草鱼内脏蛋白酶解产物美拉德反应制备调味基料

丛艳君，苘钰婷，易 红

（北京工商大学食品学院，北京市食品风味化学重点实验室，食品添加剂与配料北京高校工程研究中心，北京 100048）

摘 要：将草鱼内脏蛋白酶解液与葡萄糖进行美拉德反应后制备出了风味良好的调味基料，最佳反应基本条件为羰氨物质的量比1∶2、反应温度110 ℃、反应时间30 min、反应pH 8。感官评价表明肉香味和鱼香味较强烈。利用气相色谱-嗅闻-质谱联用仪对美拉德反应前后香气化合物成分进行分析，发现经过美拉德反应之后，香气活性化合物明显增多，检测到19 种香气活性化合物，其中包括酮类3 种、醛类3 种、酯类1 种、呋喃类4 种、吡嗪类1 种、噻唑类1 种、萜类2 种、烯类2 种、醚类1 种、酸类1 种。

关键词：草鱼内脏；美拉德反应；风味

Preparation of Flavoring Base from Enzymatic Hydrolysate of Visceral Waste Proteins of
Grass Carp through Maillard Reaction

Cong Yan-jun, Qing Yu-ting, Yi Hong

(Beijing Key Laboratory of Food Flavor Chemistry, Beijing Higher Institution Engineering Research Center of Food Additives and Ingredients, School of Food Science, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China)

Abstract: Flavoring base with good flavor was prepared from the papain hydrolysate of visceral waste proteins of grass carp and glucose through Maillard reaction. The optimal reaction conditions were found to be: carbonyl/ammonia molar ratio, 1:2; reaction time, 30 min; temperature, 110 ℃; and pH, 8.0. Gas chromatography-olfactometry mass spectrometry (GC-O-MS) was used to detect aroma compounds before and after the thermal reaction. After the reaction, aroma active compounds increased obviously. A total of 19 aroma active compounds were detected, including 3 ketones and aldehydes, 1 ester,
4 furan, 1 pyrazine, 1 thiazole , 2 terpenoids, 2 alkenes , 1 ether, and 1 acid.

Key words: grass carp viscera; thermal reaction; flavor

中图分类号：TS205 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）22-0006-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201422002

目前世界渔业产量正处于稳定时期，每年大约有26.4亿 t的产量[1]，仅内脏废弃物就可以达到300 000 t[2]。在鱼类加工中，产生大量的包括鱼头、鱼骨、鱼鳞和内脏等下脚料，其中鱼内脏的含量最大。草鱼是中国淡水养殖鱼类中产量最高的鱼种，2010年，草鱼产量达到422.22万 t[3]。目前，我国水产品加工率不到30%，远远低于发达国家（＞80%），对下脚料的利用更少[4]，多数企业将其作为固体废弃物处理，造成了资源浪费和环境污染，因此，有效利用鱼类加工副产物的研究，减轻环境污染，一直是人们积极探讨的问题。草鱼内脏中富含的氨基酸、有机酸及核苷酸等呈味物质[5]，是生产纯天然调味品的理想原材料[6]。

本实验以脱脂草鱼内脏蛋白水解液作为原料，制备美拉德反应调味基料并分析了香味成分，为以后制备新型复合调味料提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

草鱼内脏购于北京市四道口水产品批发市场。

木瓜蛋白酶（酶活力4 982 U/g） 美国Sigma公司；
乙醚、浓硫酸、盐酸、硼酸、硫酸钾 北京化学试剂公司；氢氧化钠 西陇化工股份有限公司；甲醛 天津市永大化学试剂公司；硫酸铜 天津市光复科技发展有限公司；溴甲酚绿-甲基红（质量分数0.2%的甲基红乙醇（95%）溶液和0.2%的溴甲酚绿无水乙醇溶液以体积比5∶1混合） 本实验室自制；系列烷烃（C7～C22，均为色谱纯） 北京化学试剂公司。

1.2 仪器与设备

DKB-501A超级恒温水槽 上海精宏实验设备有限公司；PHS-3D功能型pH计 上海三信仪表厂；TB214型电子天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司；CR22G型离心机 日本Hitachi公司；Kejeltic 2100型凯氏定
氮仪 瑞士Foss公司；D2004W电动搅拌器 上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司；Spectrumlab 22pc可见分光光
度计 上海棱光技术有限公司；YX-280D型灭菌锅 江阴滨江医疗设备有限公司；7890A-7000气相色谱-质谱联机、DB-WAX毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm） 美国Agilent公司；ODP2嗅闻检测仪 德国Gerstal公司；萃取瓶 北京玻璃仪器厂；DVB/CAR/PDMS手动固相微萃取进样器（50/30 μm） 美国Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 脱脂草鱼内脏蛋白酶解产物的制备

