响应面法优化红蚂蚁抗菌物质提取工艺

陈海燕1，冯 印1，杨 柳1 ，尤丽新1，陈晓平2,*

（1.长春科技学院生物食品学院，吉林 长春 130600；2.吉林农业大学食品科学与工程学院，吉林 长春 130118）

摘 要：以长白山野生红蚂蚁为原料，提取红蚂蚁体内有效抗菌活性物质并进行抑菌效果评价。通过单因素试验和响应面分析法研究乙醇体积分数、料液比、离心转速对红蚂蚁提取物抑制大肠杆菌的影响，结果表明：最佳浸提条件为乙醇体积分数63%、料液比1∶26（g/mL）、离心转速7 230 r/min，对大肠杆菌抑菌圈直径为2.59 cm。

关键词：响应面法；红蚂蚁；抗菌物质

Optimization of Extraction of Antibacterial Compounds from Red Ants with Response Surface Methodology

CHEN Hai-yan1, FENG Yin1, YANG Liu1, YOU Li-xin1, CHEN Xiao-ping2,*

(1. College of Biotechnology and Food Science, Changchun University of Science and Technology, Changchun 130600, China;

2. College of Food Science and Engineering, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China)

Abstract: Antibacterial compounds were extracted from wild red ants from the Changbai Mountains and their antibacterial activity was evaluated. The anti-E. coli activity as a function of ethanol concentration, solid-to-solvent ratio and centrifugal speed was investigated using response surface methodology. The diameter of the inhibition zone against E. coli was 2.59 cm under the optimal extraction conditions: 63% aqueous ethanol, a solid-to-solvent ratio of 1:26 (g/mL) and centrifugation at a speed of 7 230 r/min.

Key words: response surface methodology; red ant; antimicrobial compounds

中图分类号：TS201.3 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）22-0073-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201422014

蚂蚁具有较高的药用价值，具有明显的抗炎、护肝、平喘、镇痛功效，并具有一定的抗癌作用。此外，蚂蚁体内还含有一类特殊的物质，因其对细菌、真菌等的生长具有明显的抑制作用，被称为“蚂蚁抗生素”[1-4]。

蚂蚁体内含有大量的蛋白质、氨基酸、维生素及微量元素[5]等，研究发现，蚂蚁可分泌具有抗菌活性物质，以此抵御环境微生物侵袭[6-7]。目前已报道蚂蚁中抗菌物质主要有多糖或聚合糖类、抗菌肽、激素及代谢后的小分子物质并具有潜在的药用价值。长白山红蚂蚁自身活性物质不仅具有镇静、止咳、平喘、消炎等效果，对真菌及金黄色葡萄球菌具有抑制作用，因此长白山红蚂蚁具有“天然抗生素”之称[8-10]。

本研究以长白山野生红蚂蚁为原料，采用乙醇浸提法对红蚂蚁体内抗菌物质进行粗提取。以抑菌圈直径为衡量指标，通过单因素试验和响应面分析法研究乙醇体积分数、料液比、离心转速对红蚂蚁抑菌物质提取效果的影响，以其获得最佳提取工艺参数，为红蚂蚁开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

长白山野生红蚂蚁由吉林农业大学食品工程教研室提供。大肠杆菌（Escherichia coli）为长春科技学院生物化学实验室保藏菌种。

LB液体培养基：酵母膏5 g，蛋白胨10 g，NaCl 10 g，1 mol/L NaOH溶液调pH 7.2，补双蒸水至1 L。

乙醇 北京化工厂；蛋白胨（BR）、酵母浸粉（BR） 北京奥博星生物技术有限责任公司；琼脂粉（BR） 天津市致远化学试剂有限公司；氯化钠（AR） 天津市科密欧化学试剂有限责任公司。

1.2 仪器与设备

HD-1360超净工作台 北京东联哈尔仪器制造有限公司；SPX-250B-Z型生化培养箱 上海江莱生物科技有限公司；RE-52A旋转蒸发器 上海嘉鹏科技有限公司；
SHZ-D型循环水真空泵 郑州科达机械仪器设备有限公司；LG10-2.4A型高速离心机 北京医用离心机厂；FA1004A电子天平 常州科源电子仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 材料预处理

