栓菌漆酶的异源表达及重组酶碳端和氮端组氨酸标签修饰对酶学特性的影响

刘英丽1，刘骏明1，王 静1，孙宝国1,*，THIERRY Tron2

（1.北京工商大学 食品质量与安全北京实验室，北京市食品添加剂工程技术研究中心，北京 100048；

2.Aix Marseille Université, CNRS, iSm2 UMR 7313, Marseille, France 13397）

摘 要：以来源Trametes sp.C30 的LAC3漆酶基因为研究对象，通过引物设计进行突变，在其C端和N端进行延长，分别引入6 个组氨酸标签，并异源表达于酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae中，将获得的重组酶进行比较发现漆酶末端氨基酸序列的改变对酶学性质的影响较大。C端引入组氨酸标签的重组酶的表达量不受影响，但是在N末端引入组氨酸标签的重组酶表达量只有LAC3的一半。添加组氨酸标签的融合蛋白对ABTS和SGZ两种底物的亲和力得到增强。而在酸碱稳定性耐受方面，与LAC3相比，N末端氨基酸的改变使其在酸碱稳定性方面得到了增强，中碱性条件下仍能保持较佳活性。C端和N端可塑性的研究对于漆酶新性状的获得具有重要意义。

关键词：漆酶；异源表达；组氨酸标签；碳端；氮端

Heterologous Expression of Trametes sp. Laccase in Saccharomyces cerevisiae and Characterization of Recombinant Enzyme by Fusing a Six-His Tag at N and C Termini

LIU Ying-li1, LIU Jun-ming1, WANG Jing1, SUN Bao-guo1,*, THIERRY Tron2

(1. Beijing Laboratory for Food Quality and Safety, Beijing Engineering and Technology Research Center of Food Additives,

Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China;

2. Aix Marseille Université, CNRS, iSm2 UMR 7313, Marseille 13397, France)

Abstract: Although some amino acid components and sequence of the active center are strongly related with laccase activity, the impact of C- and N-terminal modifications cannot be neglected. The effects of C- and N- terminal plasticity on the activity, structure and properties of Basidiomycetes laccase are still unclear so far. In this study, the laccase gene LAC3 was cloned from Trametes sp. C30 and two mutants were obtained by fusing an additional 6-histidine tag at both C and N termini. All these stains were successfully expressed in the yeast Saccharomyces cerevisiae. The recombinant enzymes obtained were compared and the results showed that the modification of terminal amino acid sequence of the enzyme considerably affected its characteristics. Compared with LAC3, the production of C-terminal histidine-tagged recombinant enzyme was not affected, but the production of N-terminal histidine-tagged recombinant enzyme was only half of the amount of LAC3. The affinity to the substrate ABTS and SGZ was enhanced by both histidine-tagged fusion proteins. Compared with LAC3, the pH stability was enhanced and the activity was maintained better under alkaline or neutral conditions with the modification on the N-terminal. Studies of the plasticity of the C and N termini have great significance to obtain new laccases.

Key words: laccase; heterologous expression; his-tag; C terminus; N terminus

中图分类号：TS201.2 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）21-0143-06

doi:10.7506/spkx1002-6630-201421028

漆酶（EC1.10.3.2）是一种含铜的多酚类氧化还原酶，最早于1883年从日本的漆树（Rhus vernicifera）汁液中发现，属蓝多铜氧化酶（blue multicopper oxidase，BMCOs）家族[1]。其广泛分布于自然界的昆虫、高等植物、真菌和细菌中，特别在大型真菌如担子菌、子囊菌和半知菌中发现较多。不同来源的漆酶，其结构、性质是不同的，典型的漆酶含有3 个结构域，活性中心含4 个铜离子，由于铜离子独有的氧化还原能力漆酶具宽泛的底物专一性，能催化多种酚类和芳香类化合物发生氧化直接生成水，基于此绿色特性，漆酶的应用非常广泛，目前的研究还主要集中在工业废水废料处理、纺织染料漂白[2]、纸浆木质素去除[3]、土壤和水的生物修复、生物燃料电池[4-6]和生物传感器[7-8]等方面。漆酶在食品工业中的应用比较有限，主要是利用漆酶氧化酚类底物的性质解决果汁和果酒中的沉淀问题[9]；另外，利用漆酶的氧化性以及漆酶与面粉中的阿魏酸能形成凝胶两者共同作用的特点，将漆酶应用于面制品中可以使馒头的品质有较大的提升，使其外观更白、结构更细密均匀、体积变大、富有弹性、锁住更多的水分[10]。随着研究的深入，漆酶在农产品加工改性、食品制造中的应用价值将被进一步挖掘激发出来，这也对漆酶的性质提出了更多的要求，例如高的氧化还原电势、中碱性条件下仍能保持最佳活性、较好的热稳定性等。然而，天然存在单一漆酶无法满足这些条件，因此寻找具有新特性的漆酶十分必要。

