活性氧影响拮抗菌及果蔬采后抗病性的研究进展

李超兰，杨其亚，张红印*，张晓云

（江苏大学食品与生物工程学院，江苏 镇江 212013）

摘 要：活性氧引起的氧化胁迫作用作为生防系统中常见的影响因素引起了广泛的关注。活性氧作为生物体内的必须物质，是维持生命活动必不可少的内源性成分；但当其过量时，会损害大分子蛋白、核酸等有害物质，又必须被有效地清除。因此如何利用活性氧在生物防治系统中的重要作用是提高生防效果的方法之一。本文通过介绍活性氧的产生以及清除，系统地阐述了活性氧-氧化胁迫，氧化胁迫-拮抗菌以及氧化胁迫-果蔬之间的相互作用，并论述活性氧对拮抗菌生防能力以及果蔬抗病性带来的积极、消极作用，进一步探讨相关作用对于生防效果的影响。

关键词：氧化胁迫；活性氧；拮抗菌；果蔬；病害；生物防治

Progress in Understanding the Effect of Reactive Oxygen Species on Antagonist and Postharvest Disease Resistance of Fruits and Vegetables

LI Chao-lan, YANG Qi-ya, ZHANG Hong-yin*, ZHANG Xiao-yun

(College of Food Science and Biological Engineering, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, China)

Abstract: Oxidative stress induced by ROS (reactive oxygen species) as a key factor in bio-control system has gained tremendous attention. ROS, on the one hand, it is necessary for sustaining life activity; on the other hand, it is harmful to cellular protein and DNA so that it should be scavenged. How to utilize ROS effectively during the process of bio-control to enhance controlling efficiency is highly desired. This paper summarizes the mechanisms of ROS generation and scavenging, expounds the interactions of oxidative stress with ROS, antagonist and host vegetables and fruits, and discusses the positive and negative impact of ROS on postharvest disease resistance in vegetables and fruits as well as the influence of relevant actions on the bio-control efficiency.

Key words: oxidative stress; ROS; antagonist; fruits and vegetables; postharvest disease; bio-control

中图分类号：TS201.3 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）21-0264-06

doi:10.7506/spkx1002-6630-201421052

果蔬采后病害造成的损失是巨大的。导致果蔬采后损失的因素很多，病原菌侵染引起的腐烂是造成果蔬采后损失的主要原因，病原真菌对采后水果的危害不仅在于其导致水果在数量上的严重损失，而且许多病原真菌尤其是霉菌能分泌产生许多次生代谢产物，从而引起严重的食品安全问题，如曲霉菌（Aspergillus flavus、Aspergillus parasiticus等）产生的黄曲霉毒素、扩展青霉（Penicillium expansum）产生的棒曲霉素（patulin）等。

随着国家经济发展和消费水平的提高，人们对食品安全和环境保护意识日益增强，研究并开发替代化学杀菌剂的安全、无毒、高效的新型水果采后病害防治方法，具有重大的社会意义和广阔的应用前景[1-2]。当前国际上越来越重视水果采后病害生物防治的研究，并认为这是最有希望取代化学杀菌剂的方法之一[3-4]。

纵观国内外市场，果蔬采后病害生防拮抗剂制品仍然很少，其主要原因是拮抗菌在实际运用时生防效力不高。环境是影响拮抗菌在生产及应用过程中生存和生防效力的重要因素，而氧化胁迫则是最常见的环境影响因素之一，在病原菌、拮抗菌、果蔬三者构成的生防系统中扮演着重要的角色。本文论述了活性氧对拮抗菌防治果蔬采后病害效果的影响。

1 氧化胁迫与活性氧

氧化胁迫，是机体氧化和抗氧化过程中发生的不平衡状态[5]。在生物体中，活性氧（reactive oxygen species，ROS）产生和清除系统的失衡引发ROS增加，过多的ROS将导致氧化胁迫。ROS是主要的促氧化剂，它主要包括超氧化物、过氧化氢（hydrogenperoxide，H2O2）和羟自由基（•OH）等，它们都具有高活性和毒性。过多的活性氧会引发氧化胁迫作用，从而对细胞产生损害[6]。H2O2作为重要的活性氧分子，是导致氧化胁迫的重要因素，可引起许多生物大分子的损害，如导致磷脂的过氧化而破坏生物膜系统；促进二硫键的形成，从而使含巯基的酶类失活等。H2O2还是抗氧化胁迫反应中重要的信号分子，引发抗氧化级联反应[7]。这些氧化胁迫作用会对细胞的生理机制和细胞膜的完整性造成损害，从而导致细胞死亡[8]。

