低聚异麦芽糖铁配合物的制备工艺优化

毛 凯，杨 琴，刘 丽，潘红春*，魏利华，刘 红*

（西南大学药学院，重庆药物过程与质量控制工程技术研究中心，重庆 400715）

摘 要：以低聚异麦芽糖和FeCl3为原料，以铁含量为指标，在单因素试验的基础上，采用星点设计-效应面法对反应时间、反应温度、起始pH值3 个主要因素进行优化。通过反应过程中产物的pH值、粒径、铁含量、Zeta电位、多分散指数、电导率的监测阐明低聚异麦芽糖铁的生成变化规律，并对产物的理化性质进行初步表征。结果表明：当糖铁质量比为1∶1.5时，低聚异麦芽糖铁的最佳制备工艺为反应温度88 ℃、反应时间2.7 h、反应起始pH 12.1，此条件下铁含量可达37.14%，通过过程监测阐明了低聚异麦芽糖铁的反应生成规律，为最优工艺的可信度提供了理论依据，且所得产物具有良好的理化性质，有望进一步开发成为新型的补铁剂。

关键词：低聚异麦芽糖铁；制备；工艺优化；过程监测；理化性质

Optimization of Preparation Process for Isomaltooligosaccharide-Iron Complex

MAO Kai, YANG Qin, LIU Li, PAN Hong-chun*, WEI Li-hua, LIU Hong*

(Chongqing Engineering Research Center for Pharmaceutical Process and Quality Control,
College of Pharmaceutical Sciences, Southwest University, Chongqing 400715, China)

Abstract: The key reaction conditions (time, temperature and initial pH) for the complexation of FeCl3 with isomaltooligosaccharide were optimized with respect to iron content of the final product by response surface methodology using a central composite design. The formation and evolution of isomaltooligosaccharide-iron complex were elucidated by measuring the pH, particle size, iron content, zeta potential, polydispersity index and conductivity of reaction products and physicochemical properties of the final complex were characterized. Results showed that when the reaction proceeded for
2.7 h at 88 ℃ with an initial pH of 12.1, the obtained product contained up to 37.14% iron. The predicted optimal conditions were demonstrated to be reliable. The resulting product had excellent physicochemical properties and therefore could be expected to be developed into new iron supplements.

Key words: isomaltooligosaccharide-iron complex; preparation; process optimization; process monitoring; physicochemical properties

中图分类号：R914.5 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）22-0022-06

doi:10.7506/spkx1002-6630-201422005

铁是人体内必需的微量元素之一，体内铁缺乏就会导致缺铁性贫血[1]。长期以来，一直选用亚铁盐来治疗缺铁性贫血，但其化学性质不稳定，生物利用度差，消化道刺激作用显著，并且易在体内产生内源性自由基造成细胞膜损伤[2]。因此，亚铁盐并不是理想的补铁剂。

国内外的研究表明，多糖铁配合物作为新型补铁剂具有合适的稳定性，对胃肠道无或极少刺激作用，且配体多糖具有多方面的生物活性，释放后可被机体吸收利用，无毒副作用[3-5]。因此，多糖铁作为一种较为理想的补铁剂成为近年来的研究热点，如利用玉米、向日葵、孔石莼、玉竹、金针菇、二色补血草等提取多糖制备多糖铁的研究屡见报道[6-11]。

低聚异麦芽糖（isomaltooligosaccharide，IMO）又称异麦芽寡糖、异麦芽低聚糖、分支低聚糖。它普遍存在于大麦、小麦及马铃薯等植物之中，是一种功能性低聚糖，具有低甜度、难发酵、耐热、耐酸、保湿性好和风味优良等特性，它还具有促进双歧杆菌增殖、调整肠道菌群平衡、增加维生素的合成、促进多种矿物质的吸收、降低胆固醇水平等生理功效，广泛地应用于医药、食品、保健品等行业，成为国内外用量大、应用面广的糖类产品[12-15]。由于低聚异麦芽糖已实现工业化生产且生理功能良好，将其作为原料制成的多糖铁能同时发挥补铁作用和多糖自身的多种功效，且成本较低，利于大规模生产。基于这种思路，本实验借鉴常用的化学合成方法[16-17]，设计制备了一种新型的补铁剂——低聚异麦芽糖铁配合物，采用星点设计-效应面法进行了工艺优化，并对其理化性质进行了初步研究，为将低聚异麦芽糖铁配合物进一步开发成营养型补铁剂打下一定基础，同时也为低聚异麦芽糖的更广泛应用拓展了新思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