将去除胆囊和鱼鳔的草鱼内脏清洗，绞碎，置于95 ℃水浴锅中20 min，灭内源酶活[7-8]。冷却后按料液比1∶1（g/mL）加入去离子水，在4 ℃、8 000 r/min的条件下离心10 min，去除上层液体，收集下层沉淀。重复上述操作3 次，得到粗脱脂草鱼内脏蛋白质。以脱脂草鱼内脏蛋白为底物恒温水浴酶解，添加木瓜蛋白酶66.84 mg、反应温度62.35 ℃、反应时间5.37 h、pH 7.9，酶解结束时将酶解液在95 ℃水浴中灭酶15 min。

1.3.2 美拉德反应基本条件的确定

取定量草鱼内脏水解液，采取单因素控制变量法分别控制葡萄糖添加量（羰氨物质的量比）、反应体系初始pH值、反应温度、反应时间这4个单因素进行美拉德反应，测定反应液中的氨态氮含量，计算反应后的氨态氮损失率，并进行感官评定。

氨态氮的测定：甲醛电位滴定法[9]。

蛋白质含量测定：采用双缩脲法，多肽含量为蛋白质总量-氨态氮的量[10]。

感官评定：感官评价采用排序检验法测定[11-12]，选12 位评价员（6男6女，23～50 岁），有超过200 h的感官评价经验， 以表1为感官评价参考标准。将美拉德反应液作为品尝对象，比较待测样品与对照样品中滋味感差别，评价其滋味。美拉德反应液放入口中15 s吐出，每个样品给两次，打分采用五分制。评定前用清水漱口，评定时拒绝交流，且样品需用带中性的文字标明，避免主观评价。

表 1 感官评价的标准

Table 1 Criteria for sensory evaluation of Maillard reaction products (MRPs)

1.3.3 固相微萃取（solid-phase microextraction，SPME）-气相色谱-嗅闻-质谱（gas chromatograph-olfactometry-mass spectrometer，GC-O-MS）联用仪对挥发性风味物质的检测

称取5 mL待测液，装入固相微萃取小瓶，密封，50 ℃水浴平衡30 min，然后将固相微萃取针头插入小瓶中，推动手柄使纤维头处于顶空状态，吸附30 min，进样。

DB-WAX毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），程序升温：初始温度40 ℃，保持3min，以5 ℃/min速率升温到200 ℃，保持0 min，再以10 ℃/min速率升温到240 ℃，保持5 min。载气氦气（He），恒定流速1.2 mL/min，
进样口温度250 ℃，压强14.87 psi，不分流。

质谱条件：接口温度280 ℃，电子电离源，电子能量70 eV，离子源温度230 ℃，四极杆温度150 ℃，溶剂延迟3 min，质谱扫描范围40～600 u。

嗅觉检测器：接口温度为200 ℃。用预处理后的样品和标准香气化合物对3 位评价员组成的感官评价小组进行培训后，方可进行实验。在嗅觉检测口，感官评价人员及时记录下嗅闻到的香味时间，香味特性和香气强度。至少2 人描述一致时才可确定其为香气活性化合物。

化合物定性：通过检索质谱库NIST08提供的标准质谱图，仅当正反匹配度均大于800（最大值1 000）的化合物才给予列出，并标记为MS；通过系列烷烃计算出未知化合物的保留指数（retention index，RI），并与标准化合物进行比对，一致者标记为RI；评价员嗅闻到的香味与标准化合物的芳香特性相对比，相符者予以标记为O。RI公式如下：

式中：ta为样品a的保留时间；tn为系列烷烃Cn的保留时间；n为系列烷烃碳的个数。

2 结果与分析

2.1 羰氨物质的量比对美拉德反应的影响

图 1 羰氨物质的量比对氨态氮损失率的影响

Fig.1 Effect of carbonyl/ammonia molar ratio on amino nitrogen loss

图 2 羰氨物质的量比对多肽含量的影响

Fig.2 Effect of carbonyl/ammonia molar ratio on peptide content

取定量草鱼内脏水解液，分别按不同的羰氨物质的量比1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1加入葡萄糖，混匀后调节pH值至7，置于110 ℃条件下反应l h，测定反应液中的氨态氮含量，计算反应后的氨态氮损失率，并进行感官评定。

