鲊辣椒纯种发酵的菌株优选

崔小利1,2，王 薇1,2，阚建全1,2,3,*

（1.西南大学食品科学学院，重庆 400715；2.重庆市农产品加工及贮藏重点实验室，重庆 400715；

3.农业部农产品贮藏保鲜质量安全风险评估实验室（重庆），重庆 400715）

摘 要：通过对市售鲊辣椒样品中微生物的分离、鉴定，确定鲊辣椒发酵过程中的主发酵菌；再购买常用的几种发酵菌，通过其在最适条件下的产酸性和还原糖利用率等对菌株进行初筛；在初筛的基础上，再在实际生产中用产酸性、氨基酸态氮的生成和发酵成品的感官评分实验对其进行复筛。结果表明：鲊辣椒自然发酵过程中的主发酵菌是乳酸菌，纯种发酵的合适菌种是植物乳杆菌。纯种发酵弥补了传统自然发酵稳定性差，生产周期长等不足，可为实现鲊辣椒产品的工业化生产提供参考。

关键词：鲊辣椒；纯种发酵；菌株筛选

Screening Strains for Use in Pure Culture Fermentation for the Production of Zhalajiao, a Traditional Chinese Fermented Hot Pepper Product

CUI Xiao-li1,2, WANG Wei1,2, KAN Jian-quan1,2,3,*

(1. College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China; 2. Key Laboratory of Agro-products Processing and Storage of Chongqing, Chongqing 400715, China; 3. Laboratory of Quality and Safety Risk Assessment for Agro-products on Storage and Preservation (Chongqing), Ministry of Agriculture, Chongqing 400715, China)

Abstract: The dominant strains involved in the fermentation of a mixture of hot pepper with corn flour to produce Zhalajiao, a traditional Chinese fermented hot pepper product were isolated from commercial Zhalajiao samples and identified as lactic acid bacteria. Primary screening of seven species of lactic acid bacteria was conducted for acid production and reducing sugar utilization under optimal culture conditions, and their abilities to produce acid and amino acid nitrogen as well as sensory evaluation of the final products fermented with each strain were measured for secondary screening. Lactobacillus plantarum was suitable for the pure culture fermentation of Zhalajiao. The disadvantages of the traditional natural fermentation such as poor stability and long production period could be compensated by using the pure culture fermentation. This study may provide useful references for the industrial production of Zhalajiao.

Key words: Zhalajiao; pure culture fermentation; strain screening

中图分类号：TS205.5 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）21-0149-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201421029

鲊辣椒是川、鄂、湘、黔等地区的一种传统特色发酵食品，它以新鲜的红辣椒和玉米粉为主要原料，经过一个月左右的自然发酵形成。因其口感微酸微辣、香气特殊、回味醇厚等特点备受亲睐。辣椒营养价值高，不仅能增强食欲，防止动脉粥样硬化，还具有多种保健功能[1-5]。传统鲊辣椒以家庭作坊式为主，发酵采用自然开放式，参与发酵微生物来源于空气、水和使用的工具等，是一种多菌种混合发酵，并受季节、区域影响，且发酵周期较长，菌种、接种量、温度等的差异都会造成鲊辣椒的品质和风味不同，使得产品的质量不稳定，不适合工业化生产，影响了鲊辣椒的产业化发展[6]。众多研究者提出可以通过纯种发酵解决上述问题[7-9]，纯种发酵能使有益菌快速生长代谢，过程简单、易控，还会减少一些有害产物的积累[10]。目前，对于鲊辣椒的研究主要围绕鲊辣椒自然发酵过程中的各物质的消长变化[11-12]，也有少数学者研究过混合发酵工艺[13]，但鲊辣椒的纯种发酵研究还未见报道。因此，本研究拟首先分析自然发酵鲊辣椒产品中的微生物种类、比例，根据其发酵机制，确定各微生物菌群在发酵过程中所起的作用，选购合适的目的菌种，再对鲊辣椒纯种发酵技术进行初步探索，以期为鲊辣椒的纯种发酵技术提供基础实验数据。

