超高压处理菠萝蛋白酶引发构象变化与
酶活力的关系

刘 平，胡志和*，吴子健，薛 璐，王凤玲

（天津市食品生物技术重点实验室，天津商业大学生物技术与食品科学学院，天津 300134）

摘 要：采用超高压处理菠萝蛋白酶，研究菠萝蛋白酶结构变化与酶活力的关系。采用傅里叶红外光谱（Fourier transform infrared spectrometer，FTIR）检测二级结构变化，荧光光谱检测三级结构变化，采用福林酚法测定酶活力。结果显示，与0.1 MPa相比，在37 ℃，不同压力（100～500 MPa）处理20 min，对菠萝蛋白酶活力均有显著影响（P＜0.05）。200 MPa处理时，酶活力达到最大值（3 524 U/g），提高了8.29%。200 MPa处理后的菠萝蛋白酶，经傅里叶红外光谱分析结果显示，β-折叠含量比常压下增加了1.76 倍。内源性荧光光谱结果显示，280 nm波长处激发，荧光强度达到最高4 934。因此，菠萝蛋白酶的活性与β-折叠的含量以及亲水性Typ残基的暴露程度有关。

关键词：超高压；菠萝蛋白酶；酶活力；构象；红外光谱；荧光光谱

Relationship between Bromelain Activity and Conformational Changes Caused by Ultra High Static Pressure

LIU Ping, HU Zhi-he*, WU Zi-jian, XUE Lu, WANG Feng-ling

(Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology, School of Biotechnology and Food Science,

Tianjin University of Commerce, Tianjin 300134, China)

Abstract: The relationship between structural changes and bromelain activity was investigated. After bromelain was treated at various pressure levels, its secondary structure changes were observed by Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR), its tertiary structure changes were examined by fluorescence spectroscopy, and its activity was tested using Folin phenol method. The results showed that compared with the control group (0.1 MPa), the bromelain activity significantly changed after treatment at 37 ℃ for 20 min at 100-500 MPa (P ＜ 0.05). The maximum level (3 524 U/g) of bromelain activity was observed after treatment of the enzyme at 200 MPa, representing a 8.29% increase over the control group. Moreover, the treated enzyme displayed a 2.76-fold increase in β-sheet content as analyzed by Fourier transform infrared spectroscopy. The maximum endogenous fluorescence spectral intensity of 4 934 was found at excitation wavelength of 280 nm. Therefore, bromelain activity is related to the β-sheet content and the exposure degree of Tyr residues.

Key words: ultra high static pressure; bromelain; enzyme activity; conformation; infrared spectroscopy; fluorescence spectroscopy

中图分类号：Q71 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）21-0138-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201421027

菠萝蛋白酶在医药和化工领域有重要的利用价值。近年来，有关菠萝蛋白酶的研究也是热点[1-5]。菠萝蛋白酶属于巯基蛋白酶，相对分子质量为23 828[6]，由20 种共212 个氨基酸组成。

陶敏等[7]利用超高压处理菠萝蛋白酶，发现超高压能减弱温度对菠萝蛋白酶活性的影响程度。张兆琴等[8]研究了动态高压微射流技术对菠萝蛋白酶活性及构象的影响，结果显示，其对菠萝蛋白酶具有钝化作用，构象分析表明，动态高压微射流技术导致菠萝蛋白酶部分去折叠，分子中酪氨酸和色氨酸残基所处的微环境发生了变化。但构象变化与酶活性的关系在相关文献中没有具体阐述。

本研究采用不同超高压条件处理菠萝蛋白酶，利用红外光谱和荧光光谱分析超高压处理后的结构变化，采用福林-酚法检测酶活变化。探讨超高压处理所引发菠萝蛋白酶空间结构变化与酶活力之间的关系，为超高压结合酶法生产水解产物提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 试剂

菠萝蛋白酶 美国Sigma公司；酪蛋白、NaOH、Na2CO3、三氟乙酸、福林-酚、Na2HPO3、NaH2PO3均为分析纯级 天津昊斯生物技术有限公司；8-苯胺基-1-萘磺酸（8-anilinol-naphthalenesulfonic acid，ANS） 美国Sigma公司；KBr为光谱级 上海化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

