超高效液相-串联四极杆质谱联用法同时测定并比较甘草各部位中8 种成分含量

叶日贵1，高 杰1，王 冰1，李二虎1，张 燕1，江 飞1，曹 瑞1，服部征雄2，王世明3，马超美1,*

（1.内蒙古大学生命科学学院，内蒙古 呼和浩特 010021；2.日本富山大学和汉医药学综合研究所，

日本 富山 2630 930-0194；3.内蒙古鄂尔多斯蓝原中药材有限公司，内蒙古 鄂尔多斯 150600）

摘 要：建立同时检测甘草中8 种成分：22-羟基-甘草次酸、3-epi-甘草次酸、甘草次酸、甘草酸、甘草苷、芒柄花黄素、异甘草酚、甘草香豆素的超高效液相色谱-串联四极杆质谱联用法。选用胆酸作为三萜成分的内标，相思子素2”-O-β-芹菜糖苷作为酚类化合物的内标。甘草样品经粉碎用甲醇（含内标液）超声提取，采用安捷伦ZORBAX RRHD C18柱（50 mm×2.1 mm，1.8 μm），以甲醇-0.1%甲酸溶液为流动相，梯度洗脱，以电喷雾电离源，采用超高效液相-串联四极杆质谱联用动态多反应监测模式测定。结果表明，8 种成分检出限均小于0.048 8 μg/mL，定量限均小于0.195 2 μg/mL，在0.048 8～12.500 0、0.048 8～12.500 0、0.012 2～12.500 0、0.048 8～50.000 0、0.048 8～50.000 0、0.012 2～12.500 0、0.012 2～15.000 0、0.195 2～12.500 0 μg/mL范围内，22-羟基-甘草次酸、3-epi-甘草次酸、甘草次酸、甘草酸、甘草苷、芒柄花黄素、异甘草酚、甘草香豆素的峰面积与质量浓度呈良好线性关系，相关系数均大于0.99；方法回收率为97.2%～113.0%间；其日内及日间精密度实验的相对标准偏差分别为 2.63%～4.47%及1.75%～3.72%。该方法灵敏度高、稳定性强、操作简便、快捷、准确，可用于甘草各部位及其相关食品质量控制。

关键词：甘草；甘草各部位；超高效液相色谱-串联四极杆质谱联用；同时测定

Simultaneous Quantification and Comparison of 8 Components in Different Parts of Glycyrrhiza uralensis
Using Ultra-High Performance Liquid Chromatography-Triple Quadrupole Mass Spectrometry

YE Ri-gui 1, GAO Jie 1, WANG Bing 1, LI Er-hu1, ZHANG Yan1, JIANG Fei1, CAO Rui1, HATTORI Masao2, WANG Shi-ming3, MA Chao-mei1,*

(1. School of Life Sciences, Inner Mongolia University, Huhhot 010021, China; 2. Institute of Natural Medicine,
University of Toyama, Toyama 2630 930-0194, Japan; 3. Erdos Lan Yuan Materia Medica Co. Ltd., Erdos 150600, China)

Abstract: An ultra-high-performance liquid chromatography-triple quadrupole mass spectrometry (UPLC-QQQMS) with dynamic multiple reaction mode was developed to simultaneously quantify 8 constituents including 22-hydroxy-glycyrrhetinic acid, 3-epi-glycyrrhetinic acid, glycyrrhetinic acid, glycyrrhizic acid, liquiritin, glycycoumarin, formononetin and isoglycyrol in Glycyrrhiza uralensis. Cholic acid and abrusin 2”-O-β-apioside were used as the internal standards for triterpenoid and phenolic components, respectively. The internal standards were added to methanol before being used to extract samples. The separation was performed on an Agilent ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18 column (50 mm × 2.1 mm, 1.8 μm) with methanol-0.1% formic acid as the mobile phase at a flow rate of 0.4 mL/min. As a result, the linear ranges of 22-hydroxy-glycyrrhetinic acid, 3-epi-glycyrrhetinic acid, glycyrrhetinic acid, glycyrrhizic acid, liquiritin, formononetin, isoglycyrol and glycycoumarin were 0.048 8–12.500 0, 0.048 8–12.500 0, 0.012 2–12.500 0, 0.048 8–50.000 0, 0.048 8–
50.000 0, 0.012 2–12.500 0, 0.012 2–15.000 0 and 0.195 2–12.500 0 μg/mL, respectively, with correlation coefficients higher than 0.99. The average recovery rate of the developed method ranged from 97.2% to113.0% and the intra-day and inter-day relative standard deviations (RSDs) were 2.63%–4.47% and 1.75%–3.72%, respectively. This method is sensitive, simple, fast, and accurate, and can be used for the quality control of different parts of Glycyrrhiza uralensis and related food products.

