灵芝酒致浊成因及其除浊工艺优化

乔翠红，李美萍，张生万*

（山西大学生命科学学院，山西 太原 030006）

摘 要：对灵芝酒致浊物进行组成及成因分析，并通过单因素试验和正交试验考察澄清剂种类、用量、搅拌时间等条件对不同酒度灵芝酒澄清效果的影响。建立以玉米面为澄清剂，分别去除28°、38°、45°、53°灵芝酒沉淀的新工艺，其澄清剂用量分别为2、3、3、4 g/100 mL，搅拌时间分别为15、30、30、45 min，静置时间为24 h。

关键词：灵芝酒；致浊成因；除浊工艺；玉米面

Causes and Removal of Glossy Ganoderma Wine Turbidity

QIAO Cui-hong, LI Mei-ping, ZHANG Sheng-wan*

(College of Life Sciences, Shanxi University, Taiyuan 030006, China)

Abstract: The compounds causing glossy ganoderma wine turbidity were identified, and the mechanisms involved were investigated. The effects of clarifier type and amount, stirring time and standing time on clarification efficiency were investigated by single-factor and orthogonal array designs. Corn flour was the best clarifier for glossy ganoderma wine and the best concentration for clarifying wine samples with 28%, 38%, 45% and 53% (by volume) alcohol was 2, 3, 3 and 4 g/100 mL
by stirring for 15, 30, 30 and 45 min, respectively, before standing for 24 h.

Key words: glossy ganoderma wine; cause of turbidity; turbidity removal; corn flour

中图分类号：TS262.8 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）22-0050-06

doi:10.7506/spkx1002-6630-201422010

灵芝酒是由素以“仙药”、“瑞草”之称[1]的药用真菌灵芝及其他药材为原料，经米酒浸泡、加配蜂蜜等辅料科学勾兑而成。由于其独特的保健功能和药理作用倍受消费者青睐。但由于其致浊成因不清及除浊方法欠佳，常在贮运及销售过程中易失光或混浊，严重影响其感官和品质。王敏[2]采用加蛋清与冷冻澄清对富锗灵芝虫草酒处理，稳定性得到了一定的改善，但其能耗相对较高。曾里等[3]通过加入质量分数10%的明胶溶液，再用活性炭处理、微孔滤膜抽滤，其澄清效果明显，但操作复杂、成本高。明红梅等[4]采用明胶加壳聚糖复合澄清剂、潘玉萍等[5]通过加明胶及蛋清的方法除浊均取得了一定的效果，但对其致浊成因均未作任何说明。而且，这些除浊方法存在共同的问题：明胶和蛋清均属于蛋白类澄清剂，与多酚类物质相互作用，使灵芝酒的色泽变浅，其抗氧化活性也必然会减弱。

本实验从分析灵芝酒致浊物组成入手，并对其致浊成因及影响因素进行了系统的研究，建立了不同酒度灵芝酒的除浊方法。该法为灵芝酒的生产提供了科学依据和参考，工艺简单、成本低、易于工业化生产。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

28°、38°、45°、53°灵芝酒 广西西林县生源酒业有限责任公司；鸡蛋、玉米面 农贸市场；硅藻土、壳聚糖、聚乙烯吡咯烷酮（polyvinglpyrrolidone，PVPP）、皂土、明胶、单宁酸均为食品级；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

Nicolet 380傅里叶变换红外光谱仪 美国Thermo公司；UV-2550双光束紫外光谱仪 日本岛津公司；BD/BC-218CH变温冷冻冷藏箱 星星集团有限公司；HRZG-50真空干燥箱 青岛海尔特种电冰柜有限公司；ET93810台式浊度测定仪 北京艾诺威有限公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液的配制

