弗吉尼亚鼠刺叶片中稀少糖醇
生物转化及分离制备

窦德泉1，曾 艳2，朱玥明2，刘 灿2，孙媛霞2

（1.北京农学院园林学院，北京 102206；2.中国科学院天津工业生物技术研究所 工业酶国家工程实验室，天津 300308）

摘 要：为探讨使用鼠刺植物制备稀少糖醇的可能性，以弗吉尼亚鼠刺叶片为原料，热水提取其所含的稀少糖及糖醇，使用产酸克雷伯氏菌静息细胞对提取物的单糖类物质进行生物转化，再利用絮凝、离子树脂色谱分离以及乙醇结晶连用手段对转化的提取物进行纯化，最后使用核磁共振谱对获得的稀少糖醇进行分析鉴定。液相色谱分析结果显示弗吉尼亚鼠刺叶片提取物含有稀少D-阿洛酮糖和蒜糖醇，其质量分数分别为27.86%和7.86%；利用制备的产酸克雷伯氏菌的静息细胞进行60 h催化反应后，提取物中86%的D-阿洛酮糖转化为蒜糖醇，其余被细胞代谢消耗。多种分离纯化手段的联合使用，能有效去除杂质和色素，获得蒜糖醇纯品。

关键词：弗吉尼亚鼠刺；稀少糖醇；提取纯化；生物转化

Biotransformation and Purification of Allulose/Allitol from Itea virginica Leaves

DOU De-quan1, ZENG Yan2, ZHU Yue-ming2, LIU Can2, SUN Yuan-xia2

(1. College of Landscape Architecture, Beijing University of Agriculture, Beijing 102206, China; 2. National Engineering Laboratory for Industrial Enzymes, Tianjin Institute of Industrial Biotechnology, Chinese Academy of Sciences, Tianjin 300308, China)

Abstract: In this study, we investigated the possibility of producing rare sugar alcohols from Itea virginica leaves. Hot water was used to extract rare sugars/sugar alcohols from the leaves of this plant. It was showed that the extract of leaves contained 27.86% D-psicose and 7.86% allitol. The rare sugars in the extract were transformed by the resting cells of Klebsiella oxytoca. After 60 h reaction, 86% of D-psicose was converted into allitol, while the rest was consumed by cellular metabolism. Flocculation, ion exchange resin chromatography and ethanol crystallization were used to analyze the conversion products. Finally, the purified rare sugar alcohol was identified as allitol by 13CNMR.

Key words: Itea virginica; rare sugar alcohol; purification; biotransformation

中图分类号：Q946.3 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）22-0028-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201422006

弗吉尼亚鼠刺原产于北美东部，其树型美观，长势旺盛，易于修剪，可用作庭院色块、绿篱、造型群植或孤植等[1]。同时，弗吉尼亚鼠刺也是一种稀少糖醇含量较高的植物，日本学者研究表明其茎叶中的蒜糖醇含量不低于细胞干质量的10%[2]。自浙江森禾种业股份有限公司2001年引入弗吉尼亚鼠刺，经过多年的引种驯化和繁育，其已成为我国园林绿化上重要的观赏树种。然而，虽然目前国内已有弗吉尼亚鼠刺引种驯化和扦插繁育及其适应性的研究报道[3-4]，但对于其蒜糖醇含量鉴定、提取纯化及其生物转化却仍是空白。

弗吉尼亚鼠刺叶片中含有蒜糖醇（又名阿洛糖醇），是重要的六碳稀少糖醇。研究表明蒜糖醇具有独特的生理功能。给小鼠口服一定剂量蒜糖醇后，观察到小鼠小肠蠕动速度加快，含水量增加，出现腹泻现象，说明蒜糖醇具有润肠通便作用，可用于治疗便秘[5]。马耀辉等[6]发现蒜糖醇具有一定的降血糖功能，而且动物实验表明其降血糖的过程缓慢平稳，即使大量服用也不会发生低血糖危险。在韩国专利KR100372187中，蒜糖醇是一种治疗女性不孕症、保护男性生殖腺的药物填充剂[7]。而世界专利WO2008056453保护的一种抗龋齿药剂的配方中，除了D-阿洛酮糖、L-阿洛酮糖等外，蒜糖醇也是有效成分[8]。