低聚异麦芽糖IMO-900型 广州汇健生物科技有限公司；三氯化铁、氢氧化钠、无水碳酸钠、硫酸亚铁铵、邻菲罗啉、醋酸钠、抗坏血酸、亚铁氰化钾、硫氰酸钾、乙醇、甲醇、丙酮（均为分析纯） 成都市科龙化工试剂厂。

1.2 仪器与设备

UV-2550型紫外-可见分光光度计、IRPrestige-21型傅里叶变换红外光谱仪 日本岛津公司；Nano ZS-90型马尔文激光粒度仪 英国马尔文公司；TGL-16M高速台式冷冻离心机 长沙湘仪离心机仪器有限公司；RE-5205旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂；FE-20K实验室pH计、EL104电子天平 梅特勒-托利多（上海）有限公司；DF-101s型集热式恒温加热磁力搅拌器 郑州科丰仪器设备有限公司；DZF-6021型真空干燥箱 苏州江东精密仪器有限公司；LH75G-4型超纯水机 重庆浪华仪器设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 低聚异麦芽糖铁的制备

称取1.0 g的低聚异麦芽糖溶于10 mL的蒸馏水中，室温搅拌下加入0.5 mol/L的Na2CO3溶液10 mL，混匀后边搅拌边加入0.46 mol/L的FeCl3溶液20 mL，并用5 mol/L的NaOH溶液调节pH值至12，在80 ℃水浴条件下回流反应2 h后过滤，将滤液旋蒸浓缩，冷却至室温，加入3倍体积的无水乙醇醇析，4 000 r/min离心15 min，倾去上清液，沉淀依次用5 mL的甲醇，无水乙醇和丙酮洗涤，真空干燥，得到低聚异麦芽糖铁粗品。将粗品溶于纯水，经常温透析6 h除盐，旋蒸浓缩，3 倍无水乙醇醇沉及5 mL的甲醇，无水乙醇和丙酮洗涤，真空干燥，得到低聚异麦芽糖铁粉末精品。

1.3.2 单因素试验

在固定试验条件反应起始pH 12、反应时间2 h、反应温度80 ℃、低聚异麦芽糖与三氯化铁质量比1∶1.5条件下进行单因素试验，分别考察反应起始pH值（11.0～13.0）、反应温度（60～100 ℃）、反应时间（1～4 h）、糖铁质量比（1∶1～1∶2）对低聚异麦芽糖铁的铁含量的影响。

1.3.3 星点设计-效应面法试验

依据星点设计-效应面法试验原理[18-19]，在单因素试验的基础之上，选取反应温度、反应时间、反应起始pH值3 个关键因素进行星点优化试验，试验因素与水平见表1。

表 1 星点设计因素与水平

Table 1 Factors and levels used in central composite design

1.3.4 低聚异麦芽糖铁的反应过程监测

以反应液的pH值以及纯化产物的铁含量、粒径、多分散指数（polydispersity index，PDI）、Zeta电位、电导率为指标，监测优化工艺条件下低聚异麦芽糖铁的6 h反应过程，通过长时间的过程监测来阐明低聚异麦芽糖铁的生成变化规律。

1.3.5 铁含量测定

采用邻菲罗啉分光光度法[20-21]。

1.3.5.1 标准曲线的制作

精密称取0.702 3 g硫酸亚铁铵溶于纯水，并移至1 000 mL容量瓶中，加3 mL盐酸，用水定容至刻度即得铁质量浓度为100 mg/L的铁（Ⅱ）标准溶液，分别吸取标准铁溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL注入50 mL容量瓶中，加入5 mL抗坏血酸溶液（10 g/L），摇匀后加入5 mL醋酸钠溶液（1 mol/L）和3 mL的邻菲罗啉溶液（1 g/L），加纯水至刻度摇匀，静置10 min，在最大吸收波长510 nm处测定吸光度，绘制标准曲线。

