鲢鱼重组Cystatin的原核表达、鉴定及
对铜绿假单胞菌的抑制作用

陈 海,姜海洋,吴 睿,肖安蓬,何 杰,李 冉,马璐阳,任阳阳,李树红*

(四川农业大学食品学院,四川 雅安 625014)

 

摘 要:本实验主要对鲢鱼半胱氨酸蛋白酶抑制因子Cystatin进行原核表达和纯化鉴定,并研究重组Cystatin对铜绿假单胞菌的抑菌效果。首先用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导转入pET-30-Cystatin的E.coli BL21(DE3)表达重组Cystatin蛋白,经Ni2+-NTA镍离子亲和层析对其进行纯化,该重组蛋白在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳上显示单一条带,分子质量约20.6 kD,在TSK-GEL G2000SW凝胶过滤高效液相色谱上呈单一活性峰,纯度为94.27%,经标准曲线计算其分子质量为20.9 kD;其次,利用抑制剂滴定曲线法,以偶氮酪蛋白为底物,确定重组Cystatin对木瓜蛋白酶(45.375 μmol)的一个抑制活性单位为0.718 μg;最后通过滤纸片扩散法鉴定鲢鱼重组Cystatin对铜绿假单胞菌的抑菌效果,结果表明Cystatin的添加量为20、60、120、200 U/片时,抑菌圈直径分别为8、9、13、26 mm。鲢鱼重组Cystatin对铜绿假单胞菌的抑菌效果呈剂量依赖关系。

关键词:半胱氨酸蛋白酶抑制剂;鲢鱼;原核表达;鉴定;铜绿假单胞菌;抑菌活性

 

Prokaryotic Expression and Identification of Recombinant Cystatin of Hypophthalmichthys molitrix and
Antibacterial Activity on Pseudomonas aeruginosa

 

CHEN Hai, JIANG Hai-yang, WU Rui, XIAO An-peng, HE Jie, LI Ran, MA Lu-yang, REN Yang-yang, LI Shu-hong*

(College of Food Science, Sichuan Agricultural University, Ya’an 625014, China)

 

Abstract: Prokaryotic expression, purification and identification of a cysteine proteinase inhibitor, cystatin, from Hypophthalmichthys molitrix were performed, and the antibacterial effect of the recombinant cystatin on Pseudomonas aeruginosa was investigated in this work. The cystatin was expressed by E. coli BL21 (DE3) transformed with pET-30-Cystatin with the induction of isopropyl-beta-D-galactose (IPTG), and purified by Ni2+-NTA affinity chromatography. The purified protein appeared as a single band on SDS-PAGE, corresponding to a molecular weight of approximately 20.6 kD. The same protein also appeared as a single active peak on the gel filtration HPLC of TSK-GEL G2000SW with a purity of 94.27% and a relative molecular weight of 20.9 kD, as calibrated by standards. The inhibitory activity of the cystatin against papain (45.375 μmol) was 0.718 μg, which was determined by inhibitor titration method with Azocasein as the substrate. The antibacterial effect of the recombinant cystatin on Pseudomonas aeruginosa was tested by filter paper diffusion method, and it was found that the diameters of the inhibition zones were 8, 9, 13 and 26 mm with the addition of 20, 60, 120 and 200 units of the cystatin, respectively. This suggests that the antibacterial activity of the cystatin on Pseudomonas aeruginosa is dose-dependent.

Key words: cystatin; Hypophthalmichthys molitrix; prokaryotic expression; identification; Pseudomonas aeruginosa; antibacterial activity

中图分类号:TS254.1 文献标志码:A 文章编号:1002-6630(2014)21-0133-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201421026

半胱氨酸蛋白酶抑制因子(cysteine proteinase inhibitors,CPIs)可专一性地抑制半胱氨酸蛋白酶,广泛分布于动植物组织、体液以及分泌液中。已知动物源CPIs中最主要成员为Cystatins超家族:Stefin(家族Ⅰ)相对分子质量约10 000,无二硫键和糖侧链;Cystatin(家族Ⅱ)相对分子质量约12 000~14 000,有2 对二硫键,部分成员含糖侧链;Kininogen(家族Ⅲ)相对分子质量约50 000~120 000,有9 对二硫键及糖侧链[1]。目前已有多位学者从鱼的卵、肝胰、脾脏、垂体、血清以及皮等这些水产品加工的废弃组织中分离纯化出了Cystatins[2-9]。鲢鱼(Hypophthalmichthys molitrix)在我国养殖广泛,产量位居我国淡水鱼第二[10],在其加工中会产生大量废弃下脚料,若能对其中的Cystatins加以利用,变废为宝,将具有重要意义。