D-阿洛酮糖是弗吉尼亚鼠刺叶片中含有的另外一种稀少糖，D-阿洛酮糖是D-果糖C3位差向异构体，但与
D-果糖在生理活性方面明显不同，当其被吸收到体内的时候，很少被代谢，因此其具有零卡路里的特性，同时还可以通过其抑制脂质合成的酶活性而减轻腹部肥胖的作用[9-11]。稀少糖/糖醇除了具有独特的生理学功能，根据Izumoring生产策略，在脱氢酶或产脱氢酶微生物催化下D-阿洛酮糖和蒜糖醇能相互转化，进一步以蒜糖醇为底物，转化形成L-阿洛酮糖、L-果糖、L-葡萄糖等一系列L型的稀少糖（图1）[2]，为六碳稀少糖/糖醇生物转化研究提供一定的实验参考[12-13]。

图 1 以蒜糖醇为基础的六碳稀少糖转化

Fig.1 The conversion of rare sugars based on allitol

本研究以弗吉尼亚鼠刺叶片为研究对象，借助干燥粉碎、热水抽提方式提取弗吉尼亚鼠刺叶片中的稀少糖及糖醇，然后利用静息细胞反应把弗吉尼亚鼠刺叶片中D-阿洛酮糖转化为蒜糖醇，进一步利用絮凝、离子树脂色谱分离以及乙醇重结晶等手段对提取物进行纯化，并通过核磁共振谱对获得的蒜糖醇晶体进行鉴定。该项研究将能促进我国稀少糖/糖醇研究及功能食品新资源的开发。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

弗吉尼亚鼠刺叶片采自北京农学院园林学院的弗吉尼亚鼠刺培养基地；产酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca G4A4）为实验室筛选获得；001×7 H型强酸性阳离子树脂、D301弱碱性N(CH3)2型阴离子树脂、D201大孔强碱性苯乙烯系阴离子树脂、AB-8聚苯乙烯非极性大孔吸附树脂 天津波鸿树脂有限公司；D-阿洛酮糖、蒜糖醇、没食子酸、槲皮素标准品 美国Sigma-Aldrich公司；乙醇、丁醇、氯仿、FeCl3、Ca(OH)2等试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

1200Series高效液相色谱系统（配有示差折光检测器） 美国安捷伦公司；AVANCEⅢ 600MHz NMR核磁共振仪 德国Bruker公司；GF254薄层层析硅胶版 天津思利达科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 弗吉尼亚鼠刺叶片稀少糖醇的提取

称取弗吉尼亚鲜叶若干，于70 ℃烘箱加热干燥至质量恒定，粉碎过40 目筛。按1∶10（g/mL）的料液比加入二次水，于90 ℃条件下搅拌加热1 h。冷却，使用砂芯漏斗过滤，滤液浓缩冷冻干燥即为提取物。

1.3.2 薄层色谱分析提取物主要成分

将点好样品的薄层层析板晾干后置于密闭的薄层层析缸中，以体积比V乙醇∶V丁醇∶V氯仿∶V水= 3∶6∶2∶1为展开剂，展开、取出、晾干，喷以体积分数10%硫酸-乙醇溶液，105 ℃烘约15 min。

1.3.3 多酚总量检测

参照谢倩等[14]方法，采用Folin-Ciocalteu试剂对提取物的多酚总量进行测试。使用没食子酸绘制标准曲线y=0.012x－0.007。其中，没食子酸质量浓度为横坐标，765 nm波长处紫外吸光度为纵坐标。