取红蚂蚁100 g，用蒸馏水漂洗干净，放在托盘内摊平。将托盘放入烘箱，在40 ℃条件下烘干12 h以上，直至其质量恒定，然后用组织粉碎机进行粉碎，过60 目筛得红蚂蚁粉，备用。

1.3.2 乙醇法提取红蚂蚁抗菌物质的单因素试验

分别以乙醇体积分数、料液比和离心转速作为变量因素，其他影响因素条件不变，对红蚂蚁抗菌物质进行粗提取，分析不同变量因素对提取率的影响，以确定各因素水平的最佳值。

1.3.2.1 乙醇体积分数对红蚂蚁抗菌物质提取效果的影响

准确称取25 g红蚂蚁粉，平均分为5份，按料液比1∶20（g/mL）分别加入体积分数为40%、50%、60%、70%、80%的乙醇溶液各100 mL，用电动匀浆机进行匀浆，置于4 ℃冰箱浸提24 h。然后分别放入高速冷冻离心机中，离心20 min（4 ℃，8 000 r/min）。取上清液，用旋转蒸发仪在40 ℃条件下挥去溶剂乙醇，然后置于冷冻干燥机中进行冷冻干燥，所得物质即为红蚂蚁乙醇提取物。分别溶于10 mL无菌蒸馏水，以大肠杆菌为受抑菌做抑菌实验[8]，观察不同乙醇体积分数条件下提取的红蚂蚁抗菌物质抑菌圈直径大小。

1.3.2.2 料液比对红蚂蚁抗菌物质提取效果的影响

准确称取25 g红蚂蚁粉，平均分为5份，分别按料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g/mL）加入60%乙醇溶液，用电动匀浆机进行匀浆，置于4 ℃冰箱浸提24 h。然后分别放入高速冷冻离心机中，离心20 min（4 ℃，
8 000 r/min）。方法同1.3.2.1节。试验重复3 次，求平均值。

1.3.2.3 离心转速对红蚂蚁抗菌物质提取效果的影响

准确称取25 g红蚂蚁粉，平均分为5份，在料液比1∶20（g/mL）条件下加入体积分数为60%的乙醇溶液各100 mL，置于电动匀浆机中进行匀浆，在4 ℃冰箱浸提24 h。放入高速冷冻离心机，在4 ℃条件下分别以转速6 000、7 000、8 000、9 000、10 000 r/min离心20 min。方法同1.3.2.1节。试验重复3 次，求平均值。

1.3.3 琼脂孔穴扩散法测定抑菌效果

采用琼脂空穴扩散法[11-12]，首先将菌种进行活化处理，将大肠杆菌接种至LB液体培养基，振荡使菌种均匀散布于培养基中，将其置于37 ℃培养箱内培养48 h，活化2～3 次。将加热融化的LB固体培养基15 mL注入到平皿中，待凝固后，吸取103 CFU/mL的受试菌液100µL加入平皿，涂布均匀，在培养基上打直径为6 mm的圆孔。用移液枪吸取40 µL抗菌物质粗提液加入孔洞，并做阴性、阳性对照。阴性对照组加入40 µL无菌蒸馏水，阳性对照组加入40 µL 100 µg/mL的氨苄青霉素溶液。将培养基平皿在37 ℃环境下培养24 h。观察红蚂蚁抗菌物质粗提液对大肠杆菌有无抑菌效果，并测量抑菌圈直径。

1.3.4 响应面法优化红蚂蚁抗菌物质提取条件

通过单因素试验得到每个因素水平的3 个最优数据，以Design-Expert软件要求的Box-Behnken试验设计三因素三水平优化试验[13-16]。采用大肠杆菌为受抑菌，测量不同提取条件下红蚂蚁抗菌物质粗提物的抑菌圈直径。试验重复3 次，计算平均值。设计方案见表1。