2 活性氧的清除

为了避免氧化还原状态失衡，在生物体内会有一系列的生化反应机制，包括抗氧化酶作用以及非酶作用，从而将活性氧转化为对细胞无害的物质[9]。

2.1 酶防御系统

生物体在进化过程中形成了完善的ROS清除酶系统，是细胞适应恶劣环境下的最重要的方式。酶防御系统不仅可以直接清除进入细胞内的氧化剂，逆转损害的蛋白质和核酸，也可以将非酶防御体系维持在较高抗氧化水平[10]。如超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、过氧化氢酶（catalase，CAT）、过氧化物酶（peroxidase，POD）。通过这些抗氧化酶作用可以使活性氧的浓度处于一个相对平衡的状态[11-12]。SOD是一种含金属的、能够清除生物体内超氧阴离子自由基（O2－•）的酶，SOD催化两个O2－•发生歧化反应，生成H2O2和O2－•[13-14]。CAT是一种包含血红素的四聚体酶，它可将H2O2迅速分解为H2O和O2，从而降低过氧化氢对细胞的毒害作用[14]。POD的作用具有双重性，一方面，POD 可在逆境或衰老初期表达，清除H2O2，对细胞产生保护作用，为抗氧化系统的成员之一[12]；另一方面，POD也可在逆境或衰老后期表达，参与活性氧的生成，并引发膜脂质过氧化作用，产生不利影响； POD甚至可作为衰老指标[15-16]。除此之外，常见的抗氧化酶还包括谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GPX）、抗坏血酸过氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）、多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）等。它们均能有效地清除细胞内的多余活性氧，使之处于相对平衡的状态，从而对细胞产生保护作用。

2.2 非酶防御系统

除却抗氧化酶作用，非酶作用也是在氧化胁迫作用下一大重要的细胞保护作用。主要包括一些水溶或脂溶性小分子，如蛋白质、氨基酸衍生物、维生素、脂肪酸、糖类和起缓冲平衡调节作用的离子，它们可以从溶液中直接清除氧化产物[10]。其中常见的起保护作用的物质包括海藻糖，谷胱甘肽（glutathione，GSH）。海藻糖最初于1882年从黑麦的麦角菌中分离出来，后来研究发现它是一种广泛存在于植物、细菌、真菌和无脊椎动物体内的非还原性的双糖[17]。海藻糖往往是在环境胁迫条件下产生，含量可随外界环境条件的变化而变化，是一种应激代谢物。海藻糖具有保护生物细胞和生物活性物质在脱水、干旱、高温、冷冻、高渗透压及有毒试剂等不良环境条件下活性免遭破坏的功能。海藻糖对生物体组织和生物大分子具有非特异性保护作用，外源性的海藻糖同样对生物体和生物大分子有良好的非特异性保护作用。对于海藻糖的作用机制主要有以下3 种假说：“水替代”假说、“玻璃态”假说、“优先排阻”假说[17]。酵母细胞中最丰富最重要的抗氧化剂分子是氨基酸衍生物——GSH。谷胱甘肽是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成的三肽。它与超氧基团作用产生还原型谷胱甘肽来发挥抗氧化功能，保护线粒体免受氧化剂的损伤，同时也可以凭借GSH 偶合泵（Ycf1p），偶联进入液泡的镉、甲萘醌等毒性亲电子试剂，进行解毒[18]。而还原型GSH是含巯基的低分子肽，为机体内的重要活性物质，参与二硫化物、硫醚和硫酯的形成，并能清除生物体内的自由基从而解除毒性[7]。

因此诱导细胞抗氧化酶活性的提高和非酶作用的增加是减少氧化损伤的有效途径[7]。通过应用分子遗传学、细胞生物学、蛋白质组学和功能基因组学等技术手段，诱导抗氧化相应蛋白的表达，提高抗氧化能力；添加外源物质提高生物体内抗氧化酶活性或抗氧化物质含量。