1.3.4 总黄酮含量检测

参照Erdogan-Orhan等[15]方法，采用氯化铝比色法测试提取物的总黄酮含量。使用槲皮素绘制标准曲线y=0.005x－0.085。其中，没食子酸质量浓度为横坐标，415 nm波长处紫外吸光度为纵坐标。

1.3.5 高效液相色谱分析提取物中的稀少糖成分[13]

色谱柱：Waters Sugar-Pak-Ⅰ（8 µm，6.5 mm×300 mm）；柱温：80 ℃；洗脱溶剂：超纯水；流速：0.4 mL/min；进样量：20 µL（20 mg/mL）；色谱采集时间：30 min。检测信号为示差折光率。以稀少糖质量浓度（mg/mL）为横坐标，示差折光信号相应值为纵坐标，绘制标准曲线。其中，蒜糖醇的标准曲线为y=17 395x－400.76，D-阿洛酮糖的标准曲线为y=10 679x－802.38。

1.3.6 产酸克雷伯氏菌静息细胞对鼠刺提取物中稀少糖的转化

利用实验室前期工作中筛选得到的能够将D-阿洛酮糖转化成蒜糖醇的产酸克雷伯氏菌，制备其静息细胞，具体方法参见文献[13]。利用pH 8.0的Tris-HCl缓冲液调整鼠刺提取物中总糖质量分数为0.5%，加入产酸克雷伯氏菌静息细胞并使其在反应体系中的光密度（OD600 nm）值为40左右，吹氮气后密封，37 ℃条件下静置培养，进行静息细胞反应。反应0、3、6、12、24、36、48、60、72 h取样，高效液相色谱检测D-阿洛酮糖的转化情况。

1.3.7 脱色树脂的粗筛

根据使用说明对树脂进行前期处理后，采用静态法粗筛树脂。具体操作以D201大孔强碱性苯乙烯系阴离子树脂静态吸附实验为例，称取5 g弗吉尼亚鼠刺叶片提取物，溶于100 mL二次水中，12 000 r/min离心15 min，移取上层清液，加入50 g经处理的D201树脂，置于摇床，设置摇床温度25 ℃、转速150 r/min，测试静态吸附0～6 h内，鼠刺叶片提取物在420 nm波长处紫外吸收，测定溶液颜色以及稀少糖含量的变化。并根据文献[16]提供的色素吸附率计算方法以420 nm波长处紫外吸收变化评估离子树脂的脱色效果。

1.3.8 FeCl3-Ca(OH)2絮凝[17]

称取5 g鼠刺叶片提取物，加入200 mL水，振荡溶解后，12 000 r/min离心20 min，移取合并上层清液。调节pH值至9.0，加入1.0 g的Ca(OH)2和0.25 g FeCl3，在 65 ℃条件下50 r/min 搅拌10 min后，静置1 h。离心，使用活性白土作为载体过滤，获得上层清液。

1.3.9 离子交换树脂动态吸附和乙醇结晶

称取5 g鼠刺提取物按照1.3.6节操作后，浓缩至50 mL，以0.6 mL/min流速转移至001×7 H型强酸性阳离子树脂色谱柱（内径2 cm，柱高50 cm），以二次水为淋洗剂进行洗脱。全程通过薄层分析监控，以3 mL/管的速率收集含有稀少糖的洗脱液合并，转移至D201强碱性阴离子树脂色谱柱（内径2 cm，柱高50 cm）。继续以二次水为淋洗剂，流速为0.6 mL/min进行洗脱，浓缩含有稀少糖的洗脱液，加入大量无水乙醇，于－20 ℃冰箱静置结晶。