作为含有3 个结构域的具有催化活性的蛋白，通过突变来研究漆酶结构和功能的关系了解漆酶结构的可塑性是最常见的手段。许多研究结果表明了靠近活性中心特定位置的氨基酸与催化活性的关系，Solomon等[11-13]的研究小组作为先驱早在20世纪90年代就做了大量的工作，对活性中心氨基酸的定点突变与催化效率及电动势的关系做了详尽的研究。更有学者通过较大幅度的变化如结构域的互换来获得新性状的漆酶，Yuko等[14]将来源Lentinula edodes的不同漆酶lac1和lac4的结构域进行重组，并在烟草细胞中表达获得了比亲本更宽底物专一性的重组酶；Viviane等[15]将来源Trametes sp.C30漆酶的两个同工酶lac1和lac3结构域进行重组，获得的重组酶在降解蓝色蒽醌染料AB64上有较好效果。而C末端和N末端的加工作用对漆酶正确折叠的指导作用近年来也引起人们的极大兴趣，不同来源的漆酶其末端的加工作用差别很大。在子囊菌漆酶中，如热白丝菌漆酶MaL[16]和嗜热毁丝菌漆酶MtL[17]及粗糙脉孢菌[18]和柄孢霉[19]菌株中均发现C末端的修饰作用直接影响漆酶的活性，通过对热白丝菌漆酶MaL/rMaL[16,20]和沙生梭孢壳菌漆酶TaLcc1[21]晶体结构的分析发现，C末端的最后4 个残基Asp-Ser-Gly-Leu（DSGL）会在通向漆酶三核中心的通道中形成一个塞子，从而堵住了可能存在的氧气通道。因此，子囊菌中的C末端羧酸可能作为氧气还原成水的质子传递供体，从而影响蛋白的反应活性[22]。目前，C末端的重要作用在子囊菌漆酶中体现较为显著，而在漆酶来源非常广泛的担子菌中的作用尚未有界定，关于N端作用的研究也甚少。将获得的担子菌属栓菌漆酶序列通过3D模型进行结构模拟（如图1所示，结构示意图由Swiss Pdbviewer软件绘制）可以看出仅仅对末端进行定点突变可能意义不是很大，一定幅度的截平或者延长末端对担子菌漆酶结构和性质会有什么样的影响？本实验以担子菌漆酶Trametes sp. C30为研究对象，克隆得到漆酶基因lac3，利用突变的技术将其C端和N端延长，融合一个含有6 个组氨酸的标签，PEG/LiAc法转化酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae，并进行蛋白的纯化。通过对重组酶特性的研究，探讨担子菌漆酶C端和N端的延长对漆酶功能活性的影响。选择6 个组氨酸做标签进行延长，一方面是出于纯化的考虑，另一方面6 个组氨酸标签具有良好的金属螯合能力，可用于将酶分子定向固定在金属电极的表面形成自组装单层膜，有效地研究酶分子与底物间的电化学过程，为漆酶在生物电化学、生物传感器、人工生物膜等领域的研究与应用提供一定的研究基础。

图 1 来源于Trametes sp.C30的漆酶3D结构模型

Fig.1 3D structure model of laccase from Trametes sp. C30

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

Trametes sp. C30菌株、表达载体酿酒酵母S. cerevisiae
W303-1A由法国埃克赛马赛大学iSm2实验室Tron博士提供；大肠杆菌E. coli DH5α 美国Promega公司；选择培养基（1 L，无氨基酸酵母氮源培养基6.7 g、葡萄糖20 g、酪蛋白水解物5 g、腺嘌呤90 mg、色氨酸40 mg、琥珀酸盐缓冲液50 mmol/L，pH 5.3，
CuSO4 100 μmol/L） 美国BD公司；QuikChange Site-directed mutagenesis试剂盒 美国Stratagene公司；丁香醛连氮（syringaldazine，SGZ）、2,2-连氮-双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）（2,2-azinobis（3-ehtylbenzothiazolin-6-sulfnic acid）diammonium salt，ABTS） 美国Spectrum公司；Anti-his（C-term）-HRP抗体 美国Invitrogen公司。