1.3.5.2 样品铁含量的测定

准确称取样品0.01 g加20 mL纯水溶解，用滴管缓慢滴加5 mol/L的盐酸3 mL，搅拌，加热煮沸5 min，冷却加水定容至100 mL，取5 mL溶液加入50 mL容量瓶，按上述方法处理，然后在510 nm波长处测定吸光度，最后计算出样品的铁含量。

1.3.6 理化性质分析

1.3.6.1 一般物理性质分析

考察低聚异麦芽糖铁的外观、溶解性、溶液pH值等一般物理性质，用以亚铁氰化钾和硫氰酸钾检验其水溶液中的游离铁[22]。

1.3.6.2 稳定性实验

取精制样品0.1 g配成50 mL溶液，分别用0.01 mol/L的NaOH和HCl溶液滴定，取不同pH值条件下的溶液滴加亚铁氰化钾观察是否变色。将样品粉末及溶液常温放置10 d，考察样品的性状变化。

1.3.6.3 还原性实验

采用邻菲罗啉比色法[11]对样品进行还原性实验。取0.1 g样品用纯水溶于100 mL容量瓶中，取1 mL样品加入50 mL容量瓶，滴加稀盐酸分别控制pH值为1、2、3、4、5、6、7，加5 mL 10 g/L的抗坏血酸溶液，3 mL 1 g/L
的邻菲罗啉溶液，定容，置于37 ℃水浴还原反应。取0～5 h内不同时间点的反应液于510 nm波长处测吸光度，以空白试剂为参比溶液。

1.3.6.4 红外光谱测定

用傅里叶红外光谱仪测定低聚异麦芽糖铁的红外光谱，KBr压片，扫描波数范围400～4 000 cm－1。

1.3.7 铁含量的计算

标准曲线：以标准铁溶液中铁离子的质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制曲线，线性方程为：A = 0.201 5C＋0.011 4，R2= 0.9999（式中：A为吸光度，C为铁离子质量浓度/（mg/L））。样品中铁含量计算见下式。

2 结果与分析

2.1 单因素低聚异麦芽糖铁中铁含量的影响

A.反应时间；B.反应温度；C.反应起始pH值；D.低聚异麦芽糖与三氯化铁的质量比。

图 1 各因素对低聚异麦芽糖铁中铁含量的影响

Fig.1 Effect of various reaction conditions on iron content of isomaltooligosaccharide-iron complex

在合成低聚异麦芽糖铁的实验过程中发现，反应时间、反应温度、反应起始pH值、低聚异麦芽糖与三氯化铁的质量比对产物的铁含量均有影响，所以本实验对这些因素进行单因素试验。

分别于1.0、2.0、2.5、3.0、4.0 h取样进行试验，由图1A可知，随着反应时间的延长，低聚异麦芽糖铁的铁含量逐步上升，但时间超过2.5 h后，铁含量随着时间的延长而大幅下降。

分别控制反应温度为60、70、80、90、100 ℃进行试验，由图1B可知，低聚异麦芽糖铁的铁含量随着温度的升高而增加，当温度超过90 ℃后，铁含量急剧下降。

分别调节反应液的起始pH值为11.0、11.5、12.0、12.5、13.0进行试验，由图1C可知，随着反应pH值增大，低聚异麦芽糖铁的铁含量不断增加，当pH值为12.0时，达到最大值，此后，铁含量开始小幅度下降。

分别按照反应原料糖铁质量比为1∶1、1∶1.2、1∶1.5、1∶1.8、1∶2进行试验，由图1D可知，低聚异麦芽糖铁的铁含量受糖铁质量比影响较小，在质量比为1∶1.5时铁含量最大，但增加和减小质量比其基本保持不变，故选择1∶1.5为制备工艺优化所有试验的糖铁质量比。