1 材料与方法

1.1 材料

市售鲊辣椒样品，采购于贵州省遵义市的超市或农贸市场，散装称质量，样品编号及名称见表1。样品采购后均密封后贮存于4 ℃的冰箱中保存。

表 1 鲊辣椒样品信息表

Table 1 Details of commercial Zhalajiao used in this study

1.2 试剂与菌种

玉米粉、食盐 重庆市北碚区永辉超市；氢氧化钠
天津市瑞金特化学品有限公司；甲醛、3,5-二硝基水杨酸、亚硝酸钠 成都市科龙化工试剂厂；硝酸银 天津
光复科技发展有限公司；牛肉膏、蛋白胨、酵母浸粉、琼脂等 北京奥博星生物技术有限责任公司；所有试剂均为分析纯。

干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）、乳链球菌（Streptococcus lacticus）、肠膜明串珠菌（Leuconstoc meseteroides）、短乳杆菌（Lactobacillus brevis）、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）6001、嗜热乳链球菌（S. thermophilus）、保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus） 中国科学院菌种保藏中心。

1.3 仪器与设备

HH-6数显恒温水浴锅 金坛市富华仪器有限公司；722-P可见分光光度计 上海现科仪器有限公司；DHG-9240电热恒温鼓风干燥箱 上海一恒科技有限公司；PB-10 Sartorius酸度计 赛多利斯科学仪器有限公司；分析天平 上海精密科学仪器有限公司；HH.B11-600-S恒温培养箱 上海跃进医疗器械厂。

1.4 方法

1.4.1 市售鲊辣椒样品中微生物的分离和鉴定

采用选择培养基MRS培养基（分离乳酸菌）、醋酸菌培养基（分离醋酸菌）、马铃薯葡萄糖琼脂培养基（分离酵母菌）、高氏培养基（分离放线菌）、察氏培养基（分离霉菌）对市售的鲊辣椒样品进行微生物分离、筛选[14]。

参照GB4789.2—2010《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》，采用平板法测定各种选择培养基上的菌落总数，进行平板计数[15]。

1.4.2 乳酸菌发酵液的制备

根据样品中微生物的分离和鉴定结果确定出鲊辣椒的主发酵菌，然后以购于中国科学院菌种保藏中心的主要工业发酵菌种作为待筛选的菌种，并测定其生产性能。

乳酸菌发酵液的制备[16-17]：取乳酸菌保藏菌种2 环→斜面活化（48 h）→再取2 环于液体MRS培养基中再活化（48 h）→接入500 mL液体MRS培养基中扩大培养→乳酸菌发酵液（冷藏保存备用）。

1.4.3 待测菌在MRS培养基上的初筛实验

吸取待测乳酸菌发酵液5 mL，接种于MRS液体培养基100 mL中，于37 ℃恒温培养48 h，每隔6 h测定一次MRS 培养基中的pH值[18]、总酸含量[19]、还原糖含量、OD580 nm值。

pH值的测定参照GB10468—1989《水果和蔬菜产品pH值的测定方法》，用酸度计测定；总酸的测定参照GB/T 12456—2008《食品中总酸的测定》，采用中和滴定法，结果以乳酸计；还原糖的测定采用3,5-二硝基水杨酸法（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）比色法，结果以葡萄糖计。

1.4.4 待测菌在实际生产原料中的复筛实验

根据初筛结果选择4 种乳酸菌，取其发酵菌液5 mL，接种到原料（m（辣椒）∶m（玉米）=1∶1）中，添加辅料混匀后于30 ℃恒温培养5 d，每天测一次样品中的pH值、总酸、氨基酸态氮含量[20]。

氨基酸态氮含量的测定参照GB/T5009.40—2003《酱卫生标准的分析方法》，采用甲醛滴定法。

1.4.5 纯种发酵与自然发酵的对比实验研究[21]

根据复筛结果选出的最优菌在最适条件下进行纯种发酵所得的鲊辣椒产品与市售鲊辣椒产品进行感官评定，感官评分标准见表2。

表 2 鲊辣椒的感官评定评分标准

Table 2 Criteria for sensory evaluation of Zhalajiao

感官评定方法[22]：采用100 分制（评分项目为4 项5 个等级，每项占25 分）。请10 位有经验的食品专家和10 位消费者（非专业人员）按感官评分标准对鲊辣椒样品进行评分，取平均分作为最终评分。

