乙醇-硫酸铵双水相体系萃取坛紫菜多糖

张鉥孟，陈美珍*

（汕头大学理学院生物系，广东 汕头 515063）

摘 要：探究不同系线长度的乙醇-硫酸铵双水相体系对坛紫菜多糖萃取的影响。采用浊点滴定法绘制乙醇-硫酸铵双水相相图，选取不同系线长度体系，测定其对紫菜多糖分配情况。结果表明：在乙醇质量分数27%、硫酸铵质量分数18%（即系线长度为40）、体系相比R为1.1时，紫菜多糖的回收率可达79.8%，分配系数K为0.23；其蛋白去除率明显高于传统醇沉法（双水相萃取多糖蛋白含量为1.20%，醇沉多糖蛋白含量为6.17%），且具有较好的脱色效果，可用于紫菜多糖的分离纯化。

关键词：双水相；系线长度；坛紫菜；多糖

Extraction of Polysaccharides from Porphyra haitanensis Using Ethanol-Ammonium Sulfate Aqueous Two-Phase System

ZHANG Shu-meng, CHEN Mei-zhen*

(Department of Biology, College of Science, Shantou University, Shantou 515063, China)

Abstract: The effect of tie line length (TLL) of ethanol-(NH4)2SO4 aqueous two phase system (ATPS) on the extraction of polysaccharides from Porphyra haitanensis was investigated. The phase diagram was obtained by cloud point titration, and then different TLLs of ATPS were selected and partition coefficients of polysaccharides were detected. The yield and partition coefficient of polysaccharides were 79.8% and 0.23, respectively, using a system consisting of 27% ethanol and 18% (NH4)2SO4 (forming a TLL of 40) with a top/bottom phase volume ratio of 1.1. The removal rate of protein was significantly higher than that reported with traditional ethanol precipitation method (1.20% vs 6.17%). Meanwhile, the proposed method had good decolorization effect. Thus, it can be used for the separation and purification of polysaccharides from Porphyra haitanensis.

Key words: aqueous two-phase system; tie line length (TLL); Porphyra haitanensis; polysaccharides

中图分类号：Q547 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）22-0046-04

doi:10.7506/spkx1002-6630-201422009

紫菜多糖属半乳聚糖硫酸酯，主要由半乳糖、3,6-内醚半乳糖和硫酸基等组成，其基本结构单位为3-β-D-半乳糖苷-1,4-α-L-3,6-内醚半乳糖组成的二糖[1-2]。紫菜多糖是一种多组分的水溶性多糖，含有大量的酸性多糖，糖链残基上不同程度地连接着硫酸根、甲氧基等基团[3-4]。研究[5-9]表明紫菜多糖具有抗凝血、降血脂、抗氧化、抗衰老、抗肿瘤和增强免疫功能等多种生物活性。多糖传统提取工艺存在着操作繁琐、破坏多糖结构、多糖损失率高、蛋白去除效果差等问题，因此，寻求一种高效、温和、操作简便的方法显得至关重要。

双水相萃取技术是利用组分在两个互不相溶的水相中的溶解度不同而达到分离的技术[10]。由于其具有高效、温和、操作简便、容易放大、回收率高，不存在有机溶剂残留及不会引起生物活性物质失活或变性等优点[11-13]，现已广泛应用于生物、医学、环境科学等各大领域，如抗生素分离、酶、蛋白质分离提纯和其他生物活性物质萃取以及药物分析和金属分离等[14-16]。

聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）-盐系统已用于萃取芦荟、双孢菇、香菇、毛木耳以及葡萄籽多糖[17-21]，同样也用于分离血红蛋白样品、人参皂苷、凝集素、结构类似蛋白等其他物质[22-25]，但聚合物存在难以回收、价格高等问题，于是醇-盐系统受到了人们的关注。有研究[26-30]报道使用乙醇-盐系统萃取螺旋藻多糖、灵芝酸、白藜芦醇、醌类化合物、重组人血清白蛋白等，而国内外还未见有关于双水相萃取紫菜多糖的报道，因此采用乙醇-硫酸铵这种廉价的双水相体系，探讨不同系线长度（tie line length，TLL）的体系对紫菜多糖萃取的影响，以期建立萃取分离紫菜多糖的最佳工艺条件。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