HPP.L2-800/2.5超高压设备 天津市华泰森淼生物工程技术有限公司；DC-2030节能型智能恒温槽 宁波新芝生物科技股份有限公司；Nicolet5700傅里叶红外光谱仪 美国尼高力仪器公司；TU-1810型紫外-可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；L535-1型低速离心机 湘仪离心机仪器有限公司；F-4600荧光光
度计 日立高新技术公司；FD-2冷冻干燥机 北京博医康实验仪器有限公司；VELP漩涡振荡器 德祥科技有限公司；塑料薄膜封口机 浙江江南实业有限公司；FA1104N型电子天平 上海精密科学仪器有限公司；FE20型pH计 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；HWS24型电热恒温水浴锅 上海一恒科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品超高压处理

采用HPP.L2-800/2.5超高压设备处理样品，外接DC-2030节能型智能恒温槽控制温度。将菠萝蛋白酶溶于磷酸缓冲液（pH值调为7.5），配制质量浓度为10 mg/mL。取菠萝蛋白酶溶液5 mL，装入聚乙烯塑料袋真空密封后，采用不同超高压条件处理。条件为：保压时间20 min、温度37 ℃，处理压力别为0.1、100、200、300、400、500、600 MPa，其中，对照组为常压（0.1 MPa）处理的酶溶液。

1.3.2 福林-酚法检测酶活力

采用福林-酚法测定不同超高压条件处理的菠萝蛋白酶的活力[7]。4 mL反应体系包括：1 mL酶缓冲溶液（不同压强处理的酶液），1 mL酪蛋白溶液（10 g/L），40 ℃恒温水浴中反应10 min，加入2 mL三氯乙酸（65.4 g/L）终止反应。终止反应后过滤，取1 mL滤液加入5 mL Na2CO3溶液（42.4 g/L）和1 mL福林-酚，40 ℃恒温水浴中显色20 min，在680 nm波长处测定其吸光度（每组条件做3 个平行，取均值）。酶活力计算见下式。

式中：X为样品的酶活力/（U/g）；A为由标准曲线得出的样品最终稀释液的活力/（U/mL）；V为溶解样品所使用的容量瓶的体积/mL；4为反应试剂的总体积/mL；n为样品的稀释倍数；m为样品的质量/g；10为反应时间/min。

1.3.3 样品的红外光谱扫描

不同超高压条件处理的菠萝蛋白酶冷冻干燥，称取干燥样品2 mg与100 mg KBr混合，压片，采用Nicolet5700傅里叶红外光谱仪扫描。以波数为横坐标，透光率为纵坐标，采用EZOMNIC分析软件分析其红外光谱的变化。

1.3.4 样品的荧光光谱扫描

1.3.4.1 菠萝蛋白酶的内源性荧光光谱扫描

将超高压处理的菠萝蛋白酶溶液（0.1 mg/mL）进行内源性荧光测定。分别以295 nm和280 nm波长处为激发波长，扫描300～400 nm的发射光谱，狭缝宽度为2 nm。

1.3.4.2 菠萝蛋白酶的外源性荧光光谱扫描

不同超高压条件处理的菠萝蛋白酶溶液（0.1 mg/mL）取4 mL，加入20 µL的ANS外源荧光探针溶液
（5.0 mmol/L）。避光反应1 h后，采用F-4600荧光光度计进行荧光光谱扫描。选择228 nm激发后，扫描290～420 nm的发射光谱，狭缝宽度为2 nm。

1.4 数据统计分析

所有数据采用Origin8.0作图；SPSS17.0软件对高压处理后的菠萝蛋白酶活力大小，二级结构的峰面积大小以及荧光强度等实验数据进行显著性分析；采用
EZ OMNIC软件分析红外光谱的变化。

