蓝莓多糖对衰老小鼠运动耐力及抗疲劳效果研究

郑 飞

（河南省淮阳县卫生监督所，河南 洛阳 466700）

摘 要：研究蓝莓多糖（blueberry polysaccharides，BPs）对D-半乳糖诱导衰老模型小鼠的游泳耐力和相关生理指标的影响。将小鼠分为正常对照组、衰老模型对照组、BPs低、中、高剂量组，通过腹腔注射100 mg/（kg•d）（以体质量计）D-半乳糖建立衰老模型，考察其对力竭游泳时间以及疲劳评价指标的影响。与模型对照组相比，BPs中、高剂量组能显著延长小鼠力竭游泳时间（P＜0.05），BPs各剂量组对延长缺氧生存时间具有较好的效果；BPs低、中、高剂量组血乳酸含量分别较模型对照组降低了10.9%、21.2%、31.1%（P＜0.05）。此外，BPs中、高剂量组小鼠剧烈运动后血尿素氮、血乳酸和丙二醛含量显著降低，BPs各剂量组小鼠的肝糖原、肌糖原含量和超氧化物歧化酶、乳酸脱氢酶活性均显著升高，结果表明BPs具有极强的自由基清除能力及较好的抗疲劳作用。

关键词：蓝莓多糖；D-半乳糖；抗疲劳；力竭游泳时间

Anti-fatigue Effect of Polysaccharides Extracted from Blueberry in Mice

ZHENG Fei

(Institute of Huaiyang County Health Supervision in Henan Province, Luoyang 466700, China)

Abstract: The effect of polysaccharides extracted from blueberry (BPs) on exhaustive swimming time and related physiological indexes in aged mice induced by D-galactose was investigated. Mice were randomly divided into normal control group, aged model group, low-dose BP group, middle-dose BP group, and high-dose BP group. The aged model was induced by D-galactose at a dose of 100 mg/(kg•d) for 60 consecutive days. After the administration of BPs for 20 consecutive days, the exhaustive swimming time and fatigue indexes were determined. The results showed that BPs could extend the exhaustive swimming time, decrease the contents of BUN, BLA and MDA, and obviously increase the reservation of HG, MG, SOD and LDH. To conclude, BPs have a good anti-fatigue effect. This study may provide theoretical evidence for the development of anti-fatigue drugs from BPs.

Key words: blueberry polysaccharides; D-galactose; anti-fatigue effect; exhaustive swimming time

中图分类号：TS201.2 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）21-0249-04

doi:10.7506/spkx1002-6630-201421049

蓝莓（blueberry），杜鹃花科越橘属，果实中含有丰富的维生素、膳食纤维、蛋白质和矿物质等营养元素，其中蓝莓中多糖及花青素含量较高。有研究表明[1-2]，蓝莓果肉不仅具有良好的营养保健作用，还具有防止脑神经老化、强心、抗癌、软化血管、增强人机体免疫等功能。由于蓝莓具有较高的保健价值，因此被世界粮农组织推荐为五大健康水果之一。

有研究表明，多糖作为大分子物质广泛存在于自然界中的各种生物体内，且大多数具有抗病毒、抗肿瘤、抗炎症、抗氧化以及降血糖等功能，已成为当前医药和食品领域研究与开发的热点[3-5]。孟宪军等[6]研究发现，蓝莓多糖（blueberry polysaccharides，BPs）对羟自由基和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基有较强的清除作用，蓝莓多糖对枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、啤酒酵母均有一定的抑制作用。Kalea等[7]研究发现蓝莓多糖会降低低密度脂蛋白及脂质体的氧化，并且影响体内细胞信号转导的路径，是血管内壁黏多糖下降的主要诱因。目前，国内外对蓝莓多糖的研究主要集中在成分鉴定以及抗氧化功能等方面[8-10]，且研究结果均显示蓝莓多糖在清除自由基、抗氧化、抑菌效果等方面具有较强的生物活性，然而目前国内外鲜见关于其对血糖和运动耐力影响的研究报道。因此，本实验考察蓝莓多糖对小鼠血糖水平及抗疲劳能力的影响，以丰富蓝莓多糖在提高机体抗疲劳能力方面的证据，为蓝莓多糖的在功能食品中的应用及产品开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜蓝莓，无冻害，购于水果超市。