Key words: Glycyrrhiza uralensis; different parts of Glycyrrhiza uralensis; ultra-high-performance liquid chromatography-triple quadrupole mass spectrometry (UPLC-QQQMS); simultaneous determination

中图分类号：O652.1 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）20-0242-06

doi:10.7506/spkx1002-6630-201420048

甘草（Radix Glycyrrhizae）又称“蜜甘”、“蜜草”[1]，是豆科甘草属多年生植物甘草的根和根茎，主要含黄酮类、三萜类、香豆素类、生物碱、皂苷类、甾醇、挥发油、有机酸及其他多种成分，具抗氧化[2-5]、抗肿瘤[6-9]、抗菌和增强免疫力[10-13]、抗肝癌保肝[14-16]、促进胰泌素分泌[17]等一系列生物活性，是公认的常用大宗药草，在中医药领域被誉为“国老”。甘草还是一种良好的天然甜味剂，其甜度是蔗糖的50 倍，在食品工业上有广泛应用。此外，还应用于畜牧业，烟草及化妆品工业[18-19]。

目前，常用于甘草有效成分定量检测的方法有比色法、薄层扫描法、紫外分光光度法及高效液相色谱法等[20-22]，上述方法在甘草及其产品的质量控制方面发挥了重要作用，然而到目前为止，还没有可以同时分析所有主要甘草成分的理想方法[23]。现代新型分析仪器如超高效液相能显著提高分辨率并缩短测定时间，质谱检测器特别是其多反应监测模式能够大幅提高检测灵敏度和特异性，优化的内标测定法还能补偿回收率不佳等问题，液相色谱-质谱联用技术在食品功能成分及有害物质残留的检测方面发挥了越来越重要的作用[24]。本实验采用了超高效液相色谱-串联四极杆质谱（ultra-high-performance liquid chromatography-triple quadrupole mass spectrometry，UPLC-QQQMS）仪，从甘草成分中选取黄酮类、三萜类及香豆素类3 类化合物共8 种化合物（22-羟基-甘草次酸、3-epi-甘草次酸、甘草次酸、甘草酸、甘草苷、芒柄花黄素、异甘草酚、甘草香豆素）作为待测化合物，以胆酸和相思子素2”-O-β-芹菜糖苷作为三萜和酚类化合物的内标，对甘草根、根茎过渡区、甘草地上部分（茎、叶、种子、种皮）及5 种添加有甘草的相关食品进行了待测化合物含量的同时测定，并对各类化合物的分布情况进行了比较分析，为甘草药材、成药及相关食品质量控制提供新的方法，并为甘草地上部分开发利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

甘草药材于2010年10月19日采于内蒙古鄂尔多斯杭锦旗呼和木都苏木，为3～4a生野生人工抚育甘草。5 种添加甘草的相关食品：桃肉蜜饯、葡萄蜜饯 广州市国王食品有限公司；甘草杏 兰州顶呱呱食品有限公司；甘草良咽糖 内蒙古亿利科技实业股份有限公司；瓜子 内蒙古真心食品有限公司。

8 种标准品及两种内标品均由服部征雄教授实验室分离提取（HPLC检测纯度≥98%），结构式如图1所示。甲醇（分析纯） 天津市登科化学试剂有限公司；甲醇（色谱纯） 美国Fisher Scientific公司；甲酸 阿法
埃莎（中国）化学有限公司；二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO） 日本和光公司；屈臣氏蒸馏水 广州屈臣氏食品饮料有限公司。

a. 22-羟基-甘草次酸

b. 3-epi-甘草次酸

c.甘草次酸

d.甘草酸

e. 甘草苷

f.芒柄花黄素

g.异甘草酚

h.甘草香豆素

i.胆酸

j.相思子素2”-O-β-芹菜糖苷

图 1 8 种标准品及两种内标（胆酸、相思子素2”-O-β-

芹菜糖苷）的化学结构

Fig.1 Chemical structures of eight standards and two internal standards (cholic acid and abrusin 2”-O-β-apioside)

1.2 仪器与设备

1290高效液相色谱-高分辨串联6430四极杆质谱联用仪（配有电喷雾电离源） 安捷伦科技公司；PS-20超声波清洗仪 洁康超声波设备有限公司；高速离心机 安徽中科中佳科学仪器有限公司；旋涡振荡器 其林贝尔仪器制造有限公司；电子天平 丹佛仪器（北京）有限公司；粉碎机 北京兴时利和科技发展有限公司；移液枪、有机相微孔滤膜。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件

安捷伦ZORBAX RRHD C18柱（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）；柱温：30 ℃；流速：0.4 mL/min；进样量：2 μL；流动相：A为0.1%甲酸溶液，B为甲醇（色谱纯）。流动相A、B的梯度洗脱程序如表1所示。