1.2 仪器与设备

T100 PCR仪、电泳转印系列 美国Bio-Rad公司；V18R离心机 澳大利亚Dynamica公司；Genova Nano微量核酸蛋白分析仪 英国Jenway公司；Ecotron恒温摇床
瑞士Infors公司；FPLC AKTA Purifier 100 美国GE公司；UV-2700紫外-可见分光光度计 日本岛津公司。

1.3 方法

1.3.1 漆酶cDNA的克隆和突变体的构建

以总RNA为模板，按文献[23]的方法合成lac3 cDNA（GenBank登记号AY397783），克隆载体pAK145构建参见Klonowska等[23]的方法。在lac3漆酶C端和N端引入一个含有6 个组氨酸标签的融合蛋白，以pAK145为模板，采用QuikChange Site-directed mutagenesis kit进行定点突变，分别设计两对引物：YL1 5’-GAA GCT GCT TCG CCT CTC AAT GAT GGT GGT GAT GGT GGC GCC CGA GAC CGT CGG G-3’ 和YL2 5’-CCC GAC GGT CTC GGG CGC CAC CAT CAC CAC CAT CAT TGA GAG GCG AAG CAG CTT C-3’；YL3 5'-GGT CAA GTC CGT GAC AGG TCC ATG GTG GTG GTG ATG GTG TAT TGC TGC AGA TAT TTG GG-3’ 和YL4 5'-CC CAA ATA TCT GCA GCA ATA CAC CAT CAC CAC CAC CAT GGA CCT GTC ACG GAC TTG ACC-3’。循环反应参数为：95 ℃ 30 s；95 ℃ 30 s，60 ℃ 1 min，68 ℃ 10 min，共15 个循环。

1.3.2 转化酿酒酵母及漆酶的培养

聚乙二醇-醋酸锂（PEG-LiAc）诱导的化学转化法转化酿酒酵母S. cerevisiae W303-1A，SD平板中添加体积分数为0.02%愈创木酚作为阳性转化子的筛选指示剂。将获得的突变体漆酶在28 ℃，120 r/min条件下摇瓶培养。

1.3.3 漆酶活性测定

在30 ℃条件下连续监测2 min内丁香醛连氮（syringaldazine，SGZ）的氧化速率，在1 mL pH 5.5 醋酸盐缓冲体系中加入20 µL SGZ（0.8 mg/mL），漆酶每分钟每氧化1 μmol底物定义为1 个活力单位。

1.3.4 电泳条件及Western blotting杂交

采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，
SDS-PAGE）和 Native-PAGE分析蛋白的分离情况，后者不加入二硫苏糖醇（DL-dithiothreitol，DTT），不对样品进行煮沸。为了探明漆酶在非变性条件下的活性，将Native-PAGE凝胶剥离后浸泡在20 mmol/L pH 3.6的醋酸盐缓冲液中10 min，再通过添加了2 mg/mL的对苯二胺（p-phenylenediamine，PPD）进行染色，最后通过大量的水洗进行染色终止。漆酶抗体的获得通过免疫兔子获得多克隆抗体，抗原采用纯化后的天然Trametes sp. C30漆酶，对于突变体漆酶由于6 个组氨酸标签的融合，可使用Invitrogen公司的anti-his（C-term）-HRP抗体来对标签进行识别。样品通过SDS-PAGE来进行分离，电转移将蛋白转移至硝酸纤维素薄膜，二抗选用羊抗兔的抗抗体。

1.3.5 漆酶的纯化

将菌株液体发酵约4 d产生的胞外漆酶，在4 ℃、10 000 r/min条件下离心分离30 min获得上清液，再通过微滤处理进行浓缩，对于无标签的重组酶可将浓缩液上样至DEAE-纤维素柱、Sephacryl S200进行层析，对于含有组氨酸标签的蛋白可以直接将浓缩液通过Ni-NTA亲和层析柱进行纯化，最终得到电泳纯蛋白。

1.3.6 pH值和温度对酶活力的影响

重组漆酶最适pH值的测定是在Mcllvaine柠檬酸/磷酸盐缓冲液中，其pH值范围为2.2～9.0，漆酶的活性测定以SGZ为底物，测得的最大值作为100%。

pH值对酶稳定性影响的测定在室温条件下于Mcllvaine缓冲液中进行，测定在不同pH值条件下重组漆酶2、4、8、24 h的活性。温度对酶稳定性影响的测定是在不同温度条件下（30、40、50 ℃）将酶在100 mmol/L pH 5.5的醋酸盐缓冲液中孵育2 h，每间隔15 min测一次酶活力。