综上，反应时间、反应温度、反应起始pH值对样品铁含量的影响较大，是反应的关键因素，因此，选择这3 个因素作为工艺优化的试验条件。

2.2 低聚异麦芽糖铁星点设计结果分析

星点设计实验方案与结果如表2所示，方差分析如表3所示。

采用Design-Expert 8.0.6软件对所得数据进行多元回归拟合，所得二次多项回归拟合方程为Y=36.63＋0.014A－0.40B＋1.13C＋0.013AB－0.10AC－0.06BC－2.06A2－1.75B2－2.17C2。从表3得知，模型的显著性F＞0.05，P＜0.0001，r=0.961 4，说明此回归模型显著，此外模型方程失拟项很小，可认为方程对试验结果拟合情况较好，试验误差小，因此用其估计预测各因素对结果的影响是科学合理的。分析表中的P值可知，C、A2、B2、C2项对铁含量的影响显著，三因素对结果的影响由大到小为：反应起始pH值＞反应时间＞反应温度，二次项对结果影响较大，交互项影响较小。

表 2 低聚异麦芽糖铁的星点设计方案与结果

Table 2 Central composite design with experimental values of iron content for complexation of iron with isomaltooligosaccharide

表 3 方差分析

Table 3 Analysis of variance

注：**.高度显著，P＜0.000 1；*.显著，P＜0.05。

由Design-Expert 8.0.6软件分析，得到如图2所示的因素间交互作用的效应面3D和等高图，计算出最佳制备工艺条件为反应温度87.49 ℃、反应时间2.70 h、反应起始pH 12.08，预测铁含量为36.78%。

a.反应温度和反应时间

b.反应时间和反应起始pH值

c.反应温度和反应起始pH值

图 2 各因素交互作用的效应面和等高线图

Fig.2 Contour and response surface plots for the effects of reaction conditions on iron content

按照最优条件进行低聚异麦芽糖铁的制备验证实验，考虑实验的可操作性，将条件定为反应温度88 ℃、反应时间2.7 h、反应起始pH 12.1，重复3 次实验得到结果，低聚异麦芽糖铁的平均铁含量为37.14%，相对标准偏差为0.98%。实测值与预测值偏差较小，模型预测性较好，说明工艺条件稳定可行，具有实际应用价值[23]。

2.3 低聚异麦芽糖铁的反应过程监测

a.pH值和铁含量；b.粒径和Zeta电位；c.PDI和电导率。

图 3 低聚异麦芽糖铁反应过程监测结果

Fig.3 Physicochemical parameters of isomaltooligosaccharide-iron complex as a function of reaction time

如图3所示，在低聚异麦芽糖铁的生成过程中，反应液的pH值由12.1逐步下降，最后趋近于8，说明反应液中的OH－参与反应，产品的铁含量随反应时间的延长先增大，到2～3 h左右铁含量达到最大，其后迅速下降。随着反应的进行，所得的低聚异麦芽糖铁配合物的粒径先增大，2 h后趋于稳定，之后略有小幅降低，Zeta电位呈增加趋势。从PDI变化趋势来看，其值先降低后升高，3 h为最低，分布最均匀，而电导率整体较小，说明样品中游离铁较少。

综合以上说明反应初期低聚异麦芽糖与铁离子先缓慢聚集络合，随着时间的延长，反应络合程度增强，产物粒子的体积和铁含量增大，2～3 h时达到最优状态，此时，产物的粒径和铁含量达到最大，PDI最小，Zeta电位增大，体系更加稳定，电导率值较小，没有明显增加。其后，多糖的络合聚集活性可能受长时间高温影响减弱，Zeta电位的增大表明反应体系凝聚程度降低，趋于稳定，粒径和铁含量的降低以及PDI和电导率的增加说明可能有少量游离铁从产物中析出，通过低聚异麦芽糖铁的形成变化证明最佳工艺条件具有理论可信度。

