不同场景下冷却猪肉中气单胞菌到
小青菜的交叉污染

王海梅，董庆利*，刘 箐，胡孟晗，姚 远

（上海理工大学医疗器械与食品学院，上海 200093）

摘 要：为了定量分析厨房内冷却猪肉中气单胞菌（Aeromonas spp.）在案板、刀具、手以及小青菜之间的交叉污染水平，采用一定方式将气单胞菌接种于精腿肉中，模拟消费者在厨房中食物准备过程，对猪肉进行分割，分别测定气单胞菌到案板、刀具、手的转移率；同时，测定6 种设定场景下接种于3 种介质表面的气单胞菌到小青菜的转移率，并通过对数转换后进行频数分布拟合。此外，以场景1即切过猪肉后各介质不做任何处理的情况为例对交叉污染进行仿真模拟。结果表明：各组转移率在一定范围内变化且差异显著，经对数转换后的转移率符合或接近正态分布。交叉污染的仿真模拟证实，若食用产生交叉污染的猪肉和蔬菜将存在一定的风险，再结合烹饪阶段的评估以及剂量-反应关系研究，可为构建完整气单胞菌风险评估体系提供理论参考。

关键词：冷却猪肉；小青菜；气单胞菌；交叉污染；转移率

Cross-Contamination of Aeromonas spp. from Chilled Pork to Brassica chinensis under Different Food-Handling Scenarios

WANG Hai-mei, DONG Qing-li*, LIU Qing, HU Meng-han, YAO Yuan

(School of Medical Instrument and Food Engineering, University of Shanghai for Science and Technology, Shanghai 200093, China)

Abstract: The purpose of this work was to quantify the cross-contamination of Aeromonas spp. from chilled pork to Brassica chinensis through cutting boards, knives and hands in the kitchen. Transferring experiments were performed to mimic the food preparation process of consumer under laboratory conditions. The pork sample was inoculated with A. spp. before splitting to determine the transfer rate of Aeromonas spp. from chilled pork to cutting boards, knives and hands, respectively. Meanwhile, transfer rates from cutting boards, knives and hands to B. chinensis under various food-handling scenarios were also determined. Transfer rates were logarithmically transformed to fit distributions and take scenario 1(after cutting pork, cutting boards, knives and hands were also used for cutting B. chinensis without any cleaning) as an example to simulate cross-contamination. The results showed that each set of transfer rates varied significantly over experiments
(P ＜ 0.05), and transfer rates with logarithmic transformation proved to be approximately normally distributed. The analogue simulation of cross-contamination showed the cross-contamination of foodborne pathogens from raw meats to ready-to-eat foods suggesting some potential risks to consumers. Combined with cooking stage assessment and dose-response relationship, these results could provide theoretical references for complete establishment of Aeromonas spp. risk assessment.

Key words: chilled pork; Brassica chinensis; Aeromonas spp.; cross-contamination; transfer rate

中图分类号：TS 201.3 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）21-0196-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201421038

食品安全是世界性公共安全问题，致病菌是引起食源性疾病的重要原因之一[1]。气单胞菌（Aeromonas spp.）是冷却猪肉中常见优势腐败菌之一[2]，同时被证实是一种可导致胃肠炎和败血症的人畜共患致病菌[3-4]。近年关于气单胞菌引起食源性疾病的报道日益增多[5-7]，为降低病原菌造成的危害，监测其生长及变化规律变得尤为重要。在已有冷却猪肉中气单胞菌的暴露评估研究中，以其一级和二级生长模型为基础[8]，并以销售、运输以及贮藏阶段的时间和温度为主要影响因素来评估猪肉最终污染水平和食用的风险[9]，并未涉及厨房内交叉污染环节。据调研表明，约40%～60%的食源性疾病与消费者在厨房内食物准备过程中不恰当的操作行为有关[10-11]。国外关于交叉污染的研究常以沙门氏菌（Salmonella）[12-14]、单增李斯特菌（Listeria monocytogenes）[15]、空肠弯曲杆菌（Campylobacter）[16-17]等为对象，且多集中于对交叉污染的来源和途径[16]、转移率影响因素[18-19]等方面的认识。气单胞菌作为冷却猪肉中优势腐败菌之一，在猪肉腐败过程中起到关键性作用[20]，对气单胞菌在厨房内的交叉污染进行研究十分必要。