目前已有相关研究表明,某些陆生动物及植物来源的Cystatin(家族Ⅱ)表现了抑菌活性:人类唾液Cystatin SA能够抑制伴放线凝聚杆菌(Aggregatibacter actinomycetemcomitans)的生长[11];人类重组Cystatin 9能够抑制土拉热弗朗西斯菌(Francisella tularensis)的生长[12];小鼠来源的Cystatin S能够抑制牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)的生长[13];从鸡蛋白中提取的Cystatin在低浓度即可对大肠杆菌(Escherichia coli)和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)产生明显的抑制效果[14];长春花中纯化的phytocystatin能够抑制大肠杆菌(Escherichia coli)和金黄色酿脓葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[15]。目前尚未见鱼源Cystatin(家族Ⅱ)抑菌活性的研究报道。为此,本实验首先对鲢鱼Cystatin进行原核诱导表达、纯化及鉴定,确定其抑制活性单位后,进行抑菌活性研究。对鲢鱼重组Cystatin活性和抑菌特性的研究,可以为探索鲢鱼下脚料中天然Cystatin的性质,提供科学的信息并奠定必要的研究基础,进而为淡水鱼加工废弃物资源的合理综合利用及精深加工提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 菌种、培养基与试剂

转入鲢鱼Cystatin-pET-30a的工程菌E.coli BL(DE3)由四川农业大学食品学院水产加工理论与技术实验室保存;铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)ATCC27853由四川农业大学食品学院食品微生物实验室提供。

LB培养基和营养琼脂培养基(nutrient agar,NA)均按常规方法配制。

异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)、苯甲基磺酸氟(phenylmethylsulfonyl fluoride,PMSF)、木瓜蛋白酶(papain,P4762,10U/mg)、偶氮酪蛋白(azocasein)、半胱氨酸盐酸盐、Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe、Tyr-Gly-Gly-Phe-Met、乳链菌肽、细胞色素C、胰蛋白酶、胃蛋白酶原、牛血清白蛋白、γ-球蛋白 美国
Sigma公司;考马斯亮蓝R-250 美国Amresco公司;中分子质量蛋白标准品(14.4~94 kD) 天根生化科技(北京)有限公司;蓝葡聚糖-2000 美国GE公司。

1.2 仪器与设备

Biologic Duo Flow全自动中高压层析系统 美国Bio-Rad公司;B4i-BR4i大容量高速离心机 法国Jouan公司;JY-ECP3000电泳仪 北京市六一仪器厂;Ni2+-NTA镍离子亲和层析填料 德国Qiagen公司;LC-2010HT高效液相色谱系统 日本岛津公司;THZ-98AB恒温振荡培养箱和LRH-250生化培养箱 上海一恒科学仪器有限公司;V-1100D分光光度计 上海美谱达公司;SW-CJ1F无菌操作台 苏州佳宝净化工程设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 重组菌的表达

将转入鲢鱼Cystatin-pET-30a的E.coli BL21(DE3)工程菌接种在LB液体培养基(含50 μg/mL卡那霉素),于37 ℃、180 r/min振荡培养过夜。次日将菌液按150接入LB液体培养基(含100 μg/mL卡那霉素),于37 ℃、180 r/min振荡培养2~3 h。当OD600 nm为0.6时,加入1 mmol/L的IPTG,继续培养5~6 h,5 000 r/min离心5 min,弃上清液,加10 mL洗涤液,再次5 000 r/min离心5 min,收集菌体称质量。加入1 mg/mL的溶菌酶,反复冻融3 次,超声破碎菌体后用含尿素的裂解液梯度洗涤,8 000 r/min离心10 min,收集沉淀用于纯化。

1.3.2 重组Cystatin蛋白的纯化

用5 mol/L尿素(含50 mmol/L Tris-HCl、0.5 mol/L NaCl、1 mmol/L PMSF、1 mmol/L EDTA)洗涤收集的蛋白沉淀。用Buffer A(含0.5 mol/L NaCl、1 mol/L尿素、5%甘油、50 mmol/L Tris-HCl,pH 8.5)进行透析后,镍柱亲和层析纯化目的蛋白;以50 mmol/L Tris-HCl缓冲液(含0.5 mol/L NaCl、1 mol/L尿素、5%甘油和0.3 mol/L
咪唑,pH 8.5)洗脱,洗脱流速0.5 mL/min,收集蛋白峰部分,磷酸盐缓冲液(含5 mmol/L半胱氨酸盐酸盐,pH 7.4)进行透析脱盐处理。参考Laemmli[16]的方法,采用14 g/100 mL分离胶和4 g/100 mL浓缩胶,对纯化的样品进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis,
SDS-PAGE)鉴定。电泳胶片经凝胶成像仪进行成像扫描,而后用Quantity One电泳图像分析软件分析目的蛋白的分子质量。参考Bradford[17]的方法测定蛋白质质量浓度。