3 拮抗菌与氧化胁迫之间的相互作用

3.1 拮抗菌内活性氧的产生及其危害

正常需氧条件下，酵母细胞中的代谢副产物会产生超氧负离子、羟基和过氧化氢等内源活性氧族物质（ROS）。外界环境中的电离辐射、氧化还原剂或重金属等也能刺激细胞产生这些活性氧形态。而要将生防菌产业化，自然会遇到一系列问题，其中包括不同环境条件对拮抗菌生存以及生防效果的影响。氧化胁迫就是最常见的环境问题，因此也在生物防治系统中起着重要作用[19-20]。在拮抗剂的运用过程中，无论是果蔬伤口组织还是表面都会积累大量活性氧即ROS，例如过氧化氢、超氧阴离子，从而影响宿主生理机制，病原菌毒力，酵母生存能力，生防效力等[20-21]。有研究报道随着氧化胁迫作用的加强，拮抗菌Rhodotorula glutinis的生存能力逐渐降低[19]；Patiño-Vera等[22]报道接抗菌Rhodotorula minuta在液态贮藏期间，氧化胁迫能影响其生存能力。

当酵母菌受到强烈的氧化胁迫作用，细胞中累积的活性物质超过了细胞氧化物质清除的平衡能力，就会损害到DNA、脂质和蛋白质等细胞组分，进而影响细胞的功能甚至造成细胞死亡[23]。

3.2 拮抗菌内活性氧的清除机制

在氧化胁迫作用下，酵母细胞已经形成一整套完整机制来保护细胞组分免受氧化胁迫的毒害作用。酵母细胞非酶防御系统主要包括一些水溶或脂溶性小分子，如氨基酸衍生物、蛋白质、脂肪酸、糖类、维生素以及起缓冲平衡调节作用的离子，它们可以从溶液中直接清除氧化产物[10]。酵母细胞中最重要的抗氧化剂分子是氨基酸衍生物——GSH和多胺（polyamine）[10]。除此之外，酵母细胞内一定含量的海藻糖能还原被氧化剂诱导后发生的蛋白质修饰，减少脂质过氧化水平[24]。而酵母细胞内的酶作用主要有过氧化物歧化酶系，硫氧还蛋白过氧化物酶/硫氧还蛋白还原酶系能还原过氧化氢和烷基过氧化氢，谷胱甘肽还原酶/谷胱甘肽氧化物酶系还原氧化的谷胱甘肽，维持细胞内的还原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽的平衡[10]。

酵母细胞在组织形成最前线抗氧化防御屏障的同时，会将压力信号逐级传递到细胞核内，使细胞在更高的层级上对氧化胁迫做出更为精细的调控[10]。基因水平上的调控则是细胞尽快适应氧化胁迫环境最重要的策略方式。

在氧化胁迫条件下，细胞将激活应激活化蛋白激酶（stress-activated protein kinase，SAPK）级联反应途径，氧化胁迫相关基因表达上调。而细胞正是利用相关基因表达水平的改变来调控其抗氧化性能[25]。

注：Skn7代表感应调节蛋白；TEX2、TRR1、GLR1、GSH1、SOD1、SOD2均代表氧化胁迫相关基因；Sln1（Ypd1-Skn7）代表磷酸集团传递途径；Ace1代表铜离子结合蛋白；Hap1代表锌指型转录激活因子；Xbp1代表转录抑制因子；Yap1代表类AP（activation protein）转录因子。

图 1 酵母细胞抗氧化胁迫应答示意图[10]

Fig.1 Response of yeast cells to oxidative stress[10]

如图1所示，细胞主要是通过以下几个途径对相关基因表达进行调控。

一方面，SAPK途径上游的卟啉型蛋白磷酸酶可以磷酸化激酶结构域中的组氨酸残基，而磷酸化基团随后转到效应调节蛋白结构域中的天冬氨酸残基上，该效应调节蛋白含有DNA结合结构域从而发挥转录因子的作用[10]。在氧化应激应答中，磷酸基团通过 Sln1-Ypd1-Skn7进行转移，感应调节蛋白Skn7在过氧化氢和二酰胺抗性中发挥调控作用。除此之外，Skn7p还调控着许多抗氧化应激反应基因的表达，如TRR1。另一方面，酵母中的类AP（activation protein）转录因子Yap1p和其他类型的转录因子可以直接或间接地调控着相关基因的表达。Yap1p能通过形成二硫键来改变蛋白质构象，对其活性和持续性起着重要作用[27]。研究表明Yap1p也和Skn7p一起协同调控细胞抗氧化胁迫中一系列的重要靶基因[28]。

