罗丹明B表面分子印迹聚合物制备及其荧光检测

赵 晨，贾光锋，陆文总，倪 原

（西安工业大学电子信息工程学院，陕西 西安 710021）

摘 要：以罗丹明B为模板分子，制备了一种基于氧化硅的表面分子印迹聚合物，并采用扫描电镜对表面分子印迹聚合物的性状进行检测，证明表面分子印迹聚合物是在硅胶表面形成了印迹空穴。同时，使用荧光显微镜检测证明罗丹明B可被表面分子印迹聚合物有效结合和快速洗脱。采用荧光分光度计检测表面分子印迹聚合对底物结合能力和特异性，结果显示，表面印迹聚合物对罗丹明B具有高的识别性能，其Kd值为163.6，而相似物罗丹明6G和丁基罗丹明B分别为50和54.5。该方法与传统罗丹明B检测方法（高效液相色谱-紫外检测法）相比更为灵敏，检测限更低，即0.1 mg/L，可检测出痕量物质。

关键词：表面分子印迹聚合物；罗丹明B ；荧光分光光度计；硅胶；荧光显微镜

Preparation and Fluorescence Microscopic Characterization of Surface Molecularly Imprinted Polymer of Rhodamine B

ZHAO Chen, JIA Guang-feng, LU Wen-zong, NI Yuan

(College of Electronic Information, Xi’an Technological University, Xi’an 710021, China)

Abstract: Poly (methacrylic acid) was grafted onto the surface of bulk SiO2 by solution polymerization to produce a molecularly imprinted polymer with a two-layer PMAA/SiO2 bulk structure (surface molecularly imprinted polymer, SMIP). The morphology of SMIP was characterized by scanning electron microscopy (SEM) and fluorescence microscopy (FM). The SEM image demonstrated that imprinted cavities were formed on the surface of SMIP. The FM image showed that rhodamine B (Rh B) could be combined and eluted quickly and effectively. SMIP had better binding property and selectivity as detected by a fluorescence spectrophotometer. The Kd of Rh B was 163.6, which was higher than that (50 and 54.5, respectively) of Rh 6G and butyl Rh B. Compared with the traditional detection method (HPLC-UV), the molecular imprinting method had better sensitivity and lower detection limit (0.1 mg/L) for trace-level determination of Rh B.

Key words: surface molecular imprinting polymer (SMIP); rhodamine B (Rh B)；fluorescence microscopy; silica gel; fluorescence microscope

中图分类号：TP212.2 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）20-0236-06

doi:10.7506/spkx1002-6630-201420047

罗丹明B是一种鲜桃红色的人工合成染料，在溶液中有强烈的荧光性，用作实验室中细胞染色剂。研究发现罗丹明B具有致癌性，所以罗丹明B在食品等行业的使用被禁止。由于罗丹明B价格低廉，不法商贩为谋取暴利，在食品中添加罗丹明B，因此对食品中添加剂罗丹明B的检测方法的研究已被研究者重视[1-6]。在食品工业中色素添加量小，因此罗丹明B的添加是微量的。通过对食品肉眼观察或气味等简单方法无法判断食品中是否含有罗丹明B。而采用高效液相法检测速度慢，周期长（样品要预处理），成本高，无法满足市场需求。故需要研制一种简便、快速的检测方法，该方法可直接检测，且样品不需处理，检测成本低，且灵敏、快速。

分子印迹技术是一种可对特定物质进行选择性识别和分离的技术。该方法可实现对被检测物质低成本、高特异性的快速检测。目前关于罗丹明B分子印迹法检测已经多有报道[7-11]。本实验采用一种新的分子印迹方法，即设计表面分子印迹聚合物（molecularly imprintied polymer，MIP）。用罗丹明B作为印迹分子（模板分子），硅胶为基质/载体，形成的印迹位点位于硅胶表面，易于印迹分子的结合与洗脱，提高表面分子印迹聚合物的结合率。且根据罗丹明B具有荧光性，可使用荧光分光光度仪对表面分子印迹聚合物的结合能力进行检测，研究发现采用荧光法检测其灵敏性要高于紫外检测方法。且与高效液相色谱法[12]（线性范围是
0.5～50 μg/mL）相比检测限更低。因此，表面分子印迹法是一种有效的检测技术。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

