5.0×10－6 mol/L。该方法可快速测定茶叶盒饮料中的咖啡因，简单高效。

关键词：咖啡因；循环伏安法；差分脉冲伏安法；方波伏安法；玻碳电极

Rapid Analysis of Caffeine in Tea and Drink by Electrochemical Method

CHEN Li-xin1, JIANG Fan2, DANG Li-min1, ZHOU Yuan1

(1. College of Chemistry and Chemical Engineering, Hunan Institute of Engineering, Xiangtan 411104, China;

2. Testing and Technology Centre of Industrial Products, Shenzhen Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Shenzhen 518067, China)

Abstract: A rapid method for the determination of caffeine in tea and drink has been established. Cyclic voltammetry (CV), square wave voltammetry (SWV) and differential pulse voltammetry (DPV) were used to investigate the electrochemical behavior of caffeine at a glassy carbon electrode. The caffeine showed a sensitive oxidation peak at + 1.486 V using CV in a NaH2PO4-K2HPO4 buffer solution at pH 6.60. The impacts of buffer solution, pH, accumulation time and scan rate were discussed. The peak current was linear to caffeine concentration ranging from 2.0 × 10-6 to 2.0 × 10-3 mol/L with a detection limit of 3.0 × 10-7 mol/L by SWV, and ranging from 1.8 × 10-6 to 1.0 × 10-3 mol/L with a detection limit of
5.0 × 10-6 mol/L by DPV. In addition to satisfactory reproducibility and reversibility, the methods exhibited sufficient selectivity and thus were suitable for rapid determination of caffeine in tea and drink．

Key words: caffeine; cyclic voltammetry; differential pulse voltammetry; square wave voltammetry; glassy carbon electrode

中图分类号：O657.1 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）20-0220-04

doi:10.7506/spkx1002-6630-201420044

咖啡因又称咖啡碱，是一种嘌呤类生物碱，最早是从茶叶、咖啡豆中提炼出来的一种生物碱，具有祛除疲劳、兴奋神经的作用，临床上用于治疗神经衰弱和昏迷复苏，也作为一种添加剂广泛应用于多种食品和饮料中。但长期过量摄取咖啡因对人体的健康不利，有可能引发心脏疾病，且会对人体体内钙平衡产生不利影响。由于目前功能性饮料比较流行，特别是青少年常常过度饮用，因此普及健康消费习惯有重要意义。咖啡因的测定方法已经有较多报道，除了国家标准分析方法外，主要有液相色谱法[1-11]、气相色谱法[12]、气质联用[13]、毛细管电泳和电色谱[14-15]、薄层色谱法[16]、超临界流体色谱法[17]、紫外光度法[18-20]等，这些方法要么操作较繁琐、测定周期长，要么需复杂昂贵的仪器，分析成本高。本实验提出了一种咖啡因的电化学分析方法，在磷酸二氢钠-磷酸氢二钾溶液中，用循环伏安（cyclic voltammetry，CV）法和差分脉冲伏安（differential pulse voltammetry，DPV）法、方波伏安（square wave voltammetry，SWV）法在玻碳电极（glassy carbon electrode，GCE）上对咖啡因含量进行电化学分析，并初步探讨电极反应过程和机理。该方法操作简单、方便、灵敏高效，而且耗费试剂少、分析时间短、成本低、绿色环保，可用于食品和饮料中咖啡因的含量测定。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

各种饮料、茶叶 市售；咖啡因 石家庄制药集团新诺威制药有限公司；其他试剂均为分析纯，实验用水均为二次蒸馏水。

1.2 仪器与设备

CHI660电化学工作站（采用三电极系统：玻碳电极（工作电极）、铂丝电极（对电极）、饱和甘汞电极（参比电极）） 上海晨华仪器有限公司；pHS-3C型酸度计 上海精密科学仪器有限公司雷磁仪器厂；AL104电子天平 梅特勒-托利多股份有限公司；KQ-100B超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液配制和样品处理