1.3.10 13CNMR的分析

用D2O溶解适量乙醇结晶获得的白色固体，通过Bruker AVANCE Ⅲ 600MHz NMR核磁共振仪测定分析。

2 结果与分析

2.1 弗吉尼亚鼠刺叶片提取物中各成分的分析

A.高效液相色谱；B.薄层色谱。

图 2 弗吉尼亚鼠刺叶片提取物的糖类物质分析

Fig.2 Analysis of sugar substances in the extract of Itea virginica leaves

根据热风干燥的失重测试，弗吉尼亚鼠刺新鲜叶片的水分含量为62.5%。所得叶片提取物经冷冻干燥后，为棕黄色松散固体。在薄层色谱分析中，使用体积分数10%的硫酸-乙醇作为显色剂，发现提取物在层析板原点处有一无法移动的棕色大斑点，推测其可能为酚类物质。Folin-Ciocalteu和氯化铝比色法测试结果显示鼠刺提取物的总多酚质量分数（28.7±1.5）%（按没食子酸当量折算）、总黄酮质量分数（2.73±0.19）%（按槲皮素当量折算）。酚类和黄酮类化合物的大量存在，在使用高效液相示差折光信号检测鼠刺叶片提取物的单糖组成时，同样被观察到（图2虚线标记）。通过与稀少糖的标准品保留时间对照，发现弗吉尼亚鼠刺提取物主要含有稀少糖D-阿洛酮糖和蒜糖醇。标准曲线计算，其D-阿洛酮糖质量分数为27.86%，蒜糖醇则为7.86%。

2.2 利用产酸克雷伯氏菌静息细胞转化鼠刺提取物中的D-阿洛酮糖生成蒜糖醇

图 3 利用产酸克雷伯氏菌静息细胞转化鼠刺提取物中稀少糖的反应进程

Fig.3 Time courses of conversion of rare sugars in the extract of
Itea virginica using the resting cells of Klebsiella oxytoca

图 4 鼠刺提取物经静息细胞转化后产物的高效液相色谱分析

Fig.4 HPLC analysis of Itea virginica extract before and after being transformed by resting cells

弗吉尼亚鼠刺提取物中D-阿洛酮糖含量较高，大约是蒜糖醇的4 倍，为了获得更多的蒜糖醇，用实验室前期筛选得到的产酸克雷伯氏菌对鼠刺提取物中的单糖成分进行转化。前期实验结果发现，利用该产酸克雷伯氏菌的静息细胞可以将D-阿洛酮糖转化成蒜糖醇，底物质量分数0.5%时转化率约为83%[13]；当利用总糖质量分数0.5%的鼠刺提取物（D-阿洛酮糖质量分数0.4%）作为底物时，通过60 h的静息细胞反应，产物中检测不到D-阿洛酮糖，通过高效液相色谱数据计算发现，大约有86%的D-阿洛酮糖转化为蒜糖醇，推测其余的D-阿洛酮糖被菌体消耗利用（图3）。利用静息细胞对鼠刺提取物进行转化，一方面在细菌细胞膜的屏障作用下，阻碍提取物中杂质进入细胞内，避免了其对酶活的影响；另一方面，在转化生成蒜糖醇的同时，剩余少量的D-阿洛酮糖被细胞代谢，起到了生物净化的作用，方便了后续的纯化。转化后样品溶液的高效液相色谱分析如图4所示。