2 结果与分析

2.1 超高压处理对菠萝蛋白酶活力的影响

在37 ℃，不同压力（0.1、100、200、300、400、500、600 MPa）下处理菠萝蛋白酶20 min，测得酶活力变化见图1。

图 1 37 ℃不同压力下处理20 min对菠萝蛋白酶活力的影响

Fig.1 Effect of different pressures for 20 min at 37 ℃ on bromelain activity

由图1可知，与对照组（0.1 MPa）相比，在所选压力范围内，酶活力变化显著（P＜0.05）。当压力从0.1 MPa升高到200 MPa，酶活力从3 254 U/g增加到3 524 U/g，比常压下提高了8.29%；当压力从200 MPa升高到600 MPa，酶活力逐渐下降，在600 MPa时，酶活力为3 304 U/g，仍高于对照组。酶活力变化是因为酶在经过超高压处理后，酶活性中心的非共价键发生变化，导致酶活性中心部分裸露，其空间结构发生了改变[9-12]，引起生物活性变化，体现为酶活力变化[13]。

2.2 不同高压处理的菠萝蛋白酶的二级结构变化与酶活力的关系

蛋白质的二级结构与氢键的形成方式有密切关系。α-螺旋、β-折叠、β-转角等二级结构中都有特定的氢键构成。这种特定氢键之间的结构差异能清楚地表现在对氢键变化敏感的红外光谱上。目前用红外光谱来研究蛋白质二级结构的文献很多[14-18]。红外光谱主要分为3 个带，酰氨Ⅰ带1 600～1 700 cm-1，酰氨Ⅱ带1 500～1 600 cm-1，酰氨Ⅲ带1 230～1 240 cm-1[19]。但只有酰氨Ⅰ带是对蛋白质结构变化高度敏锐的一个谱带。已有研究把酰氨Ⅰ带主要归属于C—O键伸缩振动及肽键的C—N伸缩振动，可反映蛋白质的二级结构[20]。其中α-螺旋含量以1 650～1 658 cm-1处峰面积表示，β-折叠为1 610～1 640 cm-1处峰面积表示，β-转角为1 660～1 700 cm-1处峰面积表示。

A～G. 37 ℃条件下分别在200、600、300、500、400、100、0.1 MPa处理20 min。

图 2 不同压力下37 ℃、20 min处理后菠萝蛋白酶的红外光谱

Fig.2 Infrared spectra of bromelain treated by different pressure at 37 ℃ for 20 min

由图2可知，不同压力条件处理后，菠萝蛋白酶红外图谱中酰胺Ⅰ带的波数位于1 650 cm-1附近。采用EZ OMNIC软件去卷积进一步分析红外光谱图，比较菠萝蛋白酶中二级结构β-折叠，α-螺旋以及β-转角的含量变化，见表1。

表 1 不同压力处理下37 ℃、20 min菠萝蛋白酶二级结构的
峰面积变化（

x

±s，n=3）

Table 1 Peak area changes of secondary structures of bromelain treated by different pressures at 37 ℃ for 20 min (

x

±s, n = 3)

注：小写字母a、b不同表示与对照组相比差异显著（P＜0.05）；#、*不同表示与200 MPa相比差异显著（P＜0.05）。

由表1可知，与对照组相比，不同程度（100～
600 MPa）的高压处理后，菠萝蛋白酶中β-折叠含量变化显著（P＜0.05）。说明不同程度的压力处理会影响菠萝蛋白酶二级结构中β-折叠的含量。100 MPa和200 MPa处理后，菠萝蛋白酶中β-折叠含量增加。在200 MPa时达到最高，是常压下的2.76倍。300～600 MPa处理后，β-折叠含量呈现降低趋势。在600 MPa含量最低，比常压下降了41.05%。其变化规律与酶活力变化规律相似。不同压力处理之后，α-螺旋和β-转角的峰面积较常压下相比，含量变化显著（P＜0.05）。但二者变化的规律与酶活力变化规律的相关性较低。

图 3 β-折叠的含量与酶活力的关系

Fig.3 Relationship between β-sheet content and bromelain activity

由图3可知，不同压力处理菠萝蛋白酶，其二级结构中β-折叠的含量变化趋势与酶活力变化趋势相似。100～600 MPa不同程度压力处理，二者都呈现出先上升后下降的趋势，且二者同时在200 MPa时达到最大值。说明菠萝蛋白酶二级结构中的β-折叠的含量与酶活力大小具有相关性，β-折叠的含量越多，酶活力越大。