明胶溶液：取1 份明胶置于5 份冷水中浸泡20～30 min，再加入5 份95 ℃的热水，搅拌即得完全溶解质量分数约10%的明胶溶液[6]；蛋清液：称取2 g新鲜鸡蛋蛋清，加入1 g NaCl，再加入98 mL蒸馏水，搅拌均匀，备用[7]；壳聚糖溶液：称取l g柠檬酸加98 mL蒸馏水后加热溶解，再加入1 g壳聚糖，继续加热，直至壳聚糖溶解，现用现配[8]；硅藻土溶液：称取2 g硅藻土，用98 mL蒸馏水浸泡24 h，充分吸水膨胀后，搅拌均匀，备用[9]；皂土悬浮液：称取10 g皂土，加入100 mL蒸馏水在59 ℃水浴中软化，浸泡24 h，不断搅拌成均匀的浆体[10]；PVPP溶液：称取1 g PVPP，加入50 mL蒸馏水浸泡24 h，期间不断搅拌，直至完全溶解，加蒸馏水定容至100 mL[11]；三氯化铁-铁氰化钾试剂：将质量浓度均为0.01 g/mL的三氯化铁溶液和铁氰化钾溶液在使用前等体积混合，现用现配；双缩脲试剂A液：称取1 g NaOH，加入蒸馏水不断搅拌至完全溶解，加蒸馏水定容至100 mL；双缩脲试剂B液：称取1 g CuSO4，加入蒸馏水不断搅拌至完全溶解，加蒸馏水定容至100 mL；缓冲液：用蒸馏水配制pH 3.7的0.02 mol/L的磷酸盐缓冲液，现用现配；单宁酸原液：准确称取0.003 0 g 单宁酸，溶于少量缓冲液，搅拌均匀，最后以缓冲液定容至100 mL，即可配制成30 mg/L的单宁酸原液；明胶原液：准确称取0.025 0 g明胶，溶于少量热的缓冲液，搅拌均匀，最后以缓冲液定容至100 mL，即可配制成250 mg/L的明胶母液，将明胶母液逐级稀释配制成5～125 mg/L的明胶原液。

1.3.2 致浊物分析

将灵芝酒放入－5 ℃冷柜中冷冻7 d，然后在低温条件下用0.45 μm混合滤膜进行抽滤，将沉淀置于真空干燥箱中进行干燥，再用充分干燥过的KBr进行压片，测定其红外吸收光谱。并分别采用文献[12]三氯化铁法和文献[13]三氯化铁-铁氰化钾法验证是否有多酚类物质存在，同时采用文献[12]茚三酮法和文献[14]双缩脲反应法验证是否有蛋白类物质存在。

1.3.3 混浊成因及其主要影响因素分析

分别采用pH 3.7缓冲液配制成的30 mg/L单宁酸和5～125 mg/L明胶原液建立蛋白质-多酚模拟体系[15-16]，将不同质量浓度的明胶原液分别和单宁酸原液混合后，在旋涡混合器上混合1 min，在25 ℃水浴中保温30 min，在ET93810台式浊度仪上测定其浊度，每一样品平行测定3 次，取平均值。同时取一定量的45°灵芝酒样代替上述单宁酸原液，然后，在该酒液中逐渐增加蛋白质的量（明胶质量浓度0～125 mg/L），考察其浊度的变化。

1.3.4 除浊条件选择

1.3.4.1 单因素试验

对不同酒度的酒样，设置单因素试验依次考察玉米面用量（1～8 g/100 mL）、搅拌时间（15～120 min）和静置时间（3～36 h）对澄清效果的影响，并按1.3.4.3节考察指标方法测定其透光率。当考察其中单一因素时，固定其他因素条件不变。

1.3.4.2 正交试验

将玉米面用量、搅拌时间、静置时间作为考察因素，以700 nm波长处透光率为考察指标，每一酒度的每一因素设计为如表1所示的3 个水平，应用L9（33）正交试验表进行试验。

表 1 灵芝酒正交试验因素水平表

Table 1 Factors and levels used in orthogonal array designs for clarification of glossy ganoderma wines with different alcohol contents

1.3.4.3 指标的测定

吸光度的测定：在UV-2550双光束紫外光谱仪上，以乙醇溶液做参比，测定酒样在450 nm和700 nm波长处的吸光度A450 nm和A700 nm；总酸含量测定：按GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[17]进行；总酯含量测定：按GB/T 27588—2011《露酒》[18]进行；总糖含量测定：按GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[17]进行；总酚含量测定：采用Folin-Ciocalteu比色法。