昆明种小鼠50 只，SPF级，雌雄各半，体质量20～22 g。

D-半乳糖 美国Sigma-Aldrich公司；血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）试剂盒、血乳酸（blood lactic acid，BLA）试剂盒、肝糖原（hepatic glycogen，HG）试剂盒、肌糖原（muscle glycogen，MG）试剂盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）试剂盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）试剂盒、血乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）试剂盒 南京建成生物工程研究所；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

DHG-9240A电热恒温鼓风干燥箱、DK-8D三孔电热恒温水槽 上海齐欣科学仪器有限公司；超声波清洗机 宁波新芝生物科技有限责任公司；冷冻离心机 美国贝克曼公司；UV-2450紫外-可见分光光度计 日本岛津公司。

1.3 方法

1.3.1 蓝莓多糖的制备

根据孟宪军等[11]的方法并作改进：称取蓝莓果肉120 g，将原料果肉清洗后在－80 ℃速冻10 min后打浆，加入少量蒸馏水后用微波消解仪辅助提取。抽滤后将滤液5 000 r/min离心15 min。加少量水溶解果肉后重复提取2 次，将提取的上清液合并混匀，旋转蒸发使溶液水分完全蒸发。加入95%乙醇、100%乙醇和丙酮分别处理，4 ℃放置24 h，3 000 r/min离心10 min，用Sevag法[12]除蛋白质，将沉淀冷冻干燥后即得到蓝莓粗多糖。

1.3.2 实验动物条件和分组

实验小鼠饲养条件：温度18～22 ℃、相对湿度50%～55%，自然光照，自由采食和饮水。实验前将50 只小鼠在实验环境下给予基础饲料饲养1 周，按体质量随机分成5 组（雌雄各半），分别是正常对照组，模型对照组，BPs低、中、高剂量组。正常对照组腹腔注射100 mg/（kg•d）（以体质量计，下同）生理盐水，其余4 组腹腔注射100 mg/（kg•d）D-半乳糖，周期为60 d。第41天，正常对照组灌胃蒸馏水，模型对照组腹腔注射D-半乳糖的同时灌胃蒸馏水，BPs低、中、高剂量组腹腔注射D-半乳糖的同时灌胃100、200、
400 mg/（kg•d）剂量的BPs，连续给药20 d。各组给予基础饲料，自由饮水。

1.3.3 力竭游泳实验

末次给药30 min后，给予小鼠尾部负重体质量5%的铅丝，将各组小鼠分别放入10 个恒温水池箱，水深（20±5）cm、水温（25±1）℃，进行力竭游泳实验。放入后立即计时，观察小鼠游泳情况，并适时用玻璃棒拨动小鼠使其始终处于运动状态。以开始至小鼠沉于水面下10 s后不能浮出水面的时间作为力竭游泳时间/min。

1.3.4 常压耐缺氧实验

参考高辉等[13]的方法，分组及给药方法同1.3.2节，末次给药1.5 h后，将小鼠分组放入干燥瓶中，用凡士林封口保持瓶内密闭，记录小鼠死亡时间。

1.3.5 测试样品的制备和检测

力竭游泳实验后，将小鼠断头取血致死，收集血液，4 000 r/min离心10 min，取上清液备用。所有处理均在4 ℃条件下完成。按BUN、BLA、HG、MG、MDA、SOD及LDH试剂盒说明结合紫外-可见分光光度计分别测定各指标。