表 1 响应面试验因素水平表

Table 1 Factors and levels used in response surface analysis

2 结果与分析

2.1 乙醇体积分数对红蚂蚁抗菌物质提取的影响

图 1 乙醇体积分数对红蚂蚁抗菌物质提取的影响

Fig.1 Effect of ethanol concentration on the extraction efficiency of antimicrobial compounds

由图1可知，在料液比1∶20、离心转速8 000 r/min的条件下，随着乙醇体积分数的增大，所提取红蚂蚁抗菌物质抑菌圈直径先增大后减小。当以60%乙醇进行提取时，所提取抗菌物质抑菌圈直径为2.04 cm，提取效果最佳。已有研究[17-18]发现红蚂蚁中所含抗菌物质主要为肽类，其他研究[19-21,23]中利用此方法提取时，提取物的菌圈直径略小。

2.2 料液比对红蚂蚁抗菌物质提取的影响

图 2 料液比对红蚂蚁抗菌物质提取的影响

Fig.2 Effect of material-to-liquid ratio on the extraction efficiency of antimicrobial compounds

由图2可知，在乙醇体积分数60%、离心转速
8 000 r/min的条件下，随着溶剂用量增大，抑菌圈直径表现为逐渐增大并趋于平稳的趋势。当料液比为1∶25时，抑菌圈直径达到最大值，为2.48cm。徐立等[22]研究的提取液经干燥成粉状，主要针对抗炎镇痛等临床效果，忽略了抗菌效果研究。

2.3 离心转速对红蚂蚁抗菌物质提取的影响

图 3 离心转速对红蚂蚁抗菌物质提取的影响

Fig.3 Effect of centrifugal speed on the extraction efficiency of antimicrobial compounds

由图3可知，在乙醇体积分数60%、料液比1∶20的条件下，随着离心转速的增大，抑菌圈直径表现为先增大后减小的趋势。当离心转速为7 000 r/min时，抑菌圈直径达到最大值，为2.18 cm。

2.4 琼脂孔穴扩散法测定抑菌效果

1.阳性对照；2.阴性对照；3、4.红蚂蚁抑菌成分提取液。

图 4 红蚂蚁抑菌成分对大肠杆菌的抑菌效果

Fig.4 Antibacterial effect of red ant extracts

长白山野生红蚂蚁抑菌物质对大肠杆菌的抑菌效果如图4所示，1号孔阳性对照即100 µg/mL氨苄青霉素溶液对大肠杆菌的抑菌圈直径为2.48 cm，抑菌效果很好，2号孔阴性对照即蒸馏水对大肠杆菌无抑菌效果，3、4号孔红蚂蚁抑菌成分提取液对大肠杆菌的抑菌圈平均直径为2.59 cm。通过阴性及阳性对照，可知红蚂蚁抑菌成分提取液对大肠杆菌的抑菌效果很好，其有效抗菌成分可与中成药复配治疗男性性功能疾病[24-26]。

2.5 响应面试验优化

2.5.1 响应面试验结果

表 2 响应面试验方案及结果

Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

由表2可知，不同提取条件下得到的红蚂蚁抗菌物质粗提物的抑菌圈直径范围为1.67～2.55 cm，显然抗菌物质的提取受不同条件影响较大[24]。故采用响应面法对红蚂蚁抗菌物质的提取条件进行优化是可行的。

2.5.2 模型的建立与方差分析

对响应面法优化试验结果建立二次模型及进行方差分析，结果见表3。

表 3 响应面二次模型方差分析

Table 3 Analysis of variance for the response surface quadratic model

注：*.差异显著（P＜0.05）；**.差异极显著（P＜0.000 1）。

由表3可知，该二次方程模型P＜0.000 1，达到极显著影响水平。乙醇体积分数一次项（A）、料液比一次项（B）、离心转速一次项（C）以及乙醇体积分数二次项（A2）、料液比二次项（B2）、离心转速二次项（C2）P值均小于0.000 1，对抑菌圈直径的大小有极显著影响，乙醇体积分数和料液比的交互项（AB）、料液比和离心转速的交互项（BC）P值在0.0001～0.05，达到显著影响水平。而乙醇体积分数和离心转速的交互项（AC）则对抑菌圈直径大小的影响不显著。