1,1-二苯基苦基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除率测定：按照文献[19]方法进行。

1.3.5 除浊方法

取一定量酒度分别为28°、38°、45°、53°的待除浊酒样，加入质量浓度为2～4 g/100 mL的玉米面，搅拌15～45 min，静置24 h，然后用0.45 µm砂棒过滤器过滤即可。

2 结果与分析

2.1 致浊物分析

2.1.1 致浊物红外光谱

红外光谱是由于分子振动能级（同时伴随转动能级）跃迁而产生的，根据红外光谱图的吸收峰可以确定化合物的官能团，不同酒度灵芝酒的红外吸收光谱图吸收峰基本一致，只是强度不同，本研究以45°灵芝酒的红外吸收光谱图为代表，结果如图1所示。

图 1 灵芝酒沉淀的红外光谱图

Fig.1 Infrared spectrum of the sediment from glossy ganoderma wine

由图1可见，3 447 cm－1（ν(OH)）、3 030 cm－1（ν(＝C—H)）、1 558 cm－1（ν(C＝C)）、1 457 cm－1（ν(C＝C)）、1 371 cm－1（ν(C—O)）的吸收表明沉淀中可能有酚类化合物，1 654 cm－1（ν(C＝O)）、1 558 cm－1
（δ(N—H)）、1 066 cm－1（ν(C—O)）处的吸收表明沉淀中可能有蛋白质，2 922 cm－1（νas(CH)）、 2 852 cm－1
（νs(CH)）、1 730 cm－1（ν(C＝O)）、1 457 cm－1（δs(CH)）、1 279 cm－1（ν(C—O—C)）处的吸收表明沉淀中还混有高级脂肪酸酯类化合物。

2.1.2 致浊物中多酚类物质的分析

三氯化铁法实验结果呈现墨绿色，表明致浊物可能含有多酚类物质。而三氯化铁-铁氰化钾法实验结果呈现明显的蓝色斑点，证明致浊物确实含有多酚类物质，得到与红外吸收光谱相吻合的结果。

2.1.3 致浊物中蛋白类物质的分析

茚三酮法实验结果呈现紫红色斑点，表明致浊物含有氨基酸或蛋白质，这是由于除脯氨酸、羟脯氨酸与茚三酮反应生成黄色物质外，所有的α-氨基酸及一切蛋白质都能和茚三酮反应生成紫红色物质[20]。双缩脲反应法有紫红色出现，这是由于蛋白质在碱性环境下与硫酸铜生成紫红色络合物[21]，进一步证明致浊物含有蛋白质，得到与红外吸收光谱相吻合的结果。

综上所述，致浊物主要为酚类化合物和蛋白质，另外还混有少量高级脂肪酸酯类化合物。

2.2 致浊成因

经红外光谱测定和多酚类物质、蛋白类物质的化学分析，证实其沉淀物主要是蛋白质和多酚类化合物以及高级脂肪酸酯。已有研究[22-25]也表明富含脯氨酸的醇溶性蛋白和多酚类化合物的活性质点相互作用易形成大分子聚合物，造成酒体混浊。但是，这一过程属于化学变化，是由于富含脯氨酸的醇溶性蛋白，不能提供
与—CO—形成氢键的质子，故不能形成在水溶液中稳定存在的均匀水化膜，而是形成易与多酚类化合物结合的活性中心而沉淀。另外，按1.3.3节混浊成因及其主要影响因素分析还发现，蛋白与多酚的比例对酒体混浊的形成具有重要影响，其结果见图2。

图 2 不同质量浓度明胶与单宁酸体系的浊度

Fig.2 Turbidity produced at different mass concentrations of gelatin in the presence of 30 mg/L tannic acid