1.5 数据处理方法

每个实验重复3 次，并用Origin软件进行数据统计分析和制图。

2 结果与分析

2.1 市售鲊辣椒样品中微生物的分离和鉴定

表 3 鲊辣椒样品中微生物的测定结果

Table 3 Strains isolated from Zhalajiao

由表3可知，所有样品中都没有放线菌检出；霉菌在部分样品（A、B、C）中检出，这可能是鲊辣椒产品在销售过程中被杂菌污染所致。样品D购于超市中，可能经过了灭菌处理，没有待测菌检出。鲊辣椒自然发酵中的有效菌是乳酸菌、酵母菌、醋酸菌，3 类菌数量不同，但差异不大，都在同一数量级。其中乳酸菌数量最高的是G样品为8.1×107 CFU/g，最低的是A样品为
6.8×107 CFU/g，但A样品中霉菌含量较高，可能是由于放置时间较长，乳酸菌已经衰减并且感染了霉菌等杂菌。就各种菌的菌落总数而言，乳酸菌、酵母菌、醋酸菌的比例大约是7∶3∶4，乳酸菌占有比例最大，发挥着发酵产酸的主要作用，而醋酸菌和酵母菌在自然发酵中起促进风味形成的作用。

在下面菌株筛选实验中，拟选择乳酸菌作为纯种发酵菌株，而工业上常用的蔬菜发酵乳酸菌种主要有：干酪乳杆菌、乳链球菌、肠膜明串株菌、短乳杆菌和植物乳杆菌。由于保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌产酸能力较强，是酸乳重要的发酵菌种。因此，选择这7 种乳酸菌作为待选菌种进行筛选，并依次编号记为：L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7。

2.2 待测菌在MRS培养基上的初筛实验

由图1、2可知，所有乳酸菌在MRS培养基中均能产酸，使培养基pH值下降、总酸增加。其中L1、L2、L3的产酸能力较低，L3在48 h时pH值达到5.20，总酸（以乳酸计）是0.48%；L4、L5、L6、L7产酸能力都比较高，48 h时pH值均低于4.5，产总酸大于1.30%。其中L5、L6产酸量较高，均达到了1.77%，产酸量最高的L7达到了1.84%。因此，依据产酸能力和发酵能力，L4、L5、L6、L7可作为工业发酵菌种。

图 1 MRS培养基中pH值的变化

Fig.1 pH changes in MRS medium during culture of lactic acid bacteria

图 2 MRS培养基中总酸的变化

Fig.2 Changes in total acid content (calculated as lactic acid) in MRS medium during culture of lactic acid bacteria

图 3 MRS培养基中还原糖含量的变化

Fig.3 Changes in reducing sugar content (expressed as glucose) in MRS medium during culture of lactic acid bacteria

由图3可知，这7 种乳酸菌在MRS培养基中对还原糖的利用率有较大差异，其中L1、L2、L3在48 h内还原糖（以葡萄糖计）含量降低少，说明这3 种菌还原糖利用率较低。而L4、L5、L6、L7的还原糖利用率相对较高。L5的还原糖含量从最初的7.6%经过48 h后骤减至0.68%，L6的还原糖消减量与L5相当，但L5最先开始快速利用还原糖。与此相比，L4和L7还原糖消减较少。结合图1和图2得出，这几种乳酸菌的产酸能力与还原糖利用率成正比。考虑到鲊辣椒的发酵原料（辣椒和玉米）中还原糖含量有限，因此还原糖利用率也是筛选鲊辣椒纯种发酵菌的关键因素。

图 4 MRS培养基中乳酸菌OD580 nm值的变化

Fig.4 Changes in cell density (expressed as OD580 nm) during culture of lactic acid bacteria in MRS medium

由图4可知，乳酸菌L1、L2、L3生长缓慢，而乳酸菌L4、L5、L6、L7生长速率和繁殖生长力较高，其中L5在12～30 h的OD580 nm值由0.117变化到0.468，可认为这段时间乳酸菌L5处于对数生长期，菌体数量增加最快，30 h后则进入稳定期生长趋于平缓。乳酸菌L4、L6、L7相对L5进入对数生长期时间较晚，约从24 h后开始，但L6的OD580 nm值在48 h时最高为0.532。乳酸菌L4和L7生长速率较缓慢，其最终OD580 nm值分别为0.430和0.480。