市售坛紫菜购于汕头市。

苯酚、无水乙醇、硫酸铵、H3PO4、浓硫酸（分析纯） 西陇化工股份有限公司；KBr、考马斯亮蓝G-250、牛血清白蛋白（分析纯） 美国Sigma公司。

1.2 仪器与设备

高速万能粉碎机 天津市泰斯特仪器有限公司；UV-2100C型紫外-可见分光光度计 美国Unico公司；UV-1800PC型分光光度计 上海美谱达仪器有限公司；OSB-2100型旋转蒸发仪 上海爱朗仪器有限公司；DK-S22型电热恒温水浴锅 上海精宏实验设备有限公司；IR200型傅里叶变换红外光谱仪 美国Thermo Nicolet公司。

1.3 方法

1.3.1 乙醇-硫酸铵双水相相图绘制

参照文献[14,26]，采用浊点滴定法测定乙醇-硫酸铵双水相相图中双节线的组成，反复重复操作并记录溶液出现混浊（即转变为两相区）至溶液澄清（即单相）过程中所加入的乙醇溶液和水的质量，并计算出各组分的质量浓度，绘制相图。

1.3.2 半乳糖标准曲线绘制

精密称取20 mg干燥至恒质量的半乳糖标准品，配成40 µg/mL的标准液。分别吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL，各以蒸馏水补至2.0 mL，然后加入6%苯酚1.0 mL及浓硫酸5.0 mL，混匀冷却，静置30 min以后于490 nm波长处测量吸光度，以2.0 mL蒸馏水按同样显色操作为空白，横坐标为半乳糖质量浓度，纵坐标为吸光度，得标准曲线。

1.3.3 牛血清白蛋白标准曲线绘制

称取考马斯亮蓝G-250 100 mg溶于50 mL 95%乙醇中，加入100 mL 85% H3PO4，用蒸馏水稀释至1 000 mL，滤纸过滤得考马斯亮蓝溶液；结晶牛血清白蛋白预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度用0.15 mol/L NaCl配制成1 mg/mL牛血清白蛋白标准溶液。

分别加入0、10、20、30、40、50 µL标准蛋白溶液，以蒸馏水补至50 µL，均加入2.5 mL考马斯亮蓝试剂后混匀，5 min以后测量其吸光度，以吸光度为纵坐标，蛋白质量浓度为横坐标，绘制标准曲线。

1.3.4 紫菜多糖液的制备

采用热水浸提法[31]，温度80 ℃、料液比1∶40、时间2 h。4 500 r/min，5 min 离心取上清液，得紫菜粗多糖液，浓缩至1/3体积得浓缩液，置于4 ℃冰箱待用。

1.3.5 双水相萃取紫菜多糖体系的优化

根据乙醇-硫酸铵双水相相图，选取5 个不同体系测定其对紫菜多糖分配的影响。预先配制质量分数为40%的硫酸铵母液，然后按照表1配制100 g体系，置于分液漏斗中振荡摇匀，静止一段时间使其分相完全后，测定上下相体积并计算相比（R）；分别取上下相测定其多糖和蛋白含量，计算紫菜多糖的分配系数（K）和收率（Y）。参数计算见式（1）～（3）：

（1）

（2）

（3）

式中：R为上下相体积比；V上和V下分别为双水相体系的上下相体积/mL；K为紫菜多糖在双水相体系中的分配系数；ρ上和ρ下分别为紫菜多糖在双水相体系中上、下相的质量浓度/（µg/mL）；Y为紫菜多糖在下相中的收率。