本实验模拟消费者在厨房内准备食物过程中常见的6 种场景，测定气单胞菌在猪肉、案板、刀具、手和小青菜之间的转移，根据公式计算各组转移率，并选用Origin8.0软件对经对数转换的转移率进行频数分布拟合。此外，采用@Risk5.5软件中蒙特卡罗（Monte Carlo）抽样方法对交叉污染进行仿真模拟，可为构建完整气单胞菌风险评估体系提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与培养基

购于上海卜蜂莲花超市优质金锣精腿猪肉和小青菜，被迅速置于0～4 ℃冰箱中冷藏备用。

平板培养所用气单胞菌培养基基础（RYAN），购于青岛海博生物技术有限公司；气单胞菌液体培养基配制参照文献[21]。

1.2 菌种选用、活化及菌悬液的制备

气单胞菌（CICC 23564）购于中国工业微生物菌种保藏管理中心，于27 ℃条件下置于液体培养基培养18 h，用接种环蘸取原菌液进行平板划线，活化3 次。挑取长势较好的单菌落接种于200 mL气单胞菌液体培养基，在27 ℃条件下培养18 h，使菌液浓度达到8（lg（CFU/mL））。

1.3 介质接种及带菌量测定

在超净工作台内称取25 g肉样置于洁净玻璃器皿表面，用无菌枪头将0.5 mL菌悬液涂布于肉样表面，为使气单胞菌较均匀地黏附在肉样表面，借用无菌钳将肉块翻动数次后将其静置10 min。在6 种场景下，案板、刀具和手表面亦采用表面涂布的方式获得一定初始污染水平，接种量及接种区域见表1。

接种肉样的初始污染水平和小青菜的最终带菌量按国标法GB4789.2—2010《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》[22]进行定量。案板、刀具、手的初始污染水平根据测定的菌悬液的浓度通过简单计算可得。被转移到案板、刀具、手表面的气单胞菌则采用擦拭取样法进行定量测定[23]。

表 1 不同场景下案板、刀具、手的接种和处理方式

Table 1 Inoculation and subsequent treatment of cutting boards, knives, hands under different scenarios

1.4 场景设计及介质灭菌方式

将接种肉样置于无菌案板5 cm×5 cm区域内，用无菌刀具切割10 次，进而测定被转移到案板、刀具和手表面的气单胞菌数量，每组实验重复10 次。

测定接种案板、刀具、手表面气单胞菌向小青菜的转移率时，设定了6 种在食物准备过程中常见的场景[24-26]，各场景下介质接种方式以及接种后处理方式见表1，每组实验重复8次。

实验开始之前，案板、刀具、手和小青菜均需采取相应措施进行灭菌处理，具体方式见表2，其中案板、手所采用的灭菌方式经过多次实验验证后可行。

表 2 各介质灭菌方式

Table 2 Sterilization methods of different items

1.5 转移率的测定及分布拟合

应用Microsoft Excel对实验数据进行统计，根据公式（1）计算每组转移率[28]，并采用SPSS18.0软件对不同组转移率进行显著性检验。

（1）

式中：T为转移率；N0为细菌供体表面带菌量/（CFU/g或CFU/cm2）；Nr为细菌受体表面带菌量/（CFU/g或CFU/cm2）。

转移率经对数转换并以0.25为间隔对其进行归类，以特定数值出现频数为纵坐标，采用Origin 8.0软件进行频数分布拟合。

1.6 交叉污染的仿真模拟

冷却猪肉中气单胞菌在进行厨房操作前的初始污染水平，根据董庆利等[9]对冷却猪肉中气单胞菌从销售至家庭贮存阶段的定量暴露评估进行确定，并将场景1实验所得各组转移率采用@Risk5.5软件进行最佳分布拟合，结果见表3，并采用蒙特卡罗（Monte Carlo）抽样方法对各个参数进行模拟，用概率分布的形式描述小青菜最终污染水平。

表 3 交叉污染仿真模拟过程中各参数的设置

Table 3 Parameter settings for cross-contamination analogue simulation

注：Tx. 转移率；下标M. 冷却猪肉；下标B. 案板；下标K. 刀具；下标H. 手；下标L. 小青菜。例如：TMB表示猪肉中气单胞菌到小青菜的转移率。

2 结果与分析

2.1 气单胞菌转移率

转移率可被定义为一个细菌从供体表面通过相互接触转移到受体表面的概率[29]。冷却猪肉中气单胞菌到案板、刀具和手的转移率的平均值、标准差以及变化范围见表4，猪肉在切割过程中，气单胞菌被转移到三者表面的可能性大小的平均值及变化范围分别为16.35%（1.74%～36.57%）、1.16%（0.62%～2.85%）、12.37%（4.01%～45.70%）。经SPSS 18.0软件显著性检验可知，TMB和TMH无显著性差异（P＞0.05），而TMK与TMB、TMH均存在显著性差异（P＜0.05）。可见，猪肉中气单胞菌被转移到刀具的可能性明显小于被转移到案板和手的可能性。