表 1 梯度洗脱条件

Table 1 Program of gradient elution

1.3.2 质谱条件

UPLC-QQQMS 接有电喷雾离子源，采用正/负离子化模式；喷雾电压4 500 V；干燥气体氮气；干燥气流量11 L/min；干燥气体温度350 ℃；毛细管电压：正离子4 000 V；负离子3 500 V；采用选择离子监控模式优化待测化合物电压，子离子扫描模式：优化子离子、定性离子及二者碰撞能量，多反应监测模式优化各组分分离洗脱条件，最后采用动态多反应监测模式高选择性地分析测定各组分。10 种分析物质谱条件见表2。

表 2 质谱条件优化

Table 2 Optimized mass spectrometry conditions

注：P.电喷雾电离源，正离子模式电离；N.电喷雾电离源，负离子模式电离。

1.3.3 溶液配制

8 种标准品各称取适量于1.5 mL离心管中，DMSO溶解过滤，配制成0.5 mg/mL的标准品储液；胆酸与相思子素2”-O-β-芹菜糖苷分别称取适量于1.5 mL离心管中，DMSO溶解过滤配制成10 mg/mL的内标溶液储液。

1.3.4 样品前处理

2010年10月19日，鄂尔多斯杭锦旗呼和木都苏木当地甘草采收时节，随机采取3～4a生野生人工抚育甘草完整植株3 株，编为A、B、C。将每一株按其根、根茎过渡区、茎3 部分进行分段，根部再等距分为3 份，分别编号（如：A株：A1为茎，A2为根茎过渡区，A3～5为根）。并收集同一批甘草的干燥叶子（Y）、种子（ZZ）和种皮（ZP）。叶子直接捏碎成粉末，甘草其余部分则用粉碎机粉碎，桃肉蜜饯、葡萄蜜饯及甘草杏果肉分别剪碎至小块，真心瓜子则按其瓜子皮及瓜子仁分别剪碎至小块，甘草良咽糖则敲碎至粉末。各样品称取约50 mg，分别置于2 mL离心管中，用50 μg/mL内标甲醇溶液超声波提取，1 073×g离心，取上清液，有机相微孔滤膜过滤后进样供液相色谱-质谱仪检测。

2 结果与分析

2.1 UPLC- MS-MS条件优化

8 种标准品及两个内标通过UPLC梯度洗脱在14 min内得到完全分离，各化合物色谱洗脱保留时间分别为：22-羟基-甘草次酸，6.995 min；3-epi-甘草次酸，10.215 min；甘草次酸，9.229 min；甘草酸，7.225 min；甘草苷，1.228 min；芒柄花黄素，4.885 min；异甘草酚，7.988 min；甘草香豆素，6.774 min；胆酸，8.269 min；相思子素2”-O-β-芹菜糖苷，1.837min。在质谱动态多反应监测模式下检测到10 种化合物分离扫描图（图2）。

1.甘草苷；2.相思子素2”-O-β-芹菜糖；3.芒柄花黄素；4.甘草香豆素；5. 22-羟基-甘草次酸；6.甘草酸；7.异甘草酚；8.胆酸；9.甘草次酸；10. 3-epi-甘草次酸。

图 2 标准品的动态多反应监测模式扫描图

Fig.2 UPLC-QQQMS profile of standard compounds in a dynamic multiple reaction mode

2.2 线性范围、标准曲线及检出限

表 3 各对照品的线性关系

Table 3 Linear relationships of reference substances

标准品储液各分别吸取20 μL，用内标溶液稀释至200 μL，即得混合标准品使用液，并按1∶4∶4∶4∶4∶4∶4∶4比例梯度稀释，制得8 份混合标准品使用液（每一稀释梯度内标溶液浓度保持50 μg/mL）。采用所优化的质谱条件与色谱条件，进样检测标准混合溶液（质量浓度范围为0.003 1～50.000 0 μg/mL）。用Agilent Mass Hunter定量分析软件对UPLC-QQQMS检测结果进行分析，以待测物与内标的峰面积比为纵坐标，待测物的质量浓度为横坐标进行线性回归。取信噪比RSN=3的待测物质量浓度为方法检出限，取信噪比RSN=10的待测物质量浓度为方法定量限。结果（表3）表明，8 种标准品在各自的线性范围内具有良好的线性相关性，检出限均小于0.048 8 μg/mL，定量限均小于0.195 2 μg/mL可满足实际检测的需要。

2.3 样品分析

表 4 甘草各部位成分含量分析结果

Table 4 Contents of 8 components in different parts of Glycyrrhiza uralensis

注：—.含量低于检测限；A、B、C分别为3 株甘草，A1、B1、C1为茎，A2、B2、C2为根茎过渡区，A3～5、B3～5、C3～5为根；Y.叶子；ZZ.种子；ZP.种皮。下同。