2.4 低聚异麦芽糖的基本理化性质

2.4.1 物理性质

低聚异麦芽糖铁为棕黑色粉末，无臭无味，易溶于水，水溶液呈弱碱性，棕红色，不溶于甲醇，乙醇，丙酮等有机溶剂。透析除盐后的低聚异麦芽糖铁溶于水后，以亚铁氰化钾和硫氰酸钾检验其水溶液，结果溶液不变色，证实低聚异麦芽糖铁溶液中不存在游离的Fe3＋，说明生成了较为稳定的配合物。

2.4.2 稳定性实验

将样品溶液用酸碱滴定，结果表明在pH值为4～14时溶液不变色，澄清透明，无沉淀出现，说明低聚异麦芽糖铁在生理条件下可以完全溶解，稳定存在。将样品溶液与粉末放置空气中10 d，性状不变，说明样品可以常规放置，方便保存。

2.4.3 还原性实验

图 4 低聚异麦芽糖铁配合物与抗坏血酸反应的A-t图

Fig.4 A-t curves for the reaction system between isomaltooligosaccharide-iron complex and vitamin C

由图4可知，低聚异麦芽糖铁中的铁可被还原剂还原成机体能吸收利用的二价铁，2 h后几乎全部溶出，可见低聚异麦芽糖铁在生理条件下具有良好的溶出还原性能[24]，说明低聚异麦芽糖铁作为补铁剂具有较好的生物利用度，同时由于没有游离的Fe3＋存在，所以低聚异麦芽糖铁对消化道应无明显的刺激作用[11]。

2.5 低聚异麦芽糖铁的红外光谱分析

图 5 低聚异麦芽糖（a）和低聚异麦芽糖铁（b）的红外光谱

Fig.5 IR spectra of isomaltooligosaccharide (a) and isomaltooligosaccharide-iron complex (b)

由图5可知，低聚异麦芽糖铁配合物与低聚异麦芽糖图谱基本相似，反应并未使多糖的结构发生明显改变。此外，通过对多糖铁配合物的红外图谱分析可以发现852 cm－1和684 cm－1处吸收峰与文献[25-26]报道的β-FeOOH的特征吸收光谱相一致，这表明低聚异麦芽糖铁配合物中的铁核是β-FeOOH铁核，低聚异麦芽糖与铁成功地配位结合。

3 结 论

本实验以低聚异麦芽糖，氯化铁为原料合成了低聚异麦芽糖铁配合物，定性鉴定其为多糖铁配合物。采用星点设计-效应面法对其制备工艺进行优化，得到最佳条件为反应温度88 ℃、反应时间2.7 h、反应pH 12.1，此条件下制备的低聚异麦芽糖铁的平均铁含量为37.14%。实验表明低聚异麦芽糖铁不含游离铁，具有良好的耐受性和生物利用度。

本实验为低聚异麦芽糖铁的进一步研究提供了科学依据，为全面开发和综合利用低聚异麦芽糖提供了有益参考，并为新型补铁剂的研制和筛选提供了理论依据。

参考文献：

[1] POLIN V, CORIAT R, PERKINS G, et al. Iron deficiency: from diagnosis to treatment[J]. Digestive and Liver Disease, 2013, 45(10): 803-809.

[2] COOK J D. Diagnosis and management of iron-deficiency anaemia[J]. Best Practice & Research Clinical Haematology, 2005, 18(2): 319-332.

[3] CANÇADO R D, MUÑOZ M. Intravenous iron therapy: how far have we come?[J]. Revista Brasileira de Hematologia e Hemoterapia, 2011, 33(6): 461-469.

[4] LIU T C, LIN Shengfung, CHANG Chaosung, et al. Comparison of a combination ferrous furnarate product and a polysaccharide iron complex as oral treatments of iron defciancy anemia: a taiwanese study[J]. International Journal of Hematology, 2004, 80(5): 416-420.

[5] EICHBAUM Q, FORAN S, DZIK S. Is iron gluconate really safer than iron dextran?[J]. Blood, 2003, 101(9): 3756-3757.