2.3 菠萝蛋白酶的活性与内部氨基酸微环境的关系

2.3.1 超高压处理菠萝蛋白酶后的内源性荧光检测

在蛋白质分子中有一些能发射荧光的氨基酸。比如色氨酸（Trp）、酪氨酸（Tyr）和苯丙氨酸（Phe）。但它们有不同的荧光激发和发射光谱。一般实验条件下Phe很难被激发。激发波长为295 nm时，仅有疏水性Trp残基被激发，并产生荧光。激发波长为280 nm时，菠萝蛋白酶内源荧光主要来自疏水性Trp残基和亲水性Tyr残基[21]。因此，选择295 nm和280 nm作为激发波长，观察菠萝蛋白酶内疏水性Trp残基和亲水性Tyr残基的微环境变化。

2.3.1.1 295 nm波长处激发的荧光强度

由图4可知，295 nm波长处激发，从常压（0.1 MPa）到600 MPa，发射波长位移变化范围在330～332 nm内，根据Burstern提出的色氨酸残基微环境的特点[22]，即1）λmax=330～332 nm，埋藏在非极性区域内；2）λmax =340～342 nm，固定在蛋白质分子表面，且与水的接触受到限制；3）λmax=350～352 nm，彻底暴露于水中（λmax为荧光发射光谱的峰位），处理前后的菠萝蛋白酶的色氨酸发射波长均在330～332 nm范围内，说明色氨酸残基埋藏在非极性区域内。从荧光强度变化情况来看，不同压力处理与对照组相比，除了100 MPa，其他条件的荧光强度变化都不显著（P＞0.05）。100 MPa处理，荧光强度增大，说明色氨酸残基的微环境发生了一定的变化。200、300、400、500、600 MPa处理，荧光强度几乎没有变化，说明色氨酸残基的微环境基本没有发生变化，也有可能是当压力超过100 MPa之后，随着压强继续增加，稍有变化的色氨酸微环境又逐渐被包埋起来，导致荧光强度变化不显著。因此，295 nm波长处激发，色氨酸残基在100 MPa时有一定的暴露伸展趋势，但并未完全暴露出来。

A. 0.1 MPa；B. 100 MPa；C. 200 MPa；D. 300 MPa；E. 400 MPa；F. 500 MPa；G. 600 MPa。下同。

图 4 不同压力37℃处理菠萝蛋白酶20 min、295 nm处
激发时的荧光光谱

Fig.4 Fluorescence spectra of bromelain treated by different pressures at 37 ℃ for 20 min at excitement wavelength of 295 nm

2.3.1.2 280 nm波长处激发的荧光强度

图 5 在37 ℃、不同压力处理菠萝蛋白酶20 min、280 nm处激发时的荧光光谱

Fig.5 Fluorescence spectra of bromelain treated by different pressure at 37 ℃ for 20 min at excitement wavelength of 280 nm

由图5可知，280 nm处激发，不同压力处理的菠萝蛋白酶荧光强度与对照组（0.1 MPa）相比变化显著
（P＜0.05）。100～600 MPa处理的菠萝蛋白酶的荧光强度呈先增加后下降的趋势。200 MPa时，荧光强度达到最大值4 934，比对照组的荧光强度增加了20.57%，说明此时菠萝蛋白酶内部亲水性酪氨酸残基暴露的最多。从200～600 MPa的压力变化过程中，荧光强度呈现降低趋势，说明裸露出来的氨基酸残基部分又被包埋起来。可以看出，压力的不断变化，会使菠萝蛋白酶内部不同氨基酸的微环境处于渐变的状态。结合在295 nm波长激发时（Trp）荧光强度变化不显著（P＞0.05），由此推断：280 nm处主要体现的是亲水性Tyr残基的暴露程度。同时，从菠萝蛋白酶氨基酸序列[5]可以看出，在菠萝蛋白酶的212 个氨基酸中（表2），共有11 个亲水性酪氨酸，占氨基酸总数的5.19%。它们分别位于第11、39、61、87、89、106、123、142、143、185和207位。不同程度的超高压处理后，很有可能是菠萝蛋白酶上述位置的酪氨酸附近的微环境发生了变化。