2 结果与分析

2.1 突变体漆酶序列的确定

通过与lac3序列比对，可以确认突变体漆酶的C端和N端成功融合了6 个组氨酸标签，部分序列比对结果如图2
所示，框内为融合的组氨酸标签。

2.2 阳性重组子产酶性质分析

平板中以添加愈创木酚为筛选标记，将能够产生红色晕圈的重组子挑选出来，在液体培养基中培养。发现随着培养时间的延长，在4～5 d左右重组漆酶活性达到最高峰，之后开始下降。C端和N端融合6 个组氨酸标签后对漆酶活力影响较大，但是考虑到胞内蛋白分泌量不同的影响，以比活力的计算来衡量融合标签后重组酶的特性更加有说服力。在最高峰t=120 h时，不添加标签的漆酶比活力为45 U/mg，C端和N端添加标签的重组酶比活力分别是24、20 U/mg。

将漆酶活力最高峰时的发酵液离心提取上清液后进行SDS-PAGE（凝胶银染）和Native-PAGE电泳，结果如图3所示。

A. SDS-PAGE；B. Native-PAGE。

图 3 重组酶发酵液上清蛋白电泳图谱

Fig.3 Electrophoresis of recombinant laccase in culture supernatants

由图3A可知，同不转入载体的阴性对照W303-1A相比，其他3 个重组酶在90 kD左右有一条明显的条带，而纯化后的LAC3对应的大小也是90 kD，可以分析得知重组后的漆酶表观分子质量在90 kD左右，比起理论分析值53 kD要高出许多，这可能是由于酿酒酵母做表达系统使漆酶的糖基化程度加重。由图3B可以看出，与阴性对照相比，3 个重组酶均有漆酶活性。

2.3 重组漆酶的纯化

对于LAC3重组酶的纯化采用两步层析法，添加了组氨酸标签的融合蛋白可以采用一步法通过Ni-NTA柱进行纯化，纯化后的蛋白上样进行SDS-PAGE和Western blotting分析，结果如图4所示。纯化后的蛋白表观分子质量在90 kD左右，与上清液分析的结果一致，Western blotting进一步证实纯化后的蛋白具有漆酶活性。

图 4 纯化后的6HN 和C6H重组酶SDS-PAGE（A）和
Western blotting（B）分析

Fig.4 Purity of 6HN and C6H enzymes assessed by SDS-PAGE
(A, 7.5%, 2 μg/lane) and Western blotting (B, anti-LAC, 4 μg/lane)

2.4 重组漆酶的性质研究

2.4.1 pH值和温度对酶活力的影响

图 5 pH值对漆酶活力的影响

Fig.5 Effect of pH on laccase activity

由图5可知，在极端酸性或碱性的条件下，3 种重组漆酶的活力均降低，在pH 5.5时酶残留活力最大，是其最佳pH值。在不同的pH值条件下将漆酶放置缓冲液中24 h并检测其活性，发现3 种重组酶在酸性如pH 2.2条件下3 种重组酶活性损失较大，残留活力LAC3为6%，6HN几乎完全失活，对酸性条件非常敏感，C6H忍耐力略高，残留酶活力为21%；而在中碱性条件下如在pH 8.0时活性稳定，残留活力LAC3为89%，C6H为63%，6HN具较强的碱性耐受力，为96%。以LAC3做参照，将融合C端和
N端组氨酸标签重组酶相对活力与LAC3的相对活力进行比较，研究标签对重组酶酸碱稳定性的相对影响随pH值的变化见图6。图6A表明总体来说不同的pH值条件下在N端添加标签获得的重组酶比LAC3的酸碱稳定性更高，而C端组氨酸标签的影响则相反（图6B）。同样，末端氨基酸序列的改变对热稳定性的相对影响（以LAC3做参照）随温度的变化见图7，可知末端添加标签对漆酶的热稳定性影响不大。

A. 6HN-LAC3；B. C6H-LAC3。下同。

图 6 融合组氨酸标签的重组酶与LAC3相对活力的差异随时间和
pH值的变化

Fig.6 Relative activity difference between fusion laccase as a function of time and pH

图 7 融合组氨酸标签的重组酶与LAC3相对活力的差异随时间和
温度的变化

Fig.7 Relative activity difference between fusion laccase and LAC3 as a function of time and temperature