由图1～4可知，乳酸菌L1、L2和L3的生长能力、产酸性和发酵性能均较低，不适合作为纯种发酵的菌种。而L4、L5、L6、L7的产酸力和生长能力均较强，其中L5在生长速率上最快，L6最终繁殖生长量最高；L5、L6和L7产酸能力差异较小；L5、L6和L7的还原糖利用率较大，因此，将乳酸菌L1、L2、L3淘汰，选取乳酸菌L4、L5、L6、L7接种在实际生产原料中再次筛选。

2.3 待测菌在实际生产原料中的复筛实验

图 5 实际生产原料中pH值的变化

Fig.5 pH changes in the raw materials during fermentation with screened strains

图 6 实际生产原料中总酸含量的变化

Fig.6 Changes in total acid content (calculated as lactic acid) in the raw materials during fermentation with screened strains

由图5、6可知，接种乳酸菌的鲊辣椒发酵组（L4、L5、L6、L7）与自然发酵组（L0）相比，其pH值下降速率更快、产酸量更多。在发酵开始时，所有发酵组的pH值在6.80左右相差不大，发酵5 d后L0的 pH值降为5.37，而接种乳酸菌的鲊辣椒发酵组的pH值则降到4.2左右，其中接种了乳酸菌L5的鲊辣椒发酵组的pH值最低为3.81。接种乳酸菌L4、L5、L6、L7的鲊辣椒在发酵4 d时总酸含量（以乳酸计）达到0.94%以上，发酵5 d时总酸含量上升至1.1%左右，此段时间总酸含量增长缓慢，产酸量少，说明纯种发酵已成熟，但L0在5 d时总酸含量很低（0.43%）。因此，从产酸性来看，L5更适合作为鲊辣椒的纯种发酵菌。

图 7 实际生产原料中氨基酸态氮含量的变化

Fig.7 Changes in amino acid nitrogen content in the raw materials during fermentation with screened strains

氨基酸态氮是判定发酵产品发酵程度的特性指标，该指标越高，说明产品中的氨基酸含量越高。由图7可知，L0发酵5 d时氨基酸态氮含量为0.12%，接种了乳酸菌L5的氨基酸态氮含量最高为0.31%，L4、L6、L7则相对低些，分别为0.28%、0.27%和0.28。L5的氨基酸态氮增长速率一直较快，发酵到第4天时其含量已达到0.30%。鲊辣椒在发酵成熟后的贮存过程中氨基酸态氮会增加，但量较少。因此，L5更适合作为鲊辣椒的发酵菌。

2.4 纯种发酵鲊辣椒的感官评定

表 4 乳酸菌纯种发酵鲊辣椒样品的感官评分

Table 4 Sensory evaluation of Zhalajiao fermented with lactic acid bacteria

由表4可知，所有样品外观和组织的感官评分相差不大，这是由于所有样品的原料和前处理是相同的，但样品在滋味气味和口感方面评分结果相差较大。自然发酵组L0最低，原因是在发酵5 d时，其产酸量和氨基酸态氮含量还很低，发酵很不成熟，仍具有玉米生腥味及辣椒的鲜辣刺激味，鲊辣椒特有的风味还未形成，在风味和口感上都还属于没发酵好的产品，故其总分值最低。接种乳酸菌的鲊辣椒组在发酵5 d时，其总酸含量和氨基酸态氮含量已较高，在风味上已无玉米的生腥味，且有明显的酸辣味，与自然发酵鲊辣椒成品相差不大（LA、LB、LC是3 种自然发酵完全的鲊辣椒）。其中L5的总分值最高。

3 结 论

市售成品鲊辣椒的微生物分离鉴定表明乳酸菌为鲊辣椒的主要发酵菌种；选用7 种工业常用乳酸菌（干酪乳杆菌、乳链球菌、肠膜明串珠菌、短乳杆菌、植物乳杆菌、嗜热乳链球菌和保加利亚乳杆菌）作待测菌，通过在MRS培养基初筛和在实际生产鲊辣椒原料上的复筛，确定了植物乳杆菌可作为鲊辣椒纯种发酵的菌株。

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