与此同时，铜离子结合蛋白Ace1p和Mac1p的氧化还原活性，在细胞传感氧化剂信号中起着重要作用[29]。锌指型转录激活因子Hap1p涉及到SOD2基因的转录调控[30]。转录抑制因子Xbp1p的表达受到包括氧化胁迫在内的许多环境因素的调控，它可能通过基因表达抑制来调节保守蛋白质还原水平[31]。

3.3 活性氧刺激与拮抗菌细胞内信号反馈

活性氧作为信号分子具体传递途径包括以下三方面。

3.3.1 作为信号分子调节蛋白质的磷酸化与脱磷酸化

无论是外源活性氧或细胞内产生的活性氧常会引起细胞内某些蛋白激酶或磷酸酶活性的变化，激发信号传递，从而发生一系列磷酸化、脱磷酸化反应。如表皮生长因子与其受体结合诱导生成的H2O2激活蛋白酪氨酸激酶，而在同一刺激下诱导生成的O2－•抑制蛋白酪氨酸磷酸酶的活性[32]。

3.3.2 调节Ca2+信号

细胞内游离Ca2+浓度的变化与细胞的多种生物学效应密切相关。报道表明，细胞内质网上与钙离子通道相关的三磷酸肌醇（inositol 1,4,5-triphosphate，IP3）受体和Ryanodine受体及Ca2+-Na+交换体都受氧化还原的调控[33]。

3.3.3 活性氧作为信号分子介导转录因子的激活

通过信号级联放大作用，由转录因子的蛋白质传递到细胞核诱导特异基因表达，使得细胞外信号向细胞内传递。而活性氧可以调控转录因子的激活。资料表明，转录因子NF-κB未激活时是由3个亚基组成的三聚体，其中一个IκB亚基起抑制活性作用。将转录因子进行活化时，需讲解IκB，而后NF-κB则由两个亚基P50/P65组成。活性氧，H2O2和O2－•，能激活NF-κB，活化的NF-κB可与DNA结合诱导特异基因的表达[34-35]。

3.4 拮抗菌和氧化胁迫

在过去的生防菌机制研究中，营养与空间的竞争被认为是最主要的竞争机制之一。 拮抗菌在果蔬伤口处的生长增殖能力对采后生物防治来说具有重要意义[36-37]。在实际运用过程中，果蔬伤口处微生物的增长必须适应氧化胁迫的条件。如何提高拮抗菌氧化胁迫耐受性、从而能在伤口处迅速增殖是生物防治的关键问题[19]。Liu Jia等[38]曾报道甘氨酸甜菜碱能提高拮抗菌Cystofilobasidium infirmominiatum氧化胁迫耐受性，并进一步提高其生防效果。与此同时，外源钙离子的添加能诱导抗氧化酶活性的提高，ROS积累量的减少，其氧化伤害降低，存活率增加，从而能提高其生防效果[39]。因此，提高拮抗菌氧化胁迫耐受性是维持或增强其拮抗效力的有效方法。

4 果蔬与氧化胁迫之间的相互作用

4.1 果蔬组织内活性氧的产生及其作用

采后病原真菌主要通过组织伤口入侵果蔬组织。病原菌的入侵导致植物伤口处磷脂酶活性增加，并产生大量的活性氧，包括自由基、活性氧、超氧阴离子、过氧化氢[40-42]。过量活性氧以及自由基会引起氧化胁迫，从而对生物体产生不利影响，会对植物细胞造成一定的伤害，如DNA损伤，蛋白的变性及脂类的过氧化等，引发宿主细胞的凋亡[43]。Castoria等[19]报道当苹果受到损伤，在伤口处会立即产生大量的活性氧，并在此后的4 h内活性氧会持续产生。而存放时间较长的苹果产生过氧化氢和超氧阴离子的速率要快于新鲜苹果。研究显示在梨的成熟过程中，自由巯基含量降低，过氧化氢和脂质过氧化物含量则增加[19]。