表 4 冷却猪肉中气单胞菌到案板、刀具和手的转移率（

x

±s）

Table 4 Transfer rates of Aeromonas spp. from chilled pork to cutting boards, knives and hands (

x

±s)

注：同列小写字母不同表示差异显著（P＜0.05）。

在6 种不同场景下，接种于案板、刀具和手表面的气单胞菌在小青菜切割过程中被转移的状况见表5。在场景1时，即在实际操作过程相当于切过冷却猪肉后案板、刀具、手不做任何清洗而直接用来切割小青菜，此时三介质表面气单胞菌到小青菜的转移率及变化范围分别为18.59%（6.41%～34.84%）、5.30%（1.12%～13.10%）、8.86%（3.16%～16.89%）。在场景2时，接种过气单胞菌的三介质分别用500 mL无菌水进行冲洗后切割小青菜，此时转移率及变化范围分别为0.38%（0.10%～0.81%）、0.09%（0.01%～0.24%）、0.43%（0.12%～1.79%）。在场景6时，小青菜中仅能检测到极少量气单胞菌的存在（＜10 CFU/g），各组转移率接近或等于零。场景3、4、5在食物准备过程中分别相当于切割冷却猪肉后及时更换案板、更换刀具和彻底清洗手，由表5可知，刀具和手、案板和手、刀具和案板表面气单胞菌到小青菜转移率平均值分别16.5%、25.72%、27.07%，变化范围分别为5.85%～38.49%、11.19%～46.05%、11.85%～69.42%。不同之组转移率的显著性检验见表5。

表 5 不同场景下案板、刀具和手表面气单胞菌到小青菜的转移率

Table 5 Transfer rates of Aeromonas spp. from cutting boards, knives and hands to B. chinensis under different scenarios

注：ND. 在检测限以下。

2.2 转移率的频数分布拟合

图 1 猪肉中气单胞菌到案板、刀具、手的转移率的
百分数对数值的频数分布

Fig.1 Frequency distribution of the lg T% of Aeromonas spp. from chilled pork to cutting boards, knives and hands

从猪肉中气单胞菌到案板、刀具和手的转移率经对数转换的频数分布拟合结果图1可知，猪肉中气单胞菌到刀具的lg T以0.25为间隔进行归类后，在10 次重复实验中，－0.25、0、0.25、0.5出现的次数分别为2、6、1、1 次。猪肉中气单胞菌到案板和手表面的转移率的对数值相对分散且右移，表明这两组转移率较高且变化范围大，近乎重叠的图形再次证明两组转移率无显著性差异。

图 2 不同场景下案板、刀具、手表面气单胞菌到小青菜转移率百分数对数值的频数分布

Fig.2 Frequency distribution of the lg T% of Aeromonas spp. from cutting boards, knives and hands to B. chinensis

5 种场景下案板、刀具、手表面的气单胞菌到小青菜的转移率经对数转换后的频数分布拟合如图2所示，在1、2、3、5场景时，lgT较大且集中，场景2下lgT则相对较小。从频数分布拟合图可知转移率并非毫无规律，经对数转换后通常符合或接近正态分布，并且从图中可知lgT最可能出现的数值及概率，据此可推断气单胞菌从供体表面经交叉污染被转移到受体表面的最大可能性。

2.3 交叉污染的仿真模拟

冷却猪肉中气单胞菌经过销售、运输和贮存阶段后污染水平为见图3，污染范围从－0.8（lg（CFU/g））（5%置信水平）至7.6（lg（CFU/g））（95%置信水平）。

图 3 猪肉中气单胞菌的初始污染水平

Fig.3 Initial contamination level of Aeromonas spp. in chilled pork

将表3中各参数作为输入变量，以小青菜中气单胞菌最终污染水平作为输出变量，采用@Risk软件进行10 000 次蒙特卡罗模拟，得到的结果如图4所示，小青菜污染水平从－0.08（lg（CFU/g）） （5%置信水平）至1.44（lg（CFU/g））（95%置信水平），均值为0.41（lg（CFU/g））。此结果表明，猪肉中部分气单胞菌经案板、刀具和手转移到小青菜，并且小青菜中出现较高带菌量的情况时有发生，如超过5（lg（CFU/g））的可能性为0.1%。