罗丹明B、罗丹明6G、丁基罗丹明B、乙二醇二甲基丙烯酸酯 阿拉丁试剂公司；甲烷磺酸、偶氮二异丁腈 国药集团化学试剂有限公司；甲基丙烯酸 成都市科龙化工试剂厂；乙烯基三乙氧基硅烷 美国Sigma-Alorich公司；乙二醇二缩水甘油醚 梯希爱（上海）化成工业发展有限公司；过硫酸铵 天津市恒兴化学试剂制造有限公司；硅胶（300～400目） 青岛海洋化学公司。实验试剂均为分析纯。

101型电热鼓风干燥箱 北京科伟永兴仪器有限公司；Jobin Yvonn荧光分光光度计 日本Horiba公司；空气浴振荡器 哈尔滨市东明医疗仪器厂；集热式恒温加热磁力搅拌器 郑州长城科工贸有限公司；G2pro扫描电镜 美国Phenom公司；CX41荧光显微镜 日本Olympus公司。

1.2 方法[13]

1.2.1 罗丹明B表面分子印迹聚合物的制备

取10 g硅胶颗粒，用50%甲烷磺酸溶液活化，并用丙酮、去离子水洗去杂质，烘干得活化硅胶。活化硅胶10 g，15 mL乙烯基三乙氧基硅烷（triethoxyvinylsilane，TTS），于200 mL 50%乙醇溶液中，50 ℃水浴反应24 h。得到乙烯基三乙氧基硅烷-硅胶（triethoxyvinylsilane-SiO2，TTS-SiO2）。取3 g TTS-SiO2，10 g甲基丙烯酸（methacrylic acid，MAA）和0.01 g过硫酸铵加入200 mL溶液中，通氮气，在70 ℃条件下反应7 h。用乙醇和蒸馏水洗反应产物，并烘干。得到PMAA/SiO2。且PMAA/SiO2作为非印迹聚合物NIP。最后取1 g PMAA/SiO2和0.191 6 g的罗丹明B于100 mL氯仿溶液中。将混合的溶液在25 ℃条件下搅拌6 h。然后，加入0.1 g交联剂乙二醇二缩水甘油醚（ethylene glycol diglycidyl ether，EGDE），入氮气5 min，在50 ℃条件下反应24 h。得到的产物被洗脱液（甲醇、乙酸、水的体积比为7∶2∶1）和甲醇冲洗去模板分子罗丹明B。然后再60 ℃条件下干燥，获得罗丹明的MIP-PMAA/SiO2。

1.2.2 传统方法制备罗丹明B分子印迹聚合物

采用本体聚合的方法制备分子印迹聚合物，即将0.2 g罗丹明B，0.5 mL MAA，50 mg偶氮二异丁氰（2,2’-azobisisobutyronitrile，AIBN），5.6 mL EGDMA依次加入50 mL的氯仿溶液中，并在室温条件下搅拌10 min。然后，通入氮气5 min，且在60 ℃条件下反应24 h，得到块状聚合物。将块状聚合物研磨成颗粒均匀的粉末。最后用洗脱液（甲醇-乙酸（9∶1，V/V））洗脱分子印迹聚合物中的罗丹明B，即可得传统MIP。

1.2.3 罗丹明B表面分子印迹聚合物性状检测

1.2.3.1 扫描电镜检测

对罗丹明表面分子印迹聚合物、非印迹聚合物进行扫描电镜检测，比较两种物质的扫描电镜图，可知MIP-PMAA/SiO2的表面结构。

1.2.3.2 荧光显微镜检测

对洗脱罗丹明前后的MIP-PMAA/SiO2颗粒进行了荧光显微镜检测，得到荧光显微镜图，对比前后荧光强弱变化可知模板分子是否洗脱。

1.2.4 表面分子印迹聚合物与传统印迹聚合物对罗丹明B的结合率检测

由于罗丹明B具有荧光性，故采用荧光光度计对罗丹明B溶液进行检测。

首先制作罗丹明B氯仿溶液中质量浓度与荧光强度之间的标准曲线。制备0.1、0.2、0.3、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/L的罗丹明B溶液，并检测其荧光强度，制作标准曲线。然后取6 个10 mL离心管，各加入40 mg MIP-PMAA/SiO2或传统MIP，并加入5mL不同质量浓度的罗丹明B溶液（0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.1 mg/L），混合后再振荡器中振荡3h。3 500 r/min离心1.5min，取上清液进行荧光光度计检测，并根据标准曲线得到溶液的质量浓度。最后根据结合率公式（1）计算罗丹明B结合率。并根据公式（2）和（3）计算出分散系数Kd和选择系数k。其中以NIP作为空白对照。