精密称取咖啡因标准品100.0 mg，以三氯甲烷定容于100 mL容量瓶中，制得咖啡因储备液，储藏于冰箱中，用时稀释成所需浓度。

将0.3 mol/L的磷酸二氢钠和0.2 mol/L的磷酸氢二钾溶液按体积比3∶5混合，制得pH 6.60的磷酸二氢钠-磷酸氢二钾缓冲溶液，以此为测试底液。

茶叶中咖啡因的提取：取干燥茶叶研碎，精密称量1.00 g于100 mL锥形瓶中，加50 mL沸水，用超声波清洗器在50 ℃左右振荡20 min，冷却后过滤备用。

饮料中咖啡因的提取：取饮料样品20 mL于100 mL烧杯中，微温振荡，除CO2；用氢氧化钠溶液调pH值为7.00左右，再用三氯甲烷20 mL分3 次萃取，萃取液置于100 mL容量瓶中，用三氯甲烷定容，制得样品溶液。

1.3.2 电极的处理

先使用0.3 μm的Al2O3粉末将GCE表面抛光，然后浸泡在蒸馏水中超声清洗10 min。静止时间设为5 s，然后在pH 6.60的磷酸二氢钠-磷酸氢二钾测试底液中于0～1.8 V范围内循环扫描至获得稳定的循环伏安图为止，电极电位稳定后，清洗备用。

1.3.3 CV测试

在pH 6.60的磷酸二氢钠-磷酸氢二钾缓冲溶液中，每次加入不同浓度的咖啡因溶液，静止时间设为5 s，扫描速率设为100 mV/s，记录CV曲线，用CV进行电化学行为特性研究。每次扫描结束后用二次蒸馏水冲洗电极后擦干，用0.3 μm的Al2O3粉末将电极表面抛光打磨，再冲洗后做下一次扫描，以保持电极的稳定性和重复性。

1.3.4 SWV和DPV测试

SWV振幅40 mV、频率60 Hz、电位增量4 MV，电位范围为0～1.8 V；DPV富集时间为10 s；脉冲幅度为200 mV，脉冲宽度为50 ms，电位范围为0～1.8 V。在上述选定条件下，咖啡因的峰形较好且峰电流最大。每次测试分别记录SWV曲线和DPV曲线。为保持电极的稳定性和重复性，扫描结束冲洗电极，抛光打磨后再冲洗做下一次扫描。

2 结果与分析

2.1 咖啡因的电化学特性

在pH 6.60的磷酸二氢钠-磷酸氢二钾缓冲溶液中对一定浓度的咖啡因进行CV、SWV、DPV扫描。由CV可知（图1），咖啡因在＋1.486 V处有一氧化峰，而无还原峰，说明咖啡因在电极上的反应为不可逆氧化过程。

A. 5.0×10－4 mol/L；B. 3.0×10－4 mol/L；
C. 1.5×10－4 mol/L；D. 1.0×10－4 mol/L。下同。

图 1 咖啡因CV曲线

Fig.1 Cyclic voltammograms of caffeine

在磷酸二氢钠-磷酸氢二钾缓冲溶液（pH 6.60）中，对浓度为5.0×10－4、3.0×10－4、1.5×10－4、1.0×10－4 mol/L
的咖啡因溶液分别进行DPV和SWV扫描，扫描区间0～
－1.8 V、扫描速率100 mV/s、静止时间5 s，其DPV曲线和SWV曲线见图2、3，咖啡因在＋1.46 V左右处均有一个明显的氧化峰，可用DPV、SWV方法测定咖啡因的含量。