由图2可知，在pH 3.7的蛋白质-多酚模拟体系中，在单宁酸质量浓度（30 mg/L）一定条件下，随明胶质量浓度的不断增加，浊度值呈先升高后降低的趋势，在明胶质量浓度为75 mg/L时，即明胶与单宁酸质量浓度比为2.5∶1，浊度最大。这是由于在此比例时，蛋白质和多酚总的结合位点大体相同，此时形成的蛋白质-多酚聚合物的量是最大的[26]，即蛋白质和多酚以一定的化学计量比存在时，浊度最大，最易沉淀，两者比例失调时，浊度下降，沉淀减少。同时以45°灵芝酒代替单宁酸原液，在酒体中逐渐增加蛋白质的量（明胶质量浓度0～125 mg/L），并测定其浊度，结果如图3所示。

图 3 酒体中不同明胶质量浓度溶液的浊度

Fig.3 Turbidity of wines with different mass concentrations of gelatin

由图3可知，随酒体中蛋白质量浓度的不断增加，浊度呈先升高后降低的趋势，在明胶质量浓度为25 mg/L时，浊度最大，最易沉淀，此时蛋白质与酒体中多酚总的结合位点大体相同，充分表明在该条件下，酒体中蛋白质与多酚质量浓度不同，但量比关系相同时两种物质可导致酒体产生混浊。另外，高级脂肪酸酯在低温和降低酒度的情况下易于析出，同样可造成酒体混浊，该过程属于物理变化。

2.3 除浊方法的建立

2.3.1 澄清剂的选择

致浊物及成因分析表明，多酚类化合物与蛋白按化学计量比存在时最易沉淀，两者比例失调时沉淀量明显减少。在此基础上，试图选择一种在体系中对带负电的蛋白质吸附强于带正电的多酚类化合物的澄清剂，以便既能打破体系中蛋白与多酚类化合物存在的化学计量比，有效地制约灵芝酒致浊过程的发生，同时也减少了由于多酚类化合物去除而发生的颜色减褪和抗氧化活性降低的负面影响。为此，对常用的7 种澄清剂进行了实验。并根据灵芝酒紫外吸收光谱图（图4），以450 nm波长处吸光度考察褪色情况，以700 nm波长处吸光度考察致浊情况，其结果见表2。

图 4 灵芝酒的紫外吸收光谱图

Fig.4 UV absorption spectrum of glossy ganoderma wine

从表2可知，经不同澄清剂处理后的灵芝酒与原酒相比，在450 nm和700 nm波长处的吸光度均有所减小，表明色度有所降低，透明程度升高。但对上述七种澄清剂实验结果进行比较，玉米面处理后的灵芝酒在450 nm波长处的吸光度最大，表明多酚类物质损失最少，色度减少最小，并且在700 nm波长处的吸光度最小，表明透明程度最好，且透光率均在97%以上。所以使用玉米面做澄清剂，既能最大程度地保持原酒色度（即多酚的抗氧化活性），又能达到较好的澄清效果。其不但可有效地提高灵芝酒的品质，而且无毒、无害、还含有人体正常生命活动不可缺少的多种必需微量元素[27]，另外，成本低、易于工业化生产也是其一大优点。

2.3.2 除浊工艺条件的选择

2.3.2.1 玉米面用量对澄清效果的影响

对每一酒度的酒，取样8份，每份100 mL，分别加入质量浓度为1、2、3、4、5、6、7、8 g/100 mL的玉米面，搅拌1 h，静置24 h，然后用0.45 µm滤膜过滤，测定其透光率，结果如图5所示。

图 5 玉米面用量对澄清效果的影响

Fig.5 Effect of corn flour concentration on clarification efficiency

由图5可知，随着玉米面用量的增加，不同酒度灵芝酒的透光率均呈先增加后趋于稳定的趋势，所以，28°、38°、45°、53°灵芝酒的最佳玉米面用量分别为2、3、3、4 g/100 mL。

2.3.2.2 搅拌时间对澄清效果的影响

在确定玉米面用量的基础上，搅拌时间分别设定为15、30、45、60、90、120 min，静置24 h，然后用0.45 µm滤膜过滤，测定其透光率，结果如图6所示。