1.3.3 凝胶过滤高效液相色谱鉴定重组Cystatin

色谱条件:色谱柱为TSK-GEL G2000SW(3 000 mm×
7.80 mm,5 μm),流动相为含0.1 mol/L Na2SO4和7.69 mmol/L NaN3的0.1 mol/L磷酸缓冲液(phosphate buffered saline,PBS)洗脱,流速0.5 mL/min,进样量10 μL,检测波长280 nm。

以凝胶过滤高效液相标准品蓝葡聚糖-2000测定TSK-GEL G2000SW的空体积V0,分别以Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe(0.573 kD)、Tyr-Gly-Gly-Phe-Met(1.046 kD)、乳链菌肽(3.35 kD)、细胞色素C(13 kD)、胰蛋白酶(23.3 kD)、胃蛋白酶原(43 kD)、牛血清白蛋白(66 kD)、γ-球蛋白(150 kD)标准蛋白作为标准品,相同条件下进行色谱分析,求得各自的洗脱体积Ve。以Ve与V0的比值作为纵坐标,标准蛋白分子质量对数为横坐标,绘制TSK-GEL G2000SW凝胶过滤高效液相色谱分离的标准曲线,得到回归方程为y =-0.426 9x+3.399 1(R²= 0.977 1)。将纯化后的重组Cystatin经0.22 μm针头式滤器微滤后,上凝胶过滤高效液相色谱,通过目的峰峰面积比例进一步鉴定其纯度和分子质量。

1.3.4 重组Cystatin蛋白抑制活性单位的确定

根据Li Dengkun等[18]的方法,采用木瓜蛋白酶(配制适当浓度经E-64滴定有效活性浓度为6.05 μmol/L)水解反应底物Azocasein,并调节抑制剂的加入量使得木瓜蛋白酶水解Azocasein活性的抑制率处于30%~70%[19],即可准确测定抑制活性。本实验将纯化的Cystatin稀释并设置系列添加量梯度,采用上述方法准确测定重组Cystatin对木瓜蛋白酶的抑制活性,并绘制抑制剂滴定曲线,以完全抑制体系中木瓜蛋白酶(45.375 μmol)的Cystatin活性量为一个抑制活性单位(U)。

1.3.5 滤纸片法鉴定重组Cystatin的抑菌效果

采用滤纸片法[14]鉴定Cystatin对实验菌株的抑菌作用。将铜绿假单胞菌接种于LB培养基中培养,当OD600 nm为0.6时,吸取100 μL菌液均匀涂布于直径为90 mm的NA平板的表面,贴上直径为6 mm的无菌滤纸片,在滤纸片上分别滴加经无菌处理的Cystatin 20、60、120、200 U/片;同时,以等体积的无菌生理盐水(0.85% NaCl)做对照。在4 ℃条件下静置3 h,30 ℃恒温培养16~18 h,测定抑菌圈的大小以判断鲢鱼重组Cystatin的抑菌效果。

2 结果与分析

2.1 重组Cystatin蛋白的表达和纯化

由图1可知,成功表达的重组蛋白Cystatin,通过尿素洗涤和Ni2+-NTA镍离子亲和层析,所得吸附部分样品在SDS-PAGE中分子质量20.6 kD处呈现单一条带。层析纯化后的蛋白经Bradford法检测质量浓度为1.755 g/L。高效液相色谱分析显示(图2):在18.988 min处出现单一蛋白峰,峰面积比例94.27%,蛋白纯度较高。根据凝胶过滤高效液相上目的峰尖处的Ve与V0的比值,代入标准曲线回归方程测得重组蛋白Cystatin的分子质量约为20.9 kD。

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M. Marker;1. Ni2+-NTA镍离子亲和层析吸附部分;2. Ni2+-NTA镍离子亲和层析不吸附部分。

图 1 SDS-PAGE检测纯化的重组鲢鱼Cystatin

Fig.1 SDS-PAGE of the purified recombinant silver carp cystatin

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图 2 TSK-GEL G2000SW凝胶过滤高效液相色谱鉴定重组Cystatin

Fig.2 Identification of the recombinant cystatin by HPLC of
TSK-GEL G2000SW

2.2 重组Cystatin抑制活性单位的确定

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图 3 重组Cystatin 抑制活性滴定曲线

Fig.3 Titration curve of recombinant cystatin inhibitory activity

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图 4 重组Cystatin抑制活性滴定曲线的线性部分外推

Fig.4 Extrapolation of the recombinant cystatin titration curve

由图3可知,随着Cystatin添加量的增加,木瓜蛋白酶残余酶活力明显下降,当Cystatin添加量超过0.598 μg后,其残余酶活力维持在15%左右。取滴定曲线的线性部分外推,如图4所示,通过趋势线可以推测出,Cystatin的添加量为0.718 μg时,理论上可将木瓜蛋白酶(45.375 μmol)完全抑制。因此,确定Cystatin的一个抑制活性单位为0.718 μg