1.4 数据分析

采用SPSS 15数据处理软件，各组数据结果均以

±s表示。进行方差分析，LSD法多重比较，P＜0.05为差异具有显著性。

2 结果与分析

2.1 BPs对衰老小鼠力竭游泳时间及耐缺氧的影响

小写字母不同表示组间差异显著（P＜0.05）。下同。

图 1 BPs对小鼠力竭游泳时间的影响

Fig.1 Effect of BPs on exhaustive swimming time of aged mice

机体持续运动至力竭的时间及缺氧状态下的生存时间可以反映机体的耐力，是评价疲劳状态较为客观的指标。目前构建衰老动物模型的方法主要有注射D-半乳糖、臭氧损伤、去胸腺、采用老龄动物等。D-半乳糖因造模简单、实验周期相对较短，目前被广泛用于衰老机理研究和抗疲劳药物的药效学评价[14-15]。如图1所示，正常对照组和不同BPs剂量组小鼠力竭游泳时间均高于模型对照组，其中BPs低剂量组与模型对照组相比差异不显著（P＞0.05），其余各组均显著高于模型对照组
（P＜0.05）。实验结果表明小鼠力竭游泳时间与BPs剂量呈正相关，BPs高剂量组小鼠力竭游泳时间显著高于BPs低、中剂量组（P＜0.05）。值得关注的是，BPs高剂量组更能延长小鼠力竭游泳时间，甚至超过正常对照组14.3%。结果说明蓝莓多糖可显著提高衰老小鼠的运动能力，延缓疲劳的发生。

图 2 BPs对衰老小鼠缺氧生存时间的影响

Fig.2 Effect of BPs on anti-hypoxia survival time of aged mice

尽管缺氧对机体是一种负面作用，可导致心脑等重要器官缺氧性损伤，引起氧供应能力不足而死亡，但缺氧耐受性却是反映机体的代谢及应激性反应的一个重要参考指标。如图2所示，模型对照组缺氧生存时间著显低于其他各组（P＜0.05），随着BPs含量的增加，BPs各剂量组对延长缺氧生存时间具有较好的效果，表明BPs能增强小鼠耐缺氧能力。孙立彦等[16]关于玉竹多糖对小鼠耐缺氧能力的研究证明玉竹多糖也能明显延长缺氧小鼠的存活时间，提高缺氧小鼠存活率。

2.2 BPs对衰老小鼠相关生理指标的影响

能源物质的消耗、代谢物质的堆积是产生疲劳的重要原因[21]。常用的疲劳评价方法主要有两个：运动耐力实验和生化指标检测。当肌肉活动和收缩时，体内糖原含量减少，分解为乳酸并放出热能供肌肉活动，当体内糖原含量不足或供不应求时，就会产生明显的疲劳现象。在反映疲劳的生化指标中，BUN、BLA和糖原等生化指标的改变最具代表性，也是检测疲劳最常用的指标[17]。当糖原被大量消耗时，生物体活动能力降低，从而导致机体反应迟钝，产生疲劳感。因此贮备糖原有利于减少蛋白质和含氮化合物的分解代谢，提高机体耐力。

机体剧烈运动时，由于氧供应相对不足，乳酸等酸性代谢产物增多，从而引起肌肉收缩效率下降，因此，BLA是反映机体运动耐力好坏的主要指标。由表1可知，不同BPs剂量组小鼠BUN和BLA含量均低于模型对照组
（P＜0.05），其中BPs高剂量组BUN含量显著低于模型对照组（P＜0.05），与正常对照组接近，并且BUN含量与BPs剂量呈负相关关系。Younes等[18]研究了发酵纤维素产生多糖后对小鼠BUN的抑制作用，结果也发现13.0%的多糖可降低小鼠BUN含量达37%，本实验的结果也印证了该结论。BLA含量也呈现相似的变化规律，BPs低、中、高剂量组的BLA含量分别较模型对照组降低了10.9%、21.2%、31.1%，差异显著（P＜0.05），BPs高剂量组的BLA含量甚至低于正常对照组10.4%（P＞0.05）。

表 1 BPs对衰老小鼠的疲劳生理指标影响

Table 1 Effect of BPs on related physiological indexes of aged mice

注：同列小写字母不同表示差异显著（P＜0.05）。下同。

由表1可知，不同BPs剂量组的HG含量高于正常对照组。与正常对照组相比，3 个剂量组的HG含量均显著增加（P＜0.05）。有证据表明[19]，高强度运动2 h后，MG几乎耗尽，由于MG逐渐减少，则HG水解增多以维持血糖的稳定；如果HG耗竭，血糖含量将明显下降，则运动不能持续。因此HG的储量直接影响持续耐力运动的能力，是反映疲劳程度的敏感指标。从结果来看，BPs各剂量组能够有效增强小鼠持续运动的能力。

