败酱草多糖的组成及抗疲劳与耐缺氧作用

池爱平，康琛喆，郭欢欢，李 虹，王一民，郭 飞

（陕西师范大学体育学院，陕西 西安 710119）

摘 要：目的：评价败酱草多糖（Herba Patriniae polysaccharide，HPP）抗疲劳和耐缺氧的活性。方法：采用水提醇沉法提取HPP，对其基本成分组成进行测定；同时建立小鼠负重游泳模型和耐缺氧模型，同时给予小鼠不同剂量的HPP水溶液，测定小鼠力竭游泳时间与耐缺氧时间以及血乳酸（blood lactic acid，BLA）、血尿素氮的浓度和肌酸激酶（creatine kinase，CK）活性、肝糖原和肌糖原的含量。结果：HPP是一种含蛋白质的多糖，蛋白质含量为13.26%，单糖主要由D-甘露糖、L-鼠李糖、D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖、D-半乳糖、L-阿拉伯糖以物质的量比0.53∶0.35∶3.18∶1∶2.72∶1.27组成；服用HPP可使小鼠游泳力竭时间显著延长、肝糖原含量升高，而BLA含量和CK活性均不同程度下降，但耐缺氧时间变化不明显。结论：HPP具有抗疲劳的作用，但其对小鼠的耐缺氧作用不明显。

关键词：败酱草多糖；力竭运动；疲劳；缺氧

Composition of Polysaccharides from Herba Patriniae and Their Anti-fatigue and Anti-hypoxia Activities

CHI Ai-ping, KANG Chen-zhe, GUO Huan-huan, LI Hong, WANG Yi-min, GUO Fei

(School of Sports, Shaanxi Normal University, Xi’an 710119, China)

Abstract: Objective: To evaluate the anti-fatigue and anti-hypoxia effects of Herba Patriniae polysaccharide (HPP). Methods: HPP was extracted by using the method of water extraction and subsequent alcohol precipitation, and its main components were determined. A weight loaded swimming model and a hypoxia model in mice were established. Meanwhile, the mice were given different dose of HPP by oral gavage, and their hypoxia resistance time and swimming time until exhaustion were determined, and then blood lactic acid (BLA) and blood urea nitrogen (BUN) contents, creatine kinase (CK) activity and the contents of hepatic glycogen and muscle glycogen were measured. Results: HPP was a protein-bound polysaccharide composed of D-Man, L-Rha, D-GalUA, D-Glc, D-Gal and L-Ara with a molar ratio of 0.53:0.35:3.18:1:2.72:1.27. HPP could prolong the swimming time until exhaustion of mice and significantly increase the hepatic glycogen level but decrease the levels of BLA and CK. Conclusion: HPP has an anti-fatigue effect but no anti-hypoxia effect in mice.

Key words: Herba Patriniae polysaccharide; exhaustive exercise; fatigue; hypoxia

中图分类号：G804.7 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）21-0212-04

doi:10.7506/spkx1002-6630-201421041

通过有针对性地补充外源性营养补剂或药物活性成分来延缓或缓解运动员运动疲劳的发生，是解决运动性疲劳的有效途径之一。研究表明，许多植物多糖成分具有改善运动性疲劳的作用[1-3]，其作用机制大多与提高机体糖储备以及提高机体免疫能力等方面有关，故多糖抗运动性疲劳方面的研究成为近几年运动营养学领域的一个研究热点。败酱草是属于败酱科的一种草本植物，具有清热解毒的作用，在我国各地均有生长，此外败酱草还含有丰富的营养素，在许多地方被作为野生蔬菜食用[4-5]。
近几年的研究表明，败酱草多糖（Herba Patriniae polysaccharide，HPP）具有抗呼吸道合胞病毒[6]、抗宫颈癌[7]和抗氧化[8]等药理活性。目前还未检索到有关于HPP的抗疲劳与耐缺氧方面的研究，因此本实验对陕西产败酱草的多糖成分进行提取，建立小鼠负重游泳模型与耐缺氧模型，通过灌胃小鼠HPP来评估其抗疲劳与耐缺氧的效果。

1 材料与方法

1.1 动物、材料与试剂

实验动物为健康昆明种雄性小鼠，两月龄，体质量22～26 g，购自西安交通大学医学院实验动物饲养中心。

败酱草购于西安市吴家坟中药店，粉碎后备用。

D-甘露糖（D-mannose，D-Man）、D-核糖（D-ribose，D-Rib）、L-鼠李糖（L-rhamnose monohydrate，L-Rha）、D-葡萄糖醛酸（D-glucuronic acid，D-GlcUA）、D-半乳糖醛酸（D-galacturonic acid，D-GalUA）、D-葡萄糖（D-glucose，D-Glc）、D-木糖（D-Xylose，D-Xyl）、D-半乳糖（D-galactose，D-Gal）、L-阿拉伯糖（L-arabinose，L-Ara）、D-岩藻糖（D-fucose，D-Fuc） 美国Sigma公司；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（3-methyl-1-phenyl-2-pyrazolin-5-one，PMP）、三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA） 北京化学试剂公司；甲醇、乙腈（均为色谱纯） 美国Honeywell公司；透析袋（MW10 000） 北京鼎国生物技术有限责任公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