图 2 咖啡因DPV曲线

Fig.2 Differential pulse voltammograms of caffeine

图 3 咖啡因SWV曲线

Fig.3 Square wave voltammograms of caffeine

2.2 缓冲体系对咖啡因氧化峰电流的影响

考察咖啡因在不同底液中的电化学特性，所选择底液为：0.1 mol/L甲酸-甲酸钠缓冲液（pH 4）、HCl-KCl（pH 4）、Britton-Robinson缓冲溶液（pH 2.28）、氯化铵-氨水缓冲液（pH 9）、HCl-KCl-30%甲醇（pH 3）、醋酸-醋酸钠缓冲液（pH 3.6）、磷酸盐-硼酸盐溶液（pH 4）、磷酸二氢钠-磷酸氢二钾缓冲溶液（pH 6.60）。结果发现在磷酸二氢钠-磷酸氢二钾缓冲溶液中咖啡因的谱图氧化峰峰形较好，且氧化峰电流较高。因此，本实验以磷酸二氢钠-磷酸氢二钾缓冲溶液作底液，对咖啡因进行测定。

2.3 扫描速率、静止时间的影响

通过对5.0×10－4 mol/L的咖啡因溶液进行CV扫描来考察实验中扫速对峰电流、峰电位的影响。结果显示，随扫描速率v的增大，峰电位Ep也随之正向增大。在10～400 mV/s范围内，Ep与扫描速率的自然对数（lnv）的线性较好，其线性方程Ep/v=1.3845＋0.018lnv，r2=0.976 5。并且峰电流ip也随扫描速率的增大而增大，在较低扫描速率（10～200 mV/s）条件下，ip与扫描速率v的线性方程为ip（10－4）=－1.863－0.0476v，r2=0.990 2；在较高扫描速率（200～300 mV/s）条件下，ip与扫描速率的平方根v1/2呈较好的线性关系，其线性方程为ip（10－4）=－1.9851－0.01692v1/2，r2=0.986 4。上述实验表明咖啡因在电极反应中低扫描速率主要是吸附过程，而在高扫描速率条件下电极过程主要是受扩散控制的。故测定的扫描速率选为100 mV/s。静止时间影响不大，对峰电流和峰电位均无明显影响，实验中静止时间设置为5s。

2.4 pH值的影响

用不同pH值的磷酸二氢钠-磷酸氢二钾缓冲溶液作底液，研究pH值对咖啡因的峰电位的影响，实验结果表明，随着溶液pH值的增加，峰电位负向移动，但同时峰电流有减小趋势。在4.00≤pH≤8.65范围内，pH值与峰电位呈线性相关，其线性方程为Ep=1.501 8－0.038 6 pH，r2=0.983 6。所以，本实验在室温25 ℃左右，选择pH 6.60的磷酸二氢钠-磷酸氢二钾缓冲液为测试底液效果较佳。

2.5 重复性和稳定性

在所选定的实验条件下，采用CV法对浓度为5.0×10－4 mol/L的咖啡因进行了8 次平行测定，每次测定后均打磨处理电极，峰电流的相对标注偏差（relative standard deviation，RSD）为1.2%。对上述溶液连续扫描20 圈，峰电流的RSD为4.5%数值较大应该是电极表面吸附了待测物。上述实验结果显示电极具有很好的重复性。实验也表明，处理好的样品溶液和制备的咖啡因标液放置24 h后再测定，其峰高和峰电位与初次测定均无明显变化，且无杂质峰，显示了该方法很好的稳定性。

2.6 干扰物的影响

为考察相关干扰物的影响，在实验测定条件下，分别向浓度为5.0×10－4 mol/L的咖啡因溶液中加
1.0×10－2 mol/L的Ca2＋、Zn2＋、Mg2＋、Fe3＋、C1－、CO32－、SO42－和谷氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、葡萄糖，实验显示对咖啡因的测定均不产生影响。而20 倍浓度的茶碱和抗坏血酸对咖啡因的测定有所影响，考虑到样品咖啡因含量较高的因素，在选定的测试条件下两者不会对实际样品中咖啡因的测试造成明显的影响。说明本方法抗干扰能力较强，具有较好的独特性。