2.3 滤纸片法鉴定纯化Cystatins的抑菌作用

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A. 生理盐水对照;B. Cystatin 20 U/片;C. Cystatin 60 U/片; D. Cystatin 120 U/片;E. Cystatin 200 U/片。

图 5 Cystatin的抑菌作用

Fig.5 Bacteriostatic action of the cystatin

由图5可知,鲢鱼重组Cystatin添加量约为14 μg/片(20 U/片)时抑菌圈直径为8 mm,42 μg/片(60 U/片)时抑菌圈直径为9 mm,84 μg/片(120 U/片)时抑菌圈直径为13 mm,140 μg/片(200 U/片)抑菌圈直径为26 mm。该结果说明鲢鱼重组Cystatin对铜绿假单胞菌的抑制呈剂量依赖关系,且根据抑菌圈直径大小,当重组Cystatin为140 μg/片(200 U/片)时,对铜绿假单胞菌的抑制效果最为显著。

3 讨 论

目前已利用基因工程技术将多种不同生物来源的Cystatins基因进行了成功表达。但在鱼类Cystatins的克隆表达及其功能性质研究方面还相对较少。Xiao Pingping等[20]研究表明体外表达的大菱鲆重组SmCytB具有半胱氨酸蛋白酶抑制活性;Li Shuying等[21]通过分子克隆技术获得的重组大黄鱼Cystatin,其cDNA全长354 个核苷酸,编码一个118 个氨基酸残基的蛋白,其谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione-S-transferase,GST)融合蛋白对木瓜蛋白酶表现出明显的抑制活性。本课题组对鲢鱼Cystatin进行了克隆表达,成功获得了高纯度、分子质量约20.9 kD的鲢鱼重组Cystatin。根据木瓜蛋白酶的活性抑制滴定曲线显示,理论上0.718 μg的重组Cystatin可将45.375 μmol的木瓜蛋白酶完全抑制。

铜绿假单胞菌又称绿脓杆菌,广泛分布在水、空气以及人和动物机体中,为条件致病菌。目前,有关Cystatin(家族Ⅱ)对铜绿假单胞菌抑菌效果的研究很少。Nordahl等[22]研究表明哺乳动物高分子Kininogen的结构域5能够有效杀死铜绿假单胞菌。Wesierska等[14]通过滤纸片法研究发现鸡蛋白Cystatin对铜绿假单胞菌ATCC27853的抑菌效果明显,Cystatin添加量为150 μg/片时能够产生直径为18 mm的抑菌圈,
120 μg/片时抑菌圈直径为16 mm,100 μg/片时无抑菌圈产生。本实验对鱼源Cystatin的抑菌效果进行了研究,鲢鱼重组Cystatin约84 μg/片(120 U/片)时,对铜绿假单胞菌的抑菌圈直径为13 mm,140 μg/片(200 U/片)抑菌圈直径为26 mm,说明其对铜绿假单胞菌的抑制效果可能优于鸡蛋白Cystatin。

Cystatin主要作为一种分泌型抑制剂,其抑制假单胞菌的机制,一方面可能其通过抑制细菌本身分泌的胞外半胱氨酸蛋白酶而发挥抑菌作用。Wesierska等[14]在能够分泌胞外半胱氨酸蛋白酶的细菌培养液中加入鸡蛋白Cystatin,细菌的生长受到大幅度的抑制。但是也有研究发现,人类唾液Cystatin S和鸡Cystatin抑制牙龈卟啉单胞菌是由于其具有抑菌氨基酸序列,与对牙龈卟啉单胞菌巯基蛋白酶的抑制无关[23]。

另外,Cystatins N端与半胱氨酸蛋白酶相互作用的保守序列,会与细菌微生物膜上的负电荷相结合,从而起到抑菌作用[24]。不仅如此,Cystatin还可能穿透细菌细胞膜,进入细菌内部,抑制胞内半胱氨酸蛋白酶。与Cystatin相关的重组鼠附睾精子发生蛋白CST8-GST(融合蛋白)能够抑制大肠杆菌,对大肠杆菌细胞膜穿透作用随CST8剂量增加而增强[25]。本研究结果中鲢鱼重组Cystatin对铜绿假单胞菌的抑菌机制还有待深入探究。

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收稿日期:2014-06-08

基金项目:国家自然科学基金青年科学基金项目(31101249)

作者简介:陈海(1993—),男,本科生,研究方向为水产品加工理论与技术。E-mail:754386839@qq.com

*通信作者:李树红(1975—),女,副教授,博士后,研究方向为水产品加工理论与技术。E-mail:xiaoshu928@126.com