表 2 羰氨物质的量比对水解液风味的感官评价

Table 2 Effect of carbonyl/ammonia molar ratio on
flavor characteristics of MRPs

由图1、2和表2可以看出，随着羰基比例的增加氨基酸的损失率先增加而后稍微趋于平稳，多肽含量也是先呈下降趋势而后升高，说明在羰氨物质的量比为1∶2时羰基和氨基的量最适合美拉德反应体系，整个体系反应最为充分，肉香味和鲜味都有先增强后减弱，酸味和腥味较强。方差分析显示氨态氮损失率在羰氨物质的量比各比例之间差异均显著（P＜0.05），多肽含量在羰氨物质的量比1∶3与1∶2之间差异显著，其他比例之间差异不显著，综合考虑，羰氨物质的量比1∶2为适宜。

2.2 体系初始pH值对美拉德反应的影响

取定量草鱼内脏水解液，按羰氨物质的量比1∶2加入葡萄糖，分别调节不同的初始pH值为5、6、7、8、9，置于110 ℃条件下反应l h，测定反应液中的氨态氮含量，计算反应后的氨态氮损失率，并进行感官评定。

图 3 pH值对氨态氮损失率的影响

Fig.3 Effect of pH on amino nitrogen loss

图 4 pH值对多肽含量的影响

Fig.4 Effect of pH on peptide content

表 3 pH值对水解液风味的感官评价

Table 3 Effect of pH on flavor characteristics of MRPs

由图3、4和表3可以看出，随着pH值的增加，氨态氮的损失率呈先增加后减少的趋势，多肽含量呈现先降低后增加的趋势，这说明美拉德反应在pH 8时反应最为剧烈；就感官而言，随着pH值的升高，产物的鱼腥味、苦味、酸味等不愉快气味逐渐增强，肉香味、鲜味和鱼香味逐渐增强，脂肪味没有变化。显著性分析显示氨态氮损失率在各pH值之间差异都显著（P＜0.05），多肽含量在pH值为8与9之间差异显著，其他相邻pH值之间差异不显著，综合考虑，适宜pH 8。

2.3 反应温度对美拉德反应的影响

图 5 反应温度对氨态氮损失率的影响

Fig.5 Effect of reaction temperature on amino nitrogen loss

图 6 反应温度对多肽含量的影响

Fig.6 Effect of reaction temperature on peptide content

取定量草鱼内脏水解液，按羰氨物质的量比1∶2加入葡萄糖，混匀后调节pH值至7，分别置于80、90、100、110、120 ℃条件下反应l h，测定反应液中的氨态氮含量，计算反应后的氨态氮损失率，并进行感官评定。

表 4 反应温度对水解液风味的感官评价

Table 4 Effect of reaction temperature on flavor characteristics of MRPs

由图5、6和表4可以看出，随着反应温度的升高，氨态氮的损失率呈先增加后平稳的趋势，多肽含量先降低后趋于平稳，这说明美拉德反应在温度为110 ℃时反应最为剧烈；从感官评价方面看，在低于100 ℃时，产物脂肪味、鱼腥味都较重，而高于100 ℃以后，脂肪味、鱼腥味、涩味基本无变化，且肉香味和鱼香味较强烈，但达到120 ℃时，有较弱的焦糖味出现。显著性分析显示氨态氮损失率在各相邻温度之间差异都显著
（P＜0.05），多肽含量在80 ℃与90 ℃之间差异显著，其他相邻温度之间差异不显著，综合考虑，适宜温度为110 ℃。

2.4 反应时间对美拉德反应的影响

取定量草鱼内脏水解液，按羰氨物质的量比1∶2加入葡萄糖，混匀后调节pH值至7，置于110 ℃条件下反应时间分别为20、30、40、50、60 min，测定反应液中的氨态氮含量，计算反应后的氨态氮损失率，并进行感官评定。

图 7 反应时间对氨态氮损失率的影响

Fig.7 Effect of reaction times on amino nitrogen loss

图 8 反应时间对多肽含量的影响

Fig.8 Effect of reaction time on peptide content

表 5 反应时间对水解液风味的影响

Table 5 Effect of reaction time on flavor characteristics of MRPs

由图7、8和表5可以看出，随着反应时间的延长，氨态氮损失率呈先增加后平稳的趋势，多肽含量呈现升高的趋势，这说明美拉德反应在时间为30 min时反应最为剧烈；就感官而言，随着时间的延长，产物的鱼腥味、苦味、酸味等不愉快气味逐渐减弱，肉香味逐渐增强。显著性分析显示氨态氮损失率在时间为20、30、50 min之间差异显著（P＜0.05），多肽含量在各温度之间差异均显著，综合考虑，适宜温度为30 min。