（1）

式（1）中：c1为初始时罗丹明B溶液质量浓度/（mg/L）；c2为平衡时罗丹明B溶液质量浓度/（mg/L）；v为罗丹明B溶液的体积/L；m为MIP-PMAA/SiO2的质量/g；Q为平衡时单位质量MIP-PMAA/SiO2结合的罗丹明B量/（mg/g）。

（2）

（3）

式（2）、（3）中：Kd为表面分子印迹聚合物的分散系数；c2为溶液的平衡时的质量浓度；k为表面分子印迹聚合物的相对系数。

1.2.5 表面分子印迹聚合物对罗丹明B的特异性检测

罗丹明6G和丁基罗丹明B 均是罗丹明B的相似物，其结构类似。是检测中常见的干扰物质。其结构如图1所示。制备6 种不同质量浓度的罗丹明6G和丁基罗丹明B溶液（0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.1 mg/L），并与等量MIP-PMAA/SiO2和NIP振荡3h，使模板分子与聚合物充分结合。离心后，用荧光光度计检测上清液质量浓度。通过公式（1）、（4）、（5）的计算，得到
MIP-PMAA/SiO2和NIP对罗丹明B和相似物结合率Q值、Kd和k值。根据所得结果得到MIP-PMAA/SiO2对罗丹明B的特异性。

图 1 罗丹明B（a）、丁基罗丹明B（b）和罗丹明6G（c）结构示意图

Fig.1 Structures of Rh B (a), butyl Rh B (b) and Rh 6G (c)

（4）

（5）

式（4）、（5）中：Ks为表面分子印迹聚合物的的选择系数；k’为相对选择系数。

Ks和k’都表示了表面分子印迹聚合物对罗丹明B的选择性和特异性。Kd（B）和Kd（X）分别表示罗丹明和相似物的分散系数。

2 结果与分析

2.1 罗丹明B表面分子印迹聚合物表面形态检测

a

b

图 2 表面分子印迹聚合物（a）与硅胶（b）扫描电镜图

Fig.2 SEM images of MIP-PMAA/SiO2 bulks (a) and SiO2 (b)

使用扫描电镜对合成的MIP-PMAA/SiO2和SiO2进行观察，结果如图2所示。硅胶颗粒表面光滑，干净，而表面分子印迹聚合物表面由于MAA发生聚合而形成的聚MAA层。故MIP-PMAA/SiO2表面形成了能过结合罗丹明B的印迹孔穴。

2.2 表面分子印迹聚合物荧光显微镜观察

由于罗丹明B具有荧光性，可使用荧光显微镜可对表面分子印迹聚合物的洗脱模板分子能力进行初步检测。如图3所示，罗丹明B与表面分子印迹聚合物结合后，在荧光显微镜下可看到明显的荧光（图3a），而当用洗脱液洗去罗丹明分子后，荧光基本消失（图3b）。说明制备的表面分子印迹聚合物可有效结合和洗脱模板分子。这是因为表面分子印迹聚合物与模板分子结合位点是位于基质表面，而不是“包埋”在聚合物的内部，因此模板分子可快速与分子印迹聚合物结合。且因为印迹位点位于表面，模板分子也易于从分子印迹聚合物上洗脱下来，因此在图3b中基本看不到荧光，说明具有荧光性能的罗丹明B基本被洗脱。

a

b

图 3 结合罗丹明B的MIP-PMAA/SiO2（a）和洗脱后的

MIP-PMAA/SiO2（b）的荧光显微镜图

Fig.3 Fluorescence microscope images of MIP-PMAA/SiO2 bulks binding Rh B (a) and MIP-PMAA/SiO2 bulks (b)

2.3 表面分子印迹聚合物与传统分子印迹聚合物对罗丹明B的结合率检测

根据标准溶液浓度和荧光强度的关系，得到标准曲线。且公式为：

PL=4.98×106＋1.36×105×c，R2=0.998 9 （6）

式（6）中：PL为荧光强度；c为罗丹明B质量浓度/（mg/L）。

根据标准曲线得到的公式（6），计算分子印迹聚合物和非印迹聚合物结合罗丹明B前后溶液质量浓度，根据公式（1）计算出Q值，并作图，如图4所示。

图 4 表面分子印迹聚合物与非印迹聚合物（a）和表面分子印迹聚合物与传统印迹聚合物（b）对罗丹明B的结合曲线

Fig.4 Adsorption isotherm of Rh B onto MIP-PMAA/SiO2 and NIP (a), and MIP-PMAA/SiO2 and traditional MIP (b)