表 2 BPs对衰老小鼠MDA含量和SOD、LDH活性的影响

Table 2 Effect of BPs on MDA, SOD and LDH of aged mice

实验考察了BPs对衰老小鼠的脂质过氧化水平和血清抗氧化状态的影响，由表2可知，随BPs剂量的增加，血清中MDA含量均有所降低，并且BPs中、高剂量组的MDA含量与正常对照组相比无显著差异（P＞0.05）。与模型对照组相比，BPs低、中、高剂量组的血清SOD活性分别提高24.5%、35.4%和45.6%（P＜0.05），这表明BPs对血清SOD的调节效果非常明显。此外，血清LDH活性也随BPs剂量的增加显著升高，但BPs中、高剂量组相比，血清LDH差异不显著，也反映出BPs剂量对LDH活性的影响有限。以上结果表明BPs具有良好的体内抗氧化活性，不仅显著提高了体内酶系统的抗氧化活力，而且能够有效清除体内自由基并防止细胞膜脂质过氧化，这也许是BPs具有抗疲劳作用的关键机理之一。

3 讨 论

疲劳是一种常见的生理现象，为过度劳动或运动引起机体生理生化功能改变而导致机体劳动或运动能力的暂时降低，机体生理过程不能持续其机能在特定水平或不能维持预定的运动强度，是防止机体发生机能衰竭而产生的一种保护性反应[20]。疲劳可以导致精神不振、四肢乏力、注意力不集中、活动迟缓、抵抗力下降等一系列后果，严重时可摧毁人体免疫系统及神经系统，故针对延缓或消除疲劳的研究具有十分重要的意义[21-22]。

通过研究BPs对小鼠力竭游泳时间及疲劳评价指标， 结果表明BPs能够不同程度地降低BLA、BUN含量，升高HG、MG含量，这个变化可能是其发挥抗疲劳作用的重要物质基础。基于此，BPs高剂量组的运动耐力时间比正常对照组延长了14.3%（P＜0.05），BPs高剂量组还有效增加了小鼠SOD、LDH活性，显著降低小鼠剧烈运动后BUN、BLA和MDA含量，表明高剂量BPs具有极强的自由基清除能力，通过其抗氧化作用延长小鼠负重游泳及缺氧状态下生存时间，这可能是产生抗疲劳作用的重要途径之一。

大量研究发现[23-24]，短时间高强度运动引起的肌肉疲劳是由于肌肉中的能量贮存物质ATP供应不足所致，当ATP下降到某种水平时，MG会进行糖酵解合成ATP，在此过程中会伴随着乳酸的积累，导致机体内氢离子浓度上升、肌肉pH值下降，最终导致肌肉收缩能力下降。当肌肉和血液中逐渐产生和积累这种酸性致疲劳性物质（乳酸）时，会使人的体力衰竭，无法继续进行有效活动，因此，糖原既是检测抗疲劳作用的重要指标同时也是提高运动耐力的能源物质之一。本实验证实BPs高、中、低3 个剂量组的HG含量均显著高于正常对照组
（P＜0.05），说明BPs可以增加糖原的储备，为肌体提供能源物资，具有缓解动物体力疲劳、增强运动耐力的作用。

参考文献：

[1] KALEA A Z, CLARK K, SCHUSCHKE D A, et al. Dietary enrichment with wild blueberries (Vaccinium angustifolium) affects the vascular reactivity in the aorta of young spontaneously hypertensive rats[J]. The Journal of Nutritional Biochemistry, 2010, 21(1): 14-22.

[2] VENDRAME S, DAUGHERTY A, KRISTO A S, et al. Wild blueberry (Vaccinium angustifolium) consumption improves inflammatory status in the obese Zucker rat model of the metabolic syndrome[J]. The Journal of Nutritional Biochemistry, 2013, 24(8): 1508-1512.

[3] 聂少平, 谢明勇, 曹树稳. 纯化茶多糖的抗氧化活性及其对两种结肠癌细胞增殖抑制作用[J]. 营养学报, 2007, 29(1): 46-49.

[4] WANG Dongying, ZHAO Yan, SUN Yanfei, et al. Protective effects of Ziyang tea polysaccharides on CCl4-induced oxidative liver damage in mice[J]. Food Chemistry, 2014, 143(15): 371-378.

[5] 王强, 赵欣. 葡萄籽粗多糖的超声波辅助提取工艺优化、组成及抗氧化活性研究[J]. 食品科学, 2013, 34(10): 62-66.