表 1 乙醇-硫酸铵双水相体系

Table 1 Ethanol-ammonium sulfate aqueous two phase system

注：以上为100 g体系中各组分的质量。

1.3.6 双水相萃取和乙醇沉淀法的比较

取上述紫菜多糖浓缩液，分别采用优化后的双水相体系和乙醇沉淀法[32]制备紫菜多糖并测定其多糖、蛋白含量。双水相萃取的多糖液经4 ℃冰箱放置一段时间，结晶析出大部分硫酸铵后再经透析、浓缩及真空冷冻干燥后得样品。

1.3.7 紫外检测

配制1 mg/mL的多糖液，以蒸馏水为对照，于200～400 nm进行全波段扫描，检测其是否有核酸、蛋白特征吸收峰。

1.3.8 红外光谱分析

取多糖样品1～2 mg按1∶100比例与KBr研磨压片，以KBr为参照物。用红外光谱仪测定，于400～4 000 cm－1
范围内进行扫描。

2 结果与分析

2.1 乙醇-硫酸铵双水相相图

图 1 乙醇-硫酸铵双水相相图

Fig.1 Phase diagram of ethanol-ammonium sulfate aqueous two-phase system

由图1可知，乙醇与硫酸铵在较大质量分数范围内均具有较好的成相能力，且必须保持一定的配比，质量分数过大或过小均不能形成双水相体系，与文献[27]报道一致。

2.2 多糖及蛋白标准曲线

半乳糖标准曲线回归方程为：y=0.010 1x－0.013 8（R2=0.995，y为半乳糖质量浓度/（µg/mL），x为吸光度）；牛血清白蛋白标准曲线回归方程为：y=0.589 6x－0.005 7（R2=0.999 4，y为蛋白质量浓度/（mg/mL），x为吸光度）。

2.3 双水相体系优化结果

表 2 双水相体系萃取紫菜多糖结果

Table 2 Extraction of polysaccharides from Porphyra haitanensis by ATPS

注：以上为3 次重复实验结果平均值。

图 2 蛋白及多糖分配系数图

Fig.2 Partition coefficient graphs of proteins and polysaccharides

静止分相后，上相颜色较深，为乙醇相；下相基本透明，为盐相；表明色素在上相得到富集。由表2可知，多糖均富集于下相，可能是由于上相乙醇质量分数高，多糖更易分配于下相所致。以多糖回收率为主要指标同时考察蛋白的分配情况，结果如图2及表2所示，得最优体系为：乙醇质量分数27%、硫酸铵质量分数18%（即TLL为40）。因此，乙醇-硫酸铵双水相体系萃取多糖的同时兼有脱色素效果。

2.4 传统醇沉及双水相萃取紫菜多糖比较结果

传统醇沉法制备的样品中多糖含量为30.83%，蛋白含量高达6.17%；而乙醇-硫酸铵双水相体系制备的样品中多糖含量达90%以上，蛋白含量仅为1.20%。相比传统醇沉法，乙醇-硫酸铵双水相体系具有较好的除蛋白效果。

2.5 紫外扫描结果

双水相萃取的紫菜多糖样品在260、280 nm波长处均没有特征吸收峰，而传统醇沉的多糖在280 nm波长处有吸收峰。

2.6 红外光谱结果

a.醇沉法制备的多糖；b.双水相萃取的多糖。

图 3 多糖红外图谱

Fig.3 Infrared spectra of polysaccharides

由图3可知，两种多糖红外图谱基本一致，均含有多糖类特征吸收峰，表明双水相萃取和传统醇沉法制得的多糖结构一致。

3 结 论

本实验探究了紫菜多糖在乙醇-硫酸铵双水相体系中的分配情况，实验结果表明：当乙醇质量分数27%、硫酸铵质量分数18%时，多糖分配系数K为0.23，富集于下相，收率Y可达79.8%。

在乙醇-硫酸铵双水相体系中，紫菜多糖更易分配于下相，而色素等杂质在上相富集。相比传统醇沉法，乙醇-硫酸铵双水相体系萃取的多糖样品中蛋白含量仅为1.20%，具有较好的除蛋白效果及脱色素作用。因此，可以利用其精制紫菜多糖，大大提高了多糖的纯度，具有较好的应用价值。

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