由图4a可看出，非印迹聚合物对罗丹明B的结合能力远低于表面分子印迹聚合物。非印迹聚合物对罗丹明B的结合表示了印迹聚合与罗丹明B的非特异性结合，可看出结合量很低，大概在50 mg/g。而表面分子印迹聚合物对罗丹明B的高结合能力，显示了表面印迹聚合物对罗丹明B的高识别性能。同时，可根据Kd（MIP）为163.6和
Kd（NIP）为45.5（表1），得知MIP-PMAA/SiO2对罗丹明B具有高的结合能力。

同时，将表面分子印迹聚合物与传统制备的分子印迹聚合物对罗丹明B结合能力进行了检测，如图4b所示。可知表面分子印迹聚合物结合罗丹明B的能力远远强于传统方法制备的印迹聚合物。讨论其原因认为是传统方法制备的分子印迹聚合物具有三维空间结构，罗丹明B分子和功能基团嵌入聚合物中形成具有高交联性的聚合物。导致结合位点存在于聚合物空间结构的内部，模板分子与识别位点很难接近。而表面分子印迹技术是在惰性固体表面进行分子印迹聚合物的合成，本实验选用硅胶作为基质，这样制备的表面分子印迹聚合物印迹位点和空间结构位于基质表面，避免罗丹明B分子包埋过深，易于结合与洗脱。

2.4 表面分子印迹聚合物对罗丹明B的特异性检测

同时选择罗丹明B的两种结构相似的物质，罗丹明6G和丁基罗丹明B作为对照，进行了结合率的检测。已证明制备的罗丹明表面分子印迹聚合物对罗丹明B具有特异性吸附。由图5可看到，罗丹明B表面分子印迹聚合物和非印迹聚合物对罗丹明6G和丁基罗丹明B的结合能力，且可看出表面分子印迹聚合物与非印迹聚合物对两种相似物的结合能力基本相同。图6表示了表面分子印迹聚合物对罗丹明B和其两种相似物的结合能力，可知表面分子印迹聚合物对两种相似物的结合能力要明显低于罗丹明B。在表1中，罗丹明B的表面分子印迹聚合物的Kd（分散系数）为163.6，而罗丹明6G和丁基罗丹明B为50和54.5。而非印迹聚合物与表面分子印迹聚合物对相似物的结合能力值基本相似，罗丹明B、罗丹明6G、丁基罗丹明B的Kd值分别为45.5、54.5和55.5。因此，非印迹聚合物的选择系数Ks为0.83（罗丹明B/罗丹明6G）和0.82（罗丹明B/丁基罗丹明B），基本相同且很低。而表面分子印迹聚合物的Ks值分别为3.27（罗丹明B/罗丹明6G）和3.0（罗丹明B/丁基罗丹明B）。这是因为位于硅胶表面的罗丹明B印迹孔穴可专一与罗丹明B结合，且该印迹孔穴在大小、形状和空间作用位点的排列上均与相似物不匹配。因此，尽管罗丹明6G和丁基罗丹明B在结构和大小上与罗丹明B十分相似（图1），甚至罗丹明6G的分子质量与罗丹明B都是一样的，但由于结合位点的不匹配，两种相似物无法与MIP-PMAA/SiO2结合。很明显，MIP-PMAA/SiO2对罗丹明B的高识别能力和高选择特异性结合是由于罗丹明B与印迹孔穴的完美配对。

图 5 MIP-PMAA/SiO2和NIP对罗丹明6G（a）和

丁基罗丹明B（b）的结合曲线

Fig.5 Adsorption isotherms of Rh 6G (a) and butyl Rh B (b) onto
MIP-PMAA/SiO2 and NIP

图 6 MIP-PMAA/SiO2对罗丹明B及其相似物的结合曲线

Fig.6 Binding curve of MIP-PMAA/SiO2 of Rh B and its analogues

表 1 分子印迹聚合物分散系数和选择性系数值

Table 1 Distribution and selection coefficients of molecularly imprinted polymers