图 4 小青菜中气单胞菌的污染水平

Fig.4 Contamination level of Aeromonas spp. on B. chinensis

3 结论与讨论

致病菌在食物接触表面传递产生的交叉污染是引起食品安全事故的重要因素之一。本实验模拟猪肉、小青菜为代表的猪肉沙拉的准备过程，定量分析了不同场景下气单胞菌在各介质间的传递率，但研究中存在一定的不足。在实验过程中，猪肉及各介质保持较高的污染水平，但实际情况并非如此，而初始接种量与转移率负相关[18]，因此实验所得数据存在一定的局限，若使初始接种量多样化，转移率的测定将更具代表性。此外，猪肉在接菌前未进行灭菌处理，其本身含有的气单胞菌会对实验结果造成一定程度的影响，但以往采用的热漂方式（70 ℃，40 s）[12]因较大程度破坏表面肉质影响转移率的测定从而更不可取，因此寻求合适的方式对猪肉进行灭菌在交叉污染的研究中十分重要。

上述结果表明，同一组转移率并非固定值，不同组转移率的平均值和标准差也存在差异，造成此结果的因素较多。Dawson等[30]认为接触时间的增加能一定程度提高转移率，Vorst等[31]的研究表明，压力与转移率显著正相关，然而在不同的实验重复时，两表面接触的时间和压力并不完全一致，从而造成转移率的变异性。此外，实验方法自身存在的缺陷也导致转移率不断变化。本实验采用擦拭取样法对介质表面的气单胞菌进行定量，然而该方法并不能将介质表面的细菌全部采集并进行计数，从而使得实验所测转移率较实际情况偏低；平板计数法是最常见菌落计数方式之一，但在较低的平板计数时存在的误差较大，并且误差随稀释倍数的增大而更加显著[32]，以上因素均是转移率变异性的重要来源。接触表面的理化性质对转移率的影响也不容忽视，本研究中猪肉中气单胞菌到不锈钢刀具的转移率以及刀具表面气单胞菌到小青菜的转移率平均值相对较低（分别为1.16%、5.30%（场景1）），可见不锈钢刀具的光滑表面并不利于气单胞菌的转移，而以相对粗糙的案板和手为研究对象时，得到的转移率较高，此结果与Vorst等[31]观点一致，后者认为较粗糙的表面因摩擦力的存在有利于细菌的转移。同时，本研究在6 种不同场景下介质表面的气单胞菌向小青菜转移率的测定结果表明，更换案板（16.50%）、更换刀具（25.72%）、仅仅清洗手（27.07%）等措施，均不能有效控制交叉污染的水平，用适量的水清洗案板、刀具和手则能较大程度减少交叉污染（此时TBL、TKL、THL均值分别为0.38%、0.09%、0.43%），但并未能完全消除细菌被转移的可能性。若清洗时加入一定的洗洁精并用铁丝球擦拭，交叉污染发生的可能性极低，此时转移率接近或等于零。如何有效控制交叉污染水平也是国外研究的热点，如Scott等[33]的研究表明，一些致病菌在潮湿的器具表面时生存能力较强且更易被转移，因此保持厨房器具以及清洁用品的干燥有很大的实际意义。此外，选择合适的厨房用具也很重要，Koo等[34]比较了棉布、超细纤维布、洗涤布、非纺织物、毛巾布这5 种材质的清洁布的除菌能力，结果表明棉布在实验中表现最好。Soares等[27]证实木质案板表面的致病菌最难去除，而不锈钢的案板最易清洗。这些研究为消费者如何有效减少厨房中的交叉污染提供正确的理论指导。

交叉污染的仿真模拟表明，因交叉污染生鲜猪肉中气单胞菌被部分转移，导致蔬菜有一定的污染水平，若蔬菜在食用前不经烹饪且猪肉在烹饪时有部分气单胞菌残留，则会导致一定的食用风险。然而，现有文献中缺少气单胞菌剂量-效应模型的相关报道，因此并不能精确推断其中的风险。

本实验对猪肉中气单胞菌经案板、刀具和手到小青菜的交叉污染的定量分析表明，每组转移率并非固定值且变化显著，交叉污染对于猪肉沙拉中气单胞菌的最终污染水平有较大影响，若切割生鲜猪肉后采取恰当清洗方式对接触介质进行清洗，则能有效减少或拒绝交叉污染。此外，本实验有助于更清晰地认识交叉污染的来源、途径及影响，并为构建完整的气单胞菌风险评估体系提供一定理论参考。

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