虽然高浓度的ROS对植物组织细胞会有不利的作用，破坏部分蛋白质结构，干扰细胞正常的信号传递过程，并产生毒性。但研究表明ROS可在低浓度时作为信号传导的小分子。ROS在植物与病原菌的相互作用中尤其是早期阶段能最为重要的第二信使。研究表明，H2O2在抗病信号传导中处于水杨酸（salicylic acid，SA）的下游，并能诱导病程相关蛋白的表达[44]。因此，H2O2可以作为局部和系统的信号分子诱导植物的抗病性。ROS的生成，能使植物获得对多种胁迫的高抗性。因此，ROS在植物抗逆信号传导中有着重要的作用。另一方面，在超敏反应（hypersensitive response，HR）过程中，病原菌侵入点附近的组织细胞会产生大量的氧化性物质，导致病原菌细胞的程序性死亡，从而抑制了病原菌的侵染[19]。

4.2 果蔬组织内活性氧的清除机制

果蔬组织内的抗氧化防御系统是由一些清除活性氧的酶系和抗氧化物质组成，包括SOD、POD、CAT和抗坏血酸等[45-46]。在整个植物的抗氧化酶促系统中，SOD 组成了植物体内抗氧化胁迫的第一道防线。POD的主要作用是将植物体过多的H2O2还原为H2O和O2，降低活性氧对植物的危害。CAT的主要作用也是清除氧代谢中产生的H2O2以及由此产生的有机过氧化物[47-48]。

4.3 果蔬和氧化胁迫

当外源微生物侵染果蔬宿主，在强烈的氧化爆发（oxidative burst，OB）发生之前会产生活性氧[49]。因此，阶段性氧化爆发，氧化性分子物质的增加是果蔬-微生物相互作用中宿主具有抵抗力的关键因素[50]。与此同时，强烈的氧化爆发与病原菌直接或间接抑制宿主细胞内氧化物质的积累有重要作用[51-52]。

研究表明通过添加外源活性氧浓度调节器或过氧化氢可以增强宿主对病原菌的抗性[53]。而包括酶作用以及非酶作用在内的活性氧清除机制的大量启动，会降低宿主自身抗病性[54]，该作用在苹果[21]、芒果[55]、柑橘[52]、草莓[53]和梨[56]的采后病害相关研究中已被证实。与此同时，微生物也能通过诱导宿主组织内活性氧的积累来提高其抗病性。拮抗真菌Trichoderma virens能通过一分子质量12.5 kD的多肽引发大米和棉花组织内产生一系列蛋白效应，诱导宿主产生过氧化氢并使其相关防御基因产生表达[57]。因为在植物抗病系统中，木质素的生物合成[58]，热激转录因子的诱导[59-60]，PR基因的积累[61]，以及抗菌物质的产生都对其抗病性产生极大的影响[62]，而在这些反应过程中，过氧化氢均担任着重要的角色。Droby等[3]曾提出拮抗酵母通过诱导水果组织产生ROS从而来提高其抗病性也是生物防治一大机制。

因此我们可以推测，果蔬组织内适量ROS的产生能诱导其抗病性的提高，并在采后病害控制中发挥重要作用，但其具体机制仍需进一步的研究。

5 控制采后病害的过程中，活性氧/氧化胁迫的作用

研究表明通过提高果蔬自身抗病性以及拮抗菌拮抗效力等方法能够降低果蔬病害发生率。当活性氧浓度较高时，产生强烈的氧化胁迫作用，造成果蔬组织和拮抗菌细胞内氧化还原状态失衡，对其产生毒害作用，如蛋白质，核酸变性[23,44]，以致拮抗菌生存能力下降，营养空间竞争能力下降，拮抗能力降低，从而导致高的果蔬采后病害发生率。当活性氧浓度较低时，适宜浓度的活性氧会作为第二信使诱导宿主抗病性的提高，抑制病原菌的侵染，从而降低果蔬采后病害发生率[44]。因此提高拮抗酵母对氧化胁迫的耐受性以及运用低浓度活性氧提高果蔬抗病性有望成为降低其采后病害发生率的有效方法[63-64]。

6 结 语

当宿主果蔬受到外界胁迫或者非胁迫作用，包括病原菌的入侵时，会产生大量的活性氧，从而对宿主和拮抗菌产生氧化胁迫作用。过多的活性氧会影响拮抗菌的生存能力，而低剂量的活性氧能提高果蔬抗病性。因此，氧化胁迫在生防系统中扮演着重要的角色。迄今为止，研究多存在于拮抗菌-氧化胁迫，果蔬-氧化胁迫两方面，如何处理三者之间的关系，从而获得更好的生防效果仍需进一步研究。

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