3 结 论

目前，食品安全已经成为人们日常生活中不可忽视的问题。各种有毒的物质作为添加剂加入到日常食品中，导致疾病甚至死亡。对于食品中微量添加成分的检测方法已被研究者逐渐重视[14-17]。罗丹明B由于其低廉的价格，鲜艳的颜色被不法商贩作为食品添加剂替代品加入到调料品种，如花椒、辣椒粉。而研究证明罗丹明B对人体的致癌性，使其成为危害人类健康的杀手。本实验就是探讨了一种快速、专一检测罗丹明B的方法。

首先分别采用表面分子印迹技术[18-28]与传统方法制备了罗丹明B的分子印迹聚合物，MIP-PMAA/SiO2和传统MIP。表面分子印迹技术是以罗丹明B作为模板分子，硅胶为基质/载体，在硅胶表面形成印迹孔穴。该方法对基质表面进行修饰，如接入含双键的硅烷，这样可以将同样含有双键的单体接入基质表面。然后，加入单体，单体之间在基质表面发生聚合反应，生成多聚单体。最后，加入模板、交联剂、引发剂，并在无氧条件下合成表面分子印迹聚合物。通过扫描电镜对制备的表面印迹聚合物形状进行了检测，可清楚地看到表面分子印迹聚合物表面形成的聚甲基丙烯酸层和印迹孔穴，证明表面分子印迹聚合物中的印迹位点和空间结构均位于基质的表面。而荧光显微镜对洗脱前后表面分子印迹聚合物的检测说明该聚合物的结构可避免模板分子包埋过深，易于模板分子的结合与洗脱。这是因为由于印迹位点位于基质表面，模板与印迹位点相互作用阻力减少，结合动力加快。而传统分子印迹方法制备的分子印迹聚合物形成的是一个高交联网络结构，印迹位点位于聚合物空间结构内部，不易于模板分子的结合与洗脱。通过对表面分子印迹聚合物与传统印迹聚合物的结合能力实验，可知表面分子印迹聚合物的结合能力强于传统印迹聚合物（图4b）。同时，选取两种在结构上与罗丹明B十分相似的物质，对制备的表面分子印迹聚合物的特异性进行了检测，结果证明表面印迹聚合物具有高选择性和特异性，是一种能够快速、高效地检测罗丹明B的方法。

目前国内对罗丹明B的检测方法主要是高效液相色谱法。黄奕娜等[14]报道了采用高效液相法检测调味品中的罗丹明B，采用色谱柱C18为固定相，乙酸胺-甲醇（30∶70，V/V）为流动相，对辣椒油中的罗丹明B进行检测。在该检测方法中，辣椒油必须先通过丙酮和正己烷混合提取，并经过固相萃取柱净化后才能用色谱法检测，样品预处理步骤繁琐。而检测结果对罗丹明B的最低检测限为0.5 μg/mL。李小燕等[12]采用高效液相色谱-紫外检测检测葡萄酒中罗丹明含量，同样需要先将葡萄酒液中进行固相萃取，后再通过色谱柱进行测定，最低检测限为1.0 μg/mL。该方法具有特异性和灵敏性，但检测时需要对样品进行前处理，且由于仪器昂贵，检测步骤繁琐，限制了食品检测的应用范围。表面分子印迹法具对印迹分子罗丹明B具有特异性，可对罗丹明B特异性吸附，且经过特异性实验可知相似物对检测结果干扰很小。且检测方法简单，样品无需前处理，制备成本低廉。同时，将荧光法应用于表面分子印迹聚合物对罗丹明B的检测，提高了检测的灵敏性。表面分子印迹聚合物对罗丹明B的最低检测限为0.1 mg/L，即0.1 μg/mL。与高效液相色谱-紫外检测中的最低检测限0.5 μg/mL和
1.0 μg/mL相比，该检测方法更为灵敏。

由于被检测物质罗丹明B具有荧光性，因此与罗丹明B
结合后的表面分子印迹聚合物也具有荧光性，故可采用荧光分光度计检测分子印迹聚合对底物结合能力，且该方法与传统罗丹明B检测方法相比更为灵敏，检测限更低（达到0.1 mg/L）[14]，可检测出痕量物质。但此方法只能应用于具有荧光性质的物质，故需要改进方法，制备一种具有荧光的分子印迹聚合物，以实现所有底物均可进行荧光检测，提高检测灵敏性。

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