模型F值为881.14，P＜0.000 1，说明该二次多项模型显著性良好；失拟分析表明，失拟项的P值为0.062 5，设计模型的失拟度不显著，因而该模型的拟合程度比较好。响应面二次方程模型的相关系数为拟合度R2=0.999 1，说明模型与数据拟合度较好；校正拟合度R2Adj=0.998 0，预测拟合度R2Pred=0.985 9。其中R2Pred=0.985 9与R2Adj=0.998 0在一致性上是合理的。

根据Box-Behnken试验设计原理，利用Design-Expert软件，得到关于抑菌圈直径的二次多项回归方程为：Y=2.55＋0.17A＋0.18B＋0.11C＋0.055AB－0.012AC－0.045BC－0.29A2－0.29B2－0.21C2。

2.5.3 各因素对红蚂蚁抗菌物质提取的影响

图 5 乙醇体积分数与料液比对提取红蚂蚁抗菌物质影响的
响应面和等高线图

Fig.5 Response surface and contour plots showing the effect of the effect of ethanol concentration and material-to-liquid ratio on the extraction efficiency of antimicrobial compounds

由图5可知，在离心转速7 000 r/min的条件下，响应面图中影响因素乙醇体积分数和料液比的曲面均较陡，说明乙醇体积分数和料液比对所提取的红蚂蚁抗菌物质的抑菌圈直径大小均有极显著影响，呈二次关系。当乙醇体积分数为55%～60%，接近60%，料液比1∶22.5～1∶25，更加接近1∶25时，抑菌圈直径为最大值。而随着乙醇体积分数和溶剂用量的增大，抑菌圈直径逐渐减小。此外在等高线图中等高线趋于椭圆形，乙醇体积分数和料液比的交互项对抑菌圈大小具有显著影响。

图 6 乙醇体积分数与离心转速对提取红蚂蚁抗菌物质影响的
响应面和等高线图

Fig.6 Response surface and contour plots showing the effect of ethanol concentration and centrifugal speed on the extraction efficiency of antimicrobial compounds

由图6可知，在料液比1∶25的条件下，乙醇体积分数和离心转速的曲面均较陡，说明乙醇体积分数和离心转速对所提取的红蚂蚁抗菌物质的抑菌圈直径大小均有极显著影响，呈二次关系。当乙醇体积分数为55%～60%，接近60%，离心转速6 500～7 000 r/min，更加接近
7 000 r/min时，抑菌圈的直径达到最大。随着乙醇体积分数和离心转速的增加，抑菌圈直径却逐渐减小。此外在等高线图中等高线实际趋于圆形，乙醇体积分数和离心转速的交互项对抑菌圈大小的影响不显著。

图 7 料液比与离心转速对提取红蚂蚁抗菌物质影响的响应面和等高线图

Fig.7 Response surface and contour plots showing the effect of material-to-liquid ratio and centrifugal speed on the extraction efficiency of antimicrobial compounds

由图7可知，在乙醇体积分数60%的条件下，响应面图中影响因素料液比和离心转速的曲面均较陡，说明料液比和离心转速对所提取的红蚂蚁抗菌物质的抑菌圈直径大小均有极显著影响，呈二次关系。当料液比为1∶22.5～1∶25，接近1∶25，离心转速为6 500～
7 000 r/min，更接近7 000 r/min时，抑菌圈直径达到最大值。而随着溶剂用量和离心转速的继续增大，抑菌圈直径逐渐减小。此外在等高线图中等高线趋于椭圆形，料液比和离心转速的交互项对抑菌圈直径大小具有显著影响。