[6] 孟宪军, 刘晓晶, 孙希云, 等. 蓝莓多糖的抗氧化性与抑菌作用[J]. 食品科学, 2010, 31(17): 110-114.

[7] KALEA A Z, LAMARI F N, THEOCHARIS A D, et al. Wild blueberry (Vaccinium angustifolium) consumption affects the composition and structure of glycosaminoglycans in Sprague-Dawley rat aorta[J]. The Journal of Nutritional Biochemistry, 2006, 17(2): 109-116.

[8] REQUE P M, STEFFENS R S, JABLONSKI A, et al. Cold storage of blueberry (Vaccinium spp.) fruits and juice: anthocyanin stability and antioxidant activity[J]. Journal of Food Composition and Analysis, 2014, 33(1): 111-116.

[9] WANG S Y, CAMP M J, EHLENFELDT M K. Antioxidant capacity and α-glucosidase inhibitory activity in peel and flesh of blueberry (Vaccinium spp.) cultivars[J]. Food Chemistry, 2012, 132(4): 1759-1768.

[10] 郭弘璇, 吕兆林, 潘月, 等. 蓝莓果中多糖及单糖构成的研究[J]. 北京林业大学学报, 2013, 35(6): 144-147.

[11] 孟宪军, 常瑜, 孙希云, 等. 微波辅助法提取蓝莓多糖BBP0-2的分离纯化及组分分析[J]. 食品科学, 2013, 34(12): 119-124.

[12] SEVAG M G, LACKMAN D B, SMOLENS J. The isolation of components of streptococcal nucleoproteins in serologically active form[J]. Journal of Biological Chemistry, 1938, 124: 425.

[13] 高辉, 李春艳. 二氢杨梅素对小鼠运动性疲劳的影响[J]. 食品科学, 2012, 33(21): 295-297.

[14] HYNDMANA C A, KIEFFERA J D, BENFEY T J. The physiological response of diploid and triploid brook trout to exhaustive exercise[J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology, 2003, 134(1): 167-179.

[15] PARK J H, CHOI T S. Polycystic ovary syndrome (PCOS)-like phenotypes in the D-galactose-induced aging mouse model[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2012, 427(4): 701-704.

[16] 孙立彦, 刘振亮, 孙金霞, 等. 玉竹多糖对小鼠常压耐缺氧作用的影响[J]. 山东农业大学学报: 自然科学版, 2008, 39(3): 335-338.

[17] 李莉, 赵效国, 马龙, 等. 黑加仑提取物抗疲劳作用的动物实验研究[J]. 营养学报, 2008, 30(5): 499-501.

[18] YOUNES H, DEMIGNÉ C, BEHR S R, et al. A blend of dietary fibers increases urea disposal in the large intestine and lowers urinary nitrogen excretion in rats fed a low protein diet[J]. The Journal of Nutritional Biochemistry, 1996, 7(9): 474-480.

[19] TAN Wei, YU Keqiang, LIU Yanyan, et al. Anti-fatigue activity of polysaccharides extract from Radix Rehmanniae Preparata[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2012, 50(1): 59-62.

[20] 宋伟峰, 苏俊芳, 罗淑媛. 荔枝多糖抗疲劳作用的实验研究[J]. 中药材, 2012, 35(9): 1485-1487.

[21] NI Weihua, GAO Tingting, WANG Hailiang, et al. Anti-fatigue activity of polysaccharides from the fruits of four Tibetan plateau indigenous medicinal plants[J]. Journal of Ethnopharmacology, 2013, 150(2): 529-535.

[22] WANG Jia, LI Shanshan, FAN Yuying, et al. Anti-fatigue activity of the water-soluble polysaccharides isolated from Panax ginseng C. A. Meyer[J]. Journal of Ethnopharmacology, 2010, 130(2): 421-423.

[23] RAY A D, UDHOJI S, MASHTARE T L. A combined inspiratory and expiratory muscle training program improves respiratory muscle strength and fatigue in multiple sclerosis[J]. Archives of Physical Medicine and Rehabilitation, 2013, 94(10): 1964-1970.

[24] DUQUETTE A M, ANDREWS D M. Tibialis anterior muscle fatigue leads to changes in tibial axial acceleration after impact when ankle dorsiflexion angles are visually controlled[J]. Human Movement Science, 2010, 29(4): 567-577.