采用Agilent Mass Hunter定量分析软件对样品UPLC-QQQMS检测结果进行分析，经标准曲线回归方程，计算得到待测物的质量浓度，从而换算出待测物在样品中的含量，结果见表4、5。

从甘草各部位定量结果（表4）可知，所测8 种标准品中三萜类成分最多，黄酮与香豆素类成分含量相仿。甘草酸、22-羟基-甘草次酸、3-epi-甘草次酸、甘草次酸是三萜类化合物。通过对定量结果分析可知，甘草酸在甘草各部位均有分布，也是被测8 种化合物中含量最多的一种。在各部位中，根茎过渡区含量最高其次为根，而且在种皮中的含量比叶子、种子及茎等部位的含量要高出很多。而对于22-羟基-甘草次酸的定量结果表明，除了在第一株甘草茎中有少量分布外其余两株及其他部位中未能定量到此类成分。3-epi-甘草次酸、甘草次酸是相对分子质量相同，3位羟基构型不同的两个化合物，在甘草各部分提取物中，二者分布相仿且含量较少。8 种标准品中甘草苷、芒柄花黄素是两个黄酮类化合物，在甘草各部位中有着不同程度的分布，在根部含量最多。此外甘草苷在种子与种皮中也有少量的分布。甘草香豆素与异甘草酚是两个香豆素类化合物。从对甘草各部位的定量结果可知，这两种化合物在茎中均无分布。除此之外，甘草香豆素在种皮及叶子中的分布相当可观。分析结果表明，甘草各部位中待测8 种成分含量分布是不同的，有些成分并非只分布于甘草药材常用的地下部分，叶子、种子、种皮、茎等部位中也有分布，就甘草香豆素而言，在种皮及叶子中含量丰富，接近于甘草根中的含量。这对甘草地上部分资源在药材、食品及兽药等领域的开发利用，为提高甘草资源的利用率提供重要参考依据。

表 5 5 种添加甘草的食品中8 种甘草成分的定量分析结果

Table 5 Quantitative results of processed foods containing licorice

注：22-羟基-甘草次酸、甘草次酸、甘草苷、芒柄花黄素、异甘草酚、甘草香豆素含量在上述食品中的含量均低于检测限，在此未列出。

对添加甘草的5种相关食品的定量分析结果（表5）可知，该UPLC-QQQMS方法可对桃肉蜜饯、葡萄蜜饯、甘草良咽糖、干草杏、真心瓜子食品中甘草酸及3-epi-甘草次酸的含量进行定量分析。其定量结果为：桃肉蜜饯、葡萄蜜饯含少量3-epi-甘草次酸，甘草良咽糖含较高量的甘草酸及少量3-epi-甘草次酸，干草杏、真心瓜子皮则含一定的甘草酸而真心瓜子仁中未检测有甘草酸。这一分析结果证实了本实验所建立的方法可有效地检测添加甘草相关食品中的一些成分，并为其质量控制方面提供参考依据。

2.4 回收率和精密度

取3 份已知质量浓度的溶液，分别向其加入等体积高、中、低3 种已知质量浓度的混合标准品溶液，充分混匀后进样测定计算加样回收率。结果22-羟基-甘草次酸、3-epi-甘草次酸、甘草次酸、甘草酸、甘草苷、芒柄花黄素、异甘草酚、甘草香豆素回收率分别为103.5%、106.4%、107.1%、97.2%、105.2%、97.3%、113.0%、109.4%。

配制质量浓度为12.500 μg/mL的标准品混合液室温放置，24 h内连续进样6 次测定日内精密度，日间精密度则连续3 d每天进样测定1 次。结果表明，在混合标准品液中22-羟基-甘草次酸、3-epi-甘草次酸、甘草次酸、甘草酸、甘草苷、芒柄花黄素、异甘草酚、甘草香豆素具有良好的精密度，其日内及日间精密度（相对标准偏差）范围分别为2.63%～4.47%和1.75%～3.72%。

3 结 论

本实验建立的UPLC-QQQMS内标法，除了可以定量常见的甘草三萜类代表性成分甘草酸、甘草次酸及黄酮类成分甘草苷外还可同时定量香豆素类成分甘草香豆素和异甘草酚在内的共8 种成分。在以往的甘草质量控制有效成分测定研究中[23,25-26]，尚未见同时这测定8 种有效成分的报道。本实验所建立的方法稳定性强，并有着很高的灵敏度和分辨率，能够快速、简便、准确地测定这8 种甘草成分在甘草不同部分及甘草加工食品中的含量，为甘草加工产品的工艺研究提供了重要的参考依据，为甘草药材、成药及相关食品的质量控制提供了新的定量方法。

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