752B型分光光度计 上海第三分析仪器厂；DD5低温高速离心机 湖南凯达科学仪器有限公司；旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂；Christ ALPHA 1-4冷冻干燥机 德国Christ公司；紫外-可见分光光度计 上海分析仪器厂；Shimadzu LC-2010A高效液相色谱仪、Shimadzu Class-VP 6.1色谱工作站 日本岛津公司。

1.3 方法

1.3.1 HPP的提取工艺

干燥败酱草皮→粉碎→80%的乙醇浸泡30 min→滤渣水提（料液比1∶15（m/V）、温度80 ℃、时间2 h、提取次数2 次）→过滤→Sevag法脱除游离蛋白质→透析袋对水透析24 h→浓缩→终体积分数为80%的乙醇沉淀→无水乙醇、丙酮、乙醚依次洗涤→冷冻干燥→HPP

1.3.2 HPP的组成测定

多糖含量测定采用蒽酮-硫酸法[9]；糖醛酸含量测定采用硫酸-咔唑法[10]；蛋白质含量测定采用双缩脲法[11]。紫外光谱采集：称取HPP 5 mg，配成0.5 mg/mL的溶液，以蒸馏水为对照，在紫外光谱仪190～600 nm波长区域扫描。

单糖组成分析[12-13]：采用高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）。取HPP 20 mg，置于具塞试管中，加水1 mL，加热溶解后加入0.2 mol/L的TFA 1 mL，放入烘箱中，110 ℃水解8 h，冷却至室温，加0.2 mol/L的NaOH溶液调pH值
为7，将水解液用重蒸水稀释至10 mL，转移到量瓶中，待测。对照液制备：分别称取适量D-Man、D-Rib、L-Rha、D-GlcUA、D-GalUA、D-Glc、D-Xyl、D-Gal、L-Ara、D-Fuc，用10%甲醇配成0.1 mol/L的溶液。各取100 μL样品液与对照液，依次加入0.5 mol/L PMP甲醇溶液200 μL、0.3mol/L NaOH溶液300 μL，70 ℃水浴60 min后冷却至室温，用0.3 mol/L盐酸溶液300 μL中和，加入氯仿1.0 mL萃取，振荡、离心，弃去下层液，重复3 次，0.45 μm微孔滤膜过滤，取滤液10 μL准备上样。采用梯度洗脱方式。流动相A液为纯乙腈；B液由0.45 g KH2PO4、0.5 mL TFA、100 mL乙腈和900 mL超纯水组成（pH 7.5）。色谱柱：Venusil C18 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；梯度洗脱：0 min，94% B液；4 min，94% B液；5 min，88% B液；30 min，88% B液；进样量10 μL，流速1.0 mL/min，检测波长为250 nm，柱温为35 ℃。

1.3.3 抗疲劳实验

小鼠随机分为3 组（每组30 只）：对照组、HPP低剂量（100 mg/（kg•d））组和HPP高剂量
（200 mg/（kg•d））组。HPP低、高剂量组每天灌胃相应剂量的多糖水溶液，对照组灌胃等量的生理盐水，连续灌胃5 周。末次给药30 min后，从各组中随机取出10 只小鼠进行负重（体质量5%）游泳实验，水温28 ℃，记录各组小鼠游泳力竭时间（力竭判断的标准：小鼠头部沉入水中5 s不能浮出水面）。小鼠力竭后立刻采血取材，测定血乳酸（blood lactic acid，BLA）、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）的浓度和肌酸激酶（creatine kinase，CK）活性。同时在各组剩余小鼠中随机选择10 只，不参与力竭游泳，直接麻醉取材，测定肝糖原与肌糖原含量。均使用南京建成生物制剂公司的试剂盒测定。

1.3.4 耐缺氧实验方法

参照文献[14]方法，对各组剩下的10 只小鼠进行耐缺氧实验。准备带塞的广口瓶若干，每瓶加入5 g的钠石灰，每瓶放入1 只小鼠，用凡士林涂抹瓶塞和瓶口，密闭，计时，直至小鼠呼吸停止，记录小鼠的存活时间。

1.3.5 延长率的计算

按照下式计算抗疲劳实验和耐缺氧实验时间的延长率。

1.4 数据处理

数据用SPSS 10.0统计软件进行分析，组间比较采用t检验进行比较，数据用

±s表示。

2 结果与分析

2.1 HPP的组成

采用水提醇沉法从1 000 g败酱草原料中提取出HPP 25.4 g，得率为2.54%。蒽酮-硫酸法测定多糖含量为58.85%，D-GalUA含量为35.20%，双缩脲法测定蛋白质含量为13.26%；紫外光谱图（图1）显示HPP在280 nm波长左右有强吸收峰，表明其确实含有结合蛋白，属于蛋白多糖。HPP的HPLC色谱图（图2）显示：HPP主要含有D-Man、L-Rha、D-GalUA、D-Glc、D-Gal和L-Ara，其物质的量比依次为0.53∶0.35∶3.18∶1∶2.72∶1.27。