2.4.2 酶动力学性质研究

在30 ℃、pH 6.0的磷酸盐缓冲液条件下分别以ABTS和SGZ为底物对3 种重组酶的酶促动力学参数进行测定，结果见表1。以SGZ做底物，C端和N端组氨酸标签的加入对Km影响不大，但是以ABTS做底物，C端氨基酸序列的改变对Km值影响较大，但是与底物的亲和力得到了增强。在对kcat/Km催化效率的影响方面，以SGZ做底物，C端氨基酸序列的改变使其催化效率降低一半，但是对ABTS做底物影响不大，N端氨基酸序列的改变使其催化效率略有降低。

3 讨 论

虽然活性中心某些氨基酸组成和排列顺序与漆酶活性紧密相关，但是C末端和N末端的修饰加工所带来的影响也不可忽视，C末端和N末端对漆酶的正确折叠的意义有待于进一步研究。Gu等[24]在毛头鬼伞漆酶的N端融合了一个含有10 个氨基酸的标签并表达在毕赤酵母中，获得的两个重组酶lac3和lac4，其表观活性的得到了显著的提高。本研究试图在LAC3漆酶的C端和N端进行延长，分别引入一个含有6 个组氨酸的标签，探讨了蛋白质两端氨基酸序列的变化对漆酶活性的影响。通过该实验成功获得了2 个仍具有活性的重组漆酶，Western blotting检验具有组氨酸标签，可用于漆酶自组装单层膜的后续研究。漆酶两端融合组氨酸标签异源表达后获得的新酶，与未融合的LAC3相比，两端氨基酸序列的改变使其比活力保持在50%左右。考虑到其对蛋白表达的影响，在C端引入组氨酸标签的重组酶的表达量不受影响，但是N末端引入组氨酸标签的重组酶其表达量只有LAC3的一半。添加组氨酸标签的融合蛋白对ABTS和SGZ两种底物的催化效率略有下降，但是对底物的亲和力得到增强。而在酸碱和热稳定性耐受方面，同LAC3相比，末端氨基酸的改变使其在酸碱稳定性方面得到了增强，热稳定性方面则变化不大。虽然在酶两端引入的氨基酸序列长度比较适中，仅6 个组氨酸，但是对酶性质的影响比较大，尤其是对N端的改造，这可能是因为N端插入氨基酸的位置离着胞外分泌信号肽的距离较近从而造成了表达量上的减少。

在对含标签的蛋白用Ni-NTA柱进行纯化过程中，发现蛋白结合在柱子上的量较少仅有10%～15%，造成纯化得率较低，即通过组氨酸与镍离子稳定的螯合作用的蛋白量少，而通过Anti-his（C-term）-HRP 抗体对蛋白进行检测时，所有的蛋白均有强烈信号，这可能是由于融合的组氨酸标签并未完全暴露在酶分子的表面，从而失去了与镍离子螯合的机会。Bleve等[25]发现杏鲍菇漆酶基因EYR4在酵母中表达时并没有漆酶活性，而通过对C端的氨基酸序列进行2～18 个不等氨基酸的切除时可获得对底物有不同亲和力的突变体，说明了C端序列对酶活力、稳定性和动力学的重要影响。也许通过对C端和N端的氨基酸序列进行部分切除，再加入组氨酸标签会有利于酶分子活性中心及融合蛋白的暴露，可作为下一步的研究展开探索。此外，结晶技术可能是比较直观获得漆酶结构的方式，但是需要的重组酶产量较大纯度较高，可通过对C和N末端截平后重组漆酶的变化比较后再做进一步深入研究。

另外，漆酶是一种糖蛋白，其含糖量和种类随来源的不同而不同，酿酒酵母表达后，漆酶的表观分子质量达90 kD左右。通过NetNGlyc 1.0对LAC3漆酶的序列进行N-glycosylation糖基化位点预测，其序列中含有7 个位点，假设每一条糖链有连接40 个甘露糖的潜力（约7 kD），7 个位点的分子质量共计约49 kD，而漆酶的理论分子质量在53 kD，总和与表观分子质量相近，说明漆酶含糖量非常高，发生了高度糖基化，而糖基化对漆酶结构和酶活性的影响还有待于进一步研究，可以考虑直接去糖基化或者更换一种表达系统。

总的来说，虽然担子菌漆酶C端和N端在漆酶中的作用还不明确，但是通过对漆酶C端和N端截平或者延长的可塑性研究，以期对担子菌漆酶结构和功能的关系有进一步了解，为漆酶的改性获得具有更好性状的新型酶制剂研究和开发提供一定的思路和借鉴。

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