表 2 菠萝蛋白酶氨基酸序列

Table 2 Amino acid sequence of bromelain

2.3.1.3 荧光强度变化与酶活力的关系

图 6 37 ℃不同压力处理菠萝蛋白酶20 min、280 nm处激发荧光强度与酶活力的关系

Fig.6 Relationship between fluorescence intensity and bromelain activity treated by different pressure sat 37 ℃ for 20 min at excitation wavelength of 280 nm

由图6可知，280 nm处激发，菠萝蛋白酶的最大发射峰（波长）的荧光强度变化与酶活力的变化趋势相似。压力在0.1～200 MPa范围内，随压力增加，荧光强度也随之增加，说明Tyr残基暴露程度越大。与此同时酶活力也在增大，二者都在200 MPa处达到峰值（4 934，3 524 U/g）。酶活力比常压下提高了8.29%。随着压力继续增加，二者都呈下降趋势。由于280 nm波长处体现的主要是亲水性酪氨酸的暴露程度，所以经不同高压处理后，Tyr残基的暴露程度会影响菠萝蛋白酶活力。Tyr残基的暴露程度越大，酶活力越大。

2.3.2 超高压处理菠萝蛋白酶后的外源性荧光检测

蛋白质分子表面被一层亲水基包围。带有疏水侧链的残基一般位于其分子内部。蛋白质高级结构的特征是疏水与亲水之间的平衡。所以蛋白质高级结构的稳定在很大程度上依赖于分子内部的疏水作用[21]。蛋白质内疏水性氨基酸有蛋氨酸（M）、色氨酸（W）、苯丙氨酸（F）、缬氨酸（V）、亮氨酸（L）、异亮氨酸（I）、脯氨酸（P）和丙氨酸（A）。不同压力处理菠萝蛋白酶后，加入外源性探针ANS[23-24]，将228 nm作为激发波长，扫描荧光光谱图。不同压强处理菠萝蛋白酶，228 nm波长处激发时，荧光光谱图见图7。

图 7 37 ℃，不同压力处理菠萝蛋白酶20 min、228 nm处
激发时的荧光光谱

Fig.7 Fluorescence spectra of bromelain treated by different pressures at 37 ℃ for 20 min at excitement wavelength of 228 nm

由图7可知，228 nm处激发，不同程度高压处理的菠萝蛋白酶荧光强度与对照组（0.1 MPa）比变化显著
（P＜0.05）。说明高压处理后菠萝蛋白酶内部的疏水氨基酸的微环境发生了不同程度的变化。在200 MPa时，疏水氨基酸荧光强度最大（2 902），说明此条件下疏水性氨基酸残基暴露的最多。100～600 MPa处理时，荧光强度值出现了上下波动。说明在高压处理的过程中，疏水氨基酸有部分暴露和掩埋。菠萝蛋白酶一级结构[5]显示，疏水性氨基酸一共有78 个（表2），占所有氨基酸总数的36.8%。根据Lim规则[25]，在2～6、13～17、27～31、28～32、29～33、30～35、45～49、70～75、81～85、82～86、101～105、121～125、129～133、132～136、148～152、178～182、201～205、202～206等区域极易形成疏水性区域。推测高压处理后，可能是上述位置的氨基酸微环境有变化。228 nm波长处激发，由于荧光强度的变化与酶活力变化没有相似的规律性，所以疏水性氨基酸荧光总强度变化与酶活力变化相关性较差。

3 结 论

超高压作用菠萝蛋白酶后，空间结构会发生伸展或被重新包埋，这与Somkuti等[12]的研究结果相吻合。其中，菠萝蛋白酶大小与其二、三级结构的变化密切相关。二级结构研究显示，其酶活力大小与β-折叠的含量有关，β-折叠含量越大，酶活力越大。三级结构研究显示，亲水性酪氨酸的暴露程度与菠萝蛋白酶活力大小有关，其暴露程度越大，酶活力越大。

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