2.3 树脂吸附与FeCl3-Ca(OH)2絮凝的脱色和纯化效果

鼠刺提取物色素、糖苷等杂质的去除，是影响稀少糖纯化效果的关键因素。阴阳离子树脂和大孔吸附树脂能有效吸附植物黄酮与色素，已成功应用于核糖、葡萄糖、低聚木糖等糖工业生产的脱色纯化上[18-21]。因此，本研究选择了4 种代表性树脂，通过静态吸附实验测试树脂对鼠刺提取物脱色纯化的效果。结果表明，在这4 种树脂中，001×7 H型强酸性阳离子树脂不会造成提取物稀少糖的明显损失，但脱色效果有限。D301弱碱性N(CH3)2型阴离子树脂能吸附大部分色素，但对稀少糖特别是D-阿洛酮糖有吸收。AB-8大孔树脂的色素吸附率强，但是对处于薄层分析板原点处的极性酚类杂质作用效果小。在色素吸附方面，D201大孔强碱性苯乙烯系阴离子树脂比D301型树脂的效果好，同时其对极性酚类杂质的去除能力则优于AB-8大孔树脂，图5显示了D201型树脂的静态吸附率随时间的变化，这一结果与已有报道一致。吕蕾等[22]分析D201型树脂色素吸附效果好是因为强碱条件下色素中的酚羟基更容易解离成负离子从而被交换吸附，同时色素内的疏水结构基团可以通过范德华力与树脂苯环结合。而向大雄等[23]在使用树脂分离纯化葛根总黄酮时，发现在静态吸附中AB-8型树脂吸附的黄酮较易洗脱，而D201型树脂的洗脱率相对较低。

图 5 D201树脂对鼠刺叶片提取物色素静态吸附率随时间的变化

Fig.5 Change in static adsorption rate of pigments in the extract of
Itea virginica leaves onto D201 resin

进行单糖生物转化后的鼠刺叶片提取物经树脂脱色纯化浓缩后，若直接加入乙醇进行结晶，溶液会出现胶状物，导致析出的固体量甚少。推测这是因为其含有大量蛋白质、蜡质、多糖、鞣质等杂质。它们不仅能污染树脂降低柱效，还容易在加入乙醇时形成胶状固体，造成鼠刺叶片提取物的脱色纯化损失率高。而絮凝剂能提供大量的络合离子，强烈吸附这些胶体微粒，通过黏附桥架交联作用，促使其凝聚；中和胶体微粒及悬浮物表面电荷，降低胶团电位，破坏胶团稳定性，使其互相碰撞，形成沉淀[24-25]。在采用FeCl3-Ca(OH)2进行絮凝操作后，发现鼠刺提取物溶液的浑浊度减小，颜色变浅。

2.4 阳阴离子树脂动态吸附与乙醇结晶进一步纯化

考虑FeCl3-Ca(OH)2絮凝操作可能带入Fe3＋、Ca2＋阳离子，先使用001×7 H型强酸性阳离子树脂脱除阳离子，再采用D201强碱性阴离子树脂进行动态吸附。结果表明在进行相关操作后，浓缩洗脱液加入乙醇结晶时不会产生胶体。－20 ℃静置后有浅黄白色固体析出。过滤，使用乙醇进行重结晶能获得白色松散固体，其高效液相色谱保留时间与蒜糖醇标准物吻合，其13CNMR谱分析进一步证实这些白色松散固体为蒜糖醇（图6）。

A.高效液相色谱；B.核磁共振谱。

图 6 弗吉尼亚鼠刺提取物纯化后析出晶体的表征

Fig.6 Identification of the crystals from the extract of Itea virginica leaves after purification

3 结 论

本研究使用热水抽提从弗吉尼亚鼠刺叶片中提取稀少糖醇，发现该鼠刺含有D-阿洛酮糖和蒜糖醇两种稀少糖/糖醇，质量分数分别为27.86%和7.86%。利用产酸克雷伯氏菌静息细胞能将提取物中D-阿洛酮糖转化为蒜糖醇，转化率达到86%，其余D-阿洛酮糖被菌体消耗，起到了初步纯化的目的。进一步对产物的纯化鉴定进行研究表明：絮凝操作能有效降低提取液的浊度，并起到一定的脱色效果。而001×7 H型与D201型树脂的串联动态吸附能满足分离纯化中尽量去除色素同时保留产物的效果。通过乙醇重结晶得到的白色固体也被高效液相和核磁共振谱鉴定为蒜糖醇。这一工艺显示了如果大面积栽植弗吉尼亚鼠刺，有望实现从中使用工业化手段获得稀少糖醇用于功能糖生产。

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