图 6 搅拌时间对澄清效果的影响

Fig.6 Effect of stirring time on clarification efficiency

由图6可知，随着搅拌时间的延长，不同酒度灵芝酒的透光率均呈先增加后不变的趋势，所以，28°、38°、45°、53°灵芝酒的最佳搅拌时间分别为15、30、30、45 min。

2.3.2.3 静置时间对澄清效果的影响

在确定了玉米面用量和搅拌时间的基础上，分别静置3、6、9、12、15、18、21、24、36 h，然后用0.45 µm滤膜过滤，测定其透光率，结果如图7所示。

图 7 静置时间对澄清效果的影响

Fig.7 Effect of standing time on clarification efficiency

由图7可知，随着静置时间的延长，不同酒度灵芝酒的透光率逐渐增加，当静置时间达到21 h后，透光率达到了最大，随后趋于稳定。所以最佳静置时间选为21 h。

2.3.2.4 正交试验

在单因素试验的基础上，按1.3.4.2节正交试验法对除浊工艺条件做了进一步的选择。其结果如表3和表4所示。

表 3 不同酒度灵芝酒的正交试验设计及结果

Table 3 Orthogonal array designs and results for clarification of
glossy ganoderma wines with different alcohol contents

表 4 正交试验对灵芝酒透光率影响的极差分析

Table 4 Range analysis for transmittance of clarified glossy ganoderma wines

从表4可以看出，在所选的因素水平范围内，各因素对不同酒度灵芝酒的透光率影响大小顺序为A＞B＞C，最优组合为A2B2C3，即：去除28°、38°、45°、53°灵芝酒沉淀的新工艺，其澄清剂用量分别为2、3、3、4 g/100 mL，搅拌时间分别为15、30、30、45 min，静置时间为24 h。

2.3.3 产品除浊效果

将不同酒度的灵芝酒在最优除浊工艺条件下处理后，每隔3 个月在700 nm波长处测定一次透光率，每次平行测定3 次，取平均值，直到12 个月，其透光率的变化见表5。

表 5 不同酒度的灵芝酒透光率随时间的变化

Table 5 Change in transmittance of clarified glossy ganoderma wine as a function of storage time

从表5可知，处理后的不同酒度的灵芝酒，在放置12 个月后，产品仍然清澈透明，透光率均在97%以上。

2.3.4 产品质量

测定经过最优除浊工艺处理前后的灵芝酒的总酸、总酯、总糖、总酚含量以及对DPPH自由基清除率及最大吸收波长450 nm处吸光度A450 nm的变化，结果见表6。

表 6 处理前后不同酒度灵芝酒指标的变化

Table 6 Changes in physicochemical parameters of glossy ganoderma wine before and after turbidity removal

从表6可知，处理后的不同酒度的灵芝酒，总酸、总酯、总糖含量均符合GB/T 27588—2011[18]的要求，且总酚含量、DPPH自由基清除率、A450 nm变化很小，表明灵芝酒除浊处理后保留了原酒的抗氧化性，得出了与DPPH自由基清除率一致的结果，并最大程度地保留了原酒色度。

3 结 论

醇溶性蛋白和多酚类化合物以一定的化学计量比相互作用形成聚合物是引起灵芝酒混浊的主要原因，并且经实验证实，多酚类化合物与蛋白按化学计量比存在时最易沉淀，两者比例失调时沉淀量明显减少。通过单因素和正交试验，本研究利用高碳水化合物对蛋白质吸附较强于多酚类化合物的特性，采用含高碳水化合物的玉米面为澄清剂，建立了分别去除28°、38°、45°、53°灵芝酒沉淀的新工艺，其澄清剂用量分别为2、3、3、4 g/100 mL，搅拌时间分别为15、30、30、45 min，静置时间为24 h。经最优工艺处理后的灵芝酒，总酸、总酯、总糖含量均符合GB/T 27588—2011要求，且总酚含量变化较小，保留了原酒的色度和抗氧化性，能达到澄清效果。

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