[6] 邓晓磊, 张建华, 周金娥, 等. 玉米多糖铁制备工艺优化及铁含量测定[J]. 上海交通大学学报: 医学版, 2008, 28(11): 1398-1401.

[7] 杨树平, 韩立军, 邱燕华, 等. 向日葵茎髓多糖铁配合物的制备工艺[J]. 食品科学, 2012, 33(20): 61-64.

[8] SHI Jinming, CHENG Cuilin, ZHAO Haitian, et al. In vivo anti-radiation activities of the Ulva pertusa polysaccharides and polysaccharide-iron (Ⅲ) complex[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2013, 60(9): 341-346.

[9] 乌兰格日乐, 李永涛. 玉竹多糖铁配合物的制备工艺优化及铁含量测定[J]. 药物分析杂志, 2012, 32(4): 571-574.

[10] 马利华, 秦卫东, 陈学红, 等. 金针菇多糖-Fe(Ⅱ)螯合物的制备及抗氧化活性[J]. 食品科学, 2010, 31(20): 202-207.

[11] 李琳, 李稳宏, 雒羽, 等. 二色补血草多糖铁(Ⅲ)配合物的制备及理化性质研究[J]. 食品科学, 2012, 33(16): 54-58.

[12] XU Qiang, CHAO Yonglie, WAN Qianbing. Health benefit application of functional oligosaccharides[J]. Carbohydrate Polymers, 2009, 77(3): 435-441.

[13] PATAL S, GOYAL A. Functional oligosaccharides: production, properties and applications[J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2011, 27(5): 1119-1128.

[14] 赵晋, 王娇, 阚健全. 低聚异麦芽糖生理功能及应用的研究进展[J]. 食品研究与开发, 2007, 28(2): 166-168.

[15] 吴孔阳, 王学军, 周培华, 等. 响应面法优化黑曲霉发酵产低聚异麦芽糖培养基[J]. 食品科学, 2012, 33(19): 216-222.

[16] 张新国, 陈文洁, 曾艳龙, 等. 党参多糖铁的合成及鉴别[J]. 中医药学报, 2011, 39(1): 77-81.

[17] 李玉贤, 杨林莎. 百合多糖Fe(Ⅲ)配合物的制备及其理化性质[J]. 华西药学杂志, 2006, 21(6): 537-539.

[18] 陈立江, 王永杰, 刘宇, 等. 星点设计-效应面法优选南瓜多糖提取工艺[J]. 食品科学, 2013, 34(8): 107-112.

[19] ZHANG Xiaoqian, CHEN Jiye, MAO Meixin, et al. Extraction optimization of the polysaccharide from Adenophorae Radix by central composite design[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2014, 67(6): 318-322.

[20] 李明静, 杨静, 王宁, 等. 怀山药多糖铁(Ⅲ)的组成及性能表征[J]. 中国中药杂志, 2008, 33(16): 2002-2005.

[21] 李玉贤, 游志恒, 褚意新. 百合多糖铁复合物的合成及其铁含量的测定[J]. 中国实验方剂学杂志, 2010, 16(7): 47-49.

[22] ZHANG Zhongshan, WANG Xiaomei, HAN Zhiping, et al. Physicochemical properties and inhibition effect on iron deficiency anemia of a novel polysaccharide-iron complex (LPPC)[J]. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 2012, 22(1): 489-492.

[23] 丁黎艳, 郭晏华, 黄婷, 等. 星点设计-效应面法优化补骨脂炮制工艺[J]. 中国现代中药, 2013, 15(1): 56-59.

[24] 姜峻, 余腾飞, 张忠山. 浒苔多糖铁的制备及其理化性质研究[J]. 食品工业, 2012, 33(11): 30-32.

[25] MARSHALL P R, RUTHERFORD D. Physical investigations on colloidal iron-dextran complexes[J]. Journal of Colloid and Interface Science, 1971, 37(2): 390-402.

[26] 黄江波. 多糖/蛋白质调控纳米铁矿物生物矿化作用机理研究[D]. 武汉: 武汉理工大学, 2006: 22.