2.5 美拉德反应前后SPME-GC-O-MS分析结果

表 6 酶解液中的香气活性化合物

Table 6 Aroma-active compounds of the hydrolysate

表 7 美拉德反应液中的香气活性化合物

Table 7 Aroma-active compounds of MRPs

从表6、7可以看出，美拉德反应前后挥发性风味成分发生了变化，从木瓜蛋白酶水解得到的酶解液中共检测到12 种香气活性化合物，其中包括酮类3 种、醛类3 种、酯类1 种、呋喃类1 种、醚类1 种、萜类1 种、烯类2 种。经过美拉德反应之后，香气活性化合物明显增多，检测到19 种香气活性化合物，其中包括酮类3 种、醛类3 种、酯类1 种、呋喃类4 种、吡嗪类1 种、噻唑类1 种、萜类2 种、烯类2 种、醚类1 种、酸类1 种。

3 讨论与结论

目前，应用美拉德反应制备水产调味料的报道比较多。陈军等[13]在罗非鱼下脚料酶解液美拉德反应制备肉类风味物工艺的研究中，通过控制反应体系的pH值、反应时间、反应温度和葡萄糖与木糖添加量的比值来进行反应，从反应得到的肉香味和鲜味的浓郁程度、色泽的深浅、有无腥味等方面来进行感官分析，最终得出的最佳反应条件为pH 7.0、反应时间90 min、反应温度115 ℃、葡萄糖∶木糖=4∶1。张彩菊等[14]以鳙鱼酶解产物为基料进行鱼味香料制备的研究中发现，pH值、反应时间、反应温度和反应物体积分数对产品的感官性能有较显著的影响，4 个要素相互作用，最终决定反应得到的调味基料风味如何。研究还发现产生鱼香味的前提物质就是酶解产物中存在的氨基酸、短肽、蛋白质等，这些也是产生强烈鱼香味的必要条件。乔路等[15]从鲜味、咸味、腥味和苦味4 个方面对美拉德反应的反应物进行了感官评价，进一步研究了木糖和葡萄糖的添加量。反应前后的感官评价进行分析发现反应产物的鲜味明显得到增强，腥味和苦味等不好的味道大大减弱，整体风味得到了提升。水解风味得到提升的主要原因在于反应会产生多种风味物质，如酚类、酯类、酮类、醛类、羧酸类及杂环类等。靳挺等[16]在研究龙头鱼海鲜调味料的制备中，配方以口味纯正的咸味调味物食盐[17]和甜味调味料蔗糖为基料，同时增加了白胡椒粉和姜蒜粉，通过对反应物色泽、香气和滋味的感官评价发现香辛料的加入起到了增香、调味的作用。同时各种成分的协调作用在一定程度上对调味料的风味和口感产生了良好的影响，使得调味料具有纯正、自然的鱼香味，并且口感鲜美。王浩等[18]以吉富罗非鱼鱼皮为反应产物进行美拉德反应，分析游离氨基酸的组成和主要风味成分采用的方法是氨基酸自动分析仪和气相色谱-质谱联用仪，鉴定出5 种主要的风味成分，包括是柠檬烯、乙酸乙酯、乙酸异丙酯、2,3-二羟基丙醛、二乙二醇丁醚醋酸酯等。

关于鱼内脏蛋白质方面的研究报道比较少，Bhaskar等[19]优化了卡特拉鱼内脏蛋白质的水解条件，获得了氨基酸组成合理的水解物。本研究探索性的将草鱼内脏蛋白酶解液与葡萄糖进行美拉德反应，制备出了风味良好的美拉德产物，获得的最佳反应基本条件为：羰氨物质的量比1∶2、反应温度110 ℃、反应时间30 min、反应pH 8。通过GC-O-MS对美拉德反应前后香气化合物成分进行分析，发现通过美拉德反应可以明显增加酶解液的风味成分，尤其是香气活性化合物明显增多。气相色谱-嗅闻测定法分析结果主要为油脂味、清新味、甜香味、花香味、烧烤味、焦甜味、花香味、辛辣味、刺激味等。风味物质主要为醛类、酯类、酚类、醇类、吡啶、噻唑等化合物。结合感官评价结果，美拉德反应调味基料的整体滋气味主要为肉香味、鱼香味、油脂味、鲜味、酸味和腥味，因此如何有效降低草鱼内脏蛋白水解液美拉德反应调味基料的酸味和腥味将是未来研究的重点内容。本研究结果为美拉德反应在改善鱼内脏风味方面的应用提供了理论依据。

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