2.7 工作曲线和检出限

在选定的实验条件下，在pH 6.60的磷酸二氢钠-磷酸氢二钾缓冲溶液底液中，SWV法和DPV法的线性范围分别为2.0×10－6～2.0×10－3 mol/L、1.8×10－6～
1.0×10－3 mol/L，根据公式（1）得出，检出限为分别为3.0×10－7、5.0×10－6 mol/L。

DL=3Sb/S （1）

式中：DL为检出限/mol/L；3为置信因子；Sb是背景噪音的标准偏差；S是分析校正曲线的斜率。

2.8 样品中测定及回收率实验

将咖啡因储备液用pH 6.60的磷酸二氢钠-磷酸氢二钾缓冲溶液稀释为所需浓度，分别用SWV法和DPV法测定，结果见表1。样品测试结果见表2，电化学分析方法与紫外方法测定基本一致。本方法测得的平均回收率为102.4%、101.7%，RSD分别为3.6%、2.3%。上述测定结果对弄清样品中特别是功能性饮料中咖啡因的含量有指导意义，可控制咖啡因的摄取量，防止长期过量饮用危害身体健康。

表 1 咖啡因溶液回收率（n=6）

Table 1 Recoveries of caffeine from spiked samples (n=6)

表 2 样品中咖啡因测定结果（n=6）

Table 2 Comparative results obtained by two methods for the determination of caffeine in real samples (n=6)

μg/mL

2.9 机理初步推测

实验结果显示，在低扫速条件下，峰电流ip与扫描速率v成正比，且符合Langmuir吸附等温式：

（2）

式中：n为电子数；F为法拉第常数/（C/mol）；R为气体摩尔常数/（J/（mol•K））；T为开尔文温度/K；Γ为电极表面吸附量/（mol/cm2）；Q为电量/C。

但随着扫描速率渐渐增大，发现ip与v1/2渐呈线性，说明咖啡因电极反应具有速控步骤的特征，在低扫速时以表面吸附为主，在高扫速时以反应速率与扩散传质为主。

参照文献[21]可得不可逆波峰电位Ep方程式：

（3）

式中：E0’为条件电位/V；α为电子转移系数；na为电子数；KS为电子转移速率常数/s－1；DR为扩散系数/（cm2/s）。

又根据：Ep/v=1.3845＋0.0186lnv （4）

由式（3）、（4）可得，从而可求得αna=0.6905。一般来说0.3＜α＜0.7，所以α=0.690 5时，得到na=1，即在电极反应中有1个电子参与反应。

测定咖啡因在磷酸二氢钠-磷酸氢二钾缓冲溶液中pH值对峰电位的影响，实验结果表明：在pH 2～10范围内，随pH值的增大，峰电位向负方向移动，线性回归方程为：Ep=1.501 8－0.038 6 pH。根据Nernst方
程，因为n=1，所以m=0.65≈1，即参与反应的质子数为1。故该反应为单电子、单质子的不可逆氧化反应，推测其反应机理过程见图4。

图 4 电极反应机理

Fig.4 Reaction mechanisms for electrodes

3 结 论

本实验采用电化学分析方法直接测定各种样品中的咖啡因，并对咖啡因的电极反应过程和机理做初步探讨。SWV法和DPV法的线性范围分别为2.0×10－6～
2.0×10－3、1.8×10－6～1.0×10－3 mol/L，检出限分别为3.0×10－7、5.0×10－6 mol/L。与色谱法和光谱法相比，方法快速、操作简单、灵敏高效，成本低廉，绿色环保，适用于各种实际样品中的咖啡因的含量分析。

参考文献：

[1] 唐根源, 吴红京, 吴棱, 等. 等度反相高效液相色谱法测定茶多酚中的儿茶素和咖啡因[J]. 色谱, 2001, 19(3): 233-235.

[2] 帅琴, 龚宇, 杨薇, 等. 反相高效液相色谱法测定可乐、茶叶中的咖啡因[J]. 分析试验室, 2002, 21(1): 68-70.