图 1 HPP的紫外光谱图

Fig.1 Ultraviolet spectrum of HPP

a.标准单糖对照色谱图；b. 样品单糖色谱图。
1. D-Man；2. D-Rib；3. L-Rha；4. D-GlcUA；5. D-GalUA；6. D-Glc；7. D-Xyl；8. D-Gal；9. L-Ara；10. D-Fuc。

图 2 HPP的HPLC色谱图

Fig.2 HPLC chromatograms of HPP

2.2 小鼠力竭游泳时间与耐缺氧时间的测定结果

表 1 各组小鼠力竭游泳时间与耐缺氧时间的对比（n＝10）

Table 1 Comparison of swimming time until exhaustion and hypoxia resistance time of mice (n = 10)

注：*.与对照组相比，差异显著（P＜0.05）。下同。

如表1所示，与对照组相比，HPP低、高两个剂量组小鼠力竭时间显著延长（P＜0.05），延长率分别为23.95%和25.06%。然而HPP低、高剂量组小鼠耐缺氧时间与对照组相比较没有显著性差异，延长率较低（0.78%与2.22%）。结果表明，败酱草多糖对小鼠抗疲劳的作用明显，而对小鼠耐缺氧作用不显著。

2.3 各组小鼠疲劳相关指标的测定结果

表 2 各组小鼠疲劳相关指标的比较（n＝10）

Table 2 Comparison of fatigue-related biochemical parameters of mice (n = 10)

如表2所示，与对照组相比较，HPP低、高两个剂量组小鼠的力竭后CK活性与BLA浓度显著降低，而HPP高剂量组小鼠的肝糖原含量显著升高，但BUN浓度与肌糖原含量变化不明显。上述结果说明，败酱草多糖能够增加小鼠肝糖原储备，减少运动时的乳酸生成，改善力竭运动造成的小鼠肌组织损伤程度。

3 结论与讨论

本实验采用水提醇沉法对败酱草多糖进行提取，多糖得率为2.54%，含量为58.85%，D-GalUA含量为35.20%。在提取过程中已经对游离蛋白质进行脱除，但紫外光谱结果显示败酱草多糖含有结合蛋白，经双缩脲法测定蛋白质含量为13.26%，因此HPP是一种蛋白多糖。HPLC色谱图结果显示，HPP的单糖组成主要是：D-Man、L-Rha、D-GalUA、D-Glc、D-Gal和L-Ara（物质的量比依次为0.53∶0.35∶3.18∶1∶2.72∶1.27）。

游泳力竭模型是常用的一种小鼠运动疲劳模型[15-16]。本实验通过5 周的小鼠游泳模型来评价败酱草多糖的抗疲劳作用，测定指标选择与糖原储备、糖代谢相关的指标。肝糖原与肌糖原是耐力运动的主要能量来源，虽然本实验检测到力竭前各组小鼠肌糖原含量无显著差异，但HPP高剂量组小鼠的肝糖原储备明显高于对照组，说明HPP能够提高机体糖原储备，这是其延缓力竭游泳时间的主要原因之一。BLA是反映机体糖无氧代谢的一个重要指标[17]。本实验说明，败酱草多糖能够提高机体糖的有氧代谢能力，降低糖的无氧代谢参与程度，这是败酱草多糖延缓小鼠运动疲劳的另一个原因。目前不少研究证实，植物多糖可以通过改善机体糖代谢系统来达到抗疲劳的作用[18-20]。BUN反映蛋白质参与代谢的程度，也是检测运动性疲劳的另一个理想指标[21]，机体对运动负荷适应能力越差，不仅糖的无氧代谢参与程度增加，而且蛋白质的分解代谢的程度也会有不同程度的增加，但本实验结果表明，败酱草多糖对于蛋白质的分解代谢影响不明显。血清CK活性的变化是评定骨骼肌微细损伤的一个重要生理指标[22]。过度运动会使机体脂质过氧化程度加大，对肌组织造成一定的损伤[23-24]。本实验结果表明，败酱草多糖可以降低游泳小鼠血清CK活性，这可能与败酱草多糖的抗氧化性有关[8]。关于多糖对于小鼠耐缺氧能力的影响，已有研究证明其效果显著[14,25-27]，但本实验结果表明，败酱草多糖此作用并不明显。耐缺氧能力由机体氧运输系统和氧利用系统等多种因素决定[17]，如血红蛋白含量、红细胞比容以及线粒体呼吸链各种酶的活性等，败酱草多糖可能对于上述各项指标效果不明显而影响其耐缺氧效果。

综上所述，败酱草多糖可通过提高小鼠的肝糖原储备与增强糖的有氧代谢而使小鼠游泳时间延长，达到抗运动疲劳的效果，但对小鼠耐缺氧能力的作用效果不明显。

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