[3] 卢立泓, 陶建伟, 蔡渝. 微波-萃取高效液相色谱法测定茶叶中儿茶素和咖啡因[J]. 理化检验: 化学分册, 2008, 44(5): 447-449.

[4] 王嘉琦, 贾丽, 夏敏. 液相色谱法测定饮料中咖啡因、可可碱和茶碱[J]. 现代食品科技, 2011, 27(1): 114-116.

[5] 王峰. 超高效液相色谱法(UPLC)快速测定茶饮料中的咖啡因[J]. 食品与发酵工业, 2011, 37(11): 213-215.

[6] 贾巧, 李龙, 孙晓琴, 等. 高效液相色谱法测定五种茶叶中咖啡因含量[J]. 西南科技大学学报, 2011, 6(1): 85-87.

[7] 侯冬岩, 回瑞华, 李铁纯, 等. 高效液相色谱法测定黑茶中咖啡因含量[J]. 食品科学, 2009, 30(20): 283-284.

[8] 张继, 王惠明, 马君义, 等. 高效液相色谱法测定绿茶中茶多酚及咖啡因[J]. 理化检验: 化学分册, 201, 48(3): 312-314.

[9] YUEGANG Z, HAO C, YIWEI D. Simultaneous determination of catechins, caffeine and gallicacids in green, oolong, black and pu-erh teas using HPLC with a photodiode array detector[J]. Talanta, 2002, 57(2): 307-316.

[10] HIDEKI H, ATSUSHI N, TOMOMI U, et al. Rapid determination of caffeine in tea leaves[J]. Journal of Chromatography A, 2002, 942(1/2): 271-273.

[11] 潘正斐. UPLC/S/MS法检测保健食品中的咖啡因、酚酞和西布曲明[J]. 中国热带医学, 2011, 11(9): 1116-1117.

[12] 许庆琴, 杜黎明, 王静平, 等. 气相色谱法直接测定茶叶中的咖啡因和茶碱[J]. 分析科学学报, 2002, 18(6): 520-523.

[13] SHRIVAS K, WU H F. Rapid determination of caffeine in one drop of beverages and foods using drop-to-drop solvent microextraction with gas chromatography/mass spectrometry[J]. Journal of Chromatography A, 2007, 1170(1/2): 9-14.

[14] CHIANAN C, CHIANAN L, JUENGPONG L, et al．Capillary electrophoretic determination of theanine, caffeine, and catechins n fresh tea leaves and oolong tea and their effects on rat neurosphere adhesion and migration[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2003, 51(25): 7495-7503.

[15] INJAC R, SRDJENOVIC B, PRIJATELJ M, et al. Determination of caffeine and associated compounds in food, beverages, natural products, pharmaceuticals, and cosmetics by micellar electrokinetic capillary chromatography[J]. Journal of Chromatographic Science, 2008, 46(2): 137-143.

[16] 赵清岚, 杨静, 白冰, 等. 薄层扫描法同时测定绿茶中的EGCG、ECG和咖啡因[J]. 河南大学学报: 自然科学版, 2009, 39(3): 256-258.

[17] 郭亚东. 茶叶中咖啡因的超临界流体色谱分析[J]. 色谱, 2002, 20(1): 75-78.

[18] 孙延春, 张英. 紫外光谱法测定饮料中的咖啡因含量[J]. 化学研究, 2011, 22(1): 77-79.

[19] 丁明珍, 邹建凯. 离心萃取-紫外光谱法测定可乐饮料中咖啡因的含量[J]. 分析化学, 2008, 36(3): 381-384.

[20] 汪必琴, 郑亚西. 紫外分光光度法测定饮料、巧克力和茶叶中咖啡因含量的研究[J]. 四川师范大学学报: 自然科学版, 2000, 23(3): 309-311.

[21] FRED A. 电化学和电分析化学[M]. 黄慰曾, 译. 北京: 北京大学出版社, 1983: 10-12.