2.6 乙醇浸提法提取红蚂蚁抗菌物质的最佳工艺条件

通过Design-Expert软件求解关于抑菌圈直径的二次多项回归方程，得到红蚂蚁抗菌物质的最佳提取条件为乙醇体积分数63.15%、料液比1∶26.67（g/mL）、离心转速7 229.5 r/min，在此条件下的抑菌圈直径理论值为2.62 cm。鉴于实验的可行性，采用修正后的提取条件，即乙醇体积分数63%、料液比1∶26（g/mL）、离心转速7 230 r/min。进行3 次验证实验，求平均值，得到抑菌圈直径为2.59 cm，与理论值的相对误差为1.16%，说明该二次多项回归方程与实际情况吻合，采用响应面法优化红蚂蚁抗菌物质的提取条件是可行的。

3 结 论

本实验主要研究长白山红蚂蚁抗菌活性物质的提取并通过抑菌实验表明此类抗菌物质对大肠杆菌具有良好的抑制效果。通过单因素试验和响应面法优化试验，确定了红蚂蚁抗菌物质的最佳提取条件。并有待于进一步尝试其对金黄色葡萄球菌、肠炎沙门氏菌、枯草芽孢杆菌等在食品加工贮藏中常见的有害菌进行系统抗菌研究。并针对长白山野生红蚂蚁中抗菌活性物质的成分分析进一步细化研究，因此长白山野生红蚂蚁具有良好的应用前景。

通过对响应面优化试验结果进行分析，采用乙醇浸提法从红蚂蚁中提取抗菌物质的最佳工艺条件为乙醇体积分数63%、料液比1∶26（g/mL）、离心转速7 230 r/min。优化条件下，长白山红蚂蚁乙醇浸提液对大肠杆菌抑菌圈直径为2.59 cm。

参考文献：

[1] ZELEZETSKY I, PAG U, ANTCHEVA N, et al. Identification and optimization of an antimicrobial peptide from the ant venom toxin pilosulin[J]. Archives of Biochemistry and Biophysics, 2005, 434(2): 358-364.

[2] LEULIER F, LEMAITRE B. Toll-like receptors-taking an evolutionary approach[J]. Nat Rev Genet, 2008, 9(3): 165-178.

[3] 苏祥, 崔敬爱, 陈晓平. 蚂蚁抗菌肽的分离纯化及其活性[J]. 食品科学, 2013, 34(9): 70-73.

[4] 宋政伟. 长白山红蚁及九香虫抗菌活性化合物的研究[D]. 洛阳: 河南科技大学, 2005: 50-55.

[5] PAN J Z, HINK W F. Isolation and characterization of myrmexins, six isoforms of venom proteins with anti-inflammatory activity from the tropical ant[J]. Pseudomymex Triplarinus Toxicon, 2000, 38: 1403-1413.

[6] 胡耀辉, 刘萍, 张培因. 长白山红蚁微量生物活性物质分析[J]. 农业工程学报, 1997, 13(2): 240-243.

[7] 孙吉红, 丛褔君, 张凤春. 长白山红蚁及利用[J]. 中国林副特产, 1994, 28(5): 45-46.

[8] CHEN Junhui, WANG Shaobin, CHEN Dongyang, et al. The inhibitory effect of oridonin on the growth of fifteen human cancer cell lines[J]. Chinese Journal of Clinical Oncology, 2007, 4(1): 16-20.

[9] 孙恩涛, 秦志辉. 昆虫抗菌肽研究进展[J]. 热带病与寄生虫学, 2006, 1(4): 47-48.

[10] 唐觉. 中国昆虫杂志: 第47分册[M]. 北京: 科学出版社, 1995: 1-131.

[11] 陈晓鸣, 冯颖. 资源昆虫学概论[M]. 北京: 科学出版社, 2009: 4.

[12] 吴志成, 吴斌. 鼎突多刺蚁治疗慢性病展望[J]. 生物学通报, 1995(5): 3-6.

[13] 杨文雄, 高彦祥. 响应面法及其在食品工业中的应用[J]. 中国食品添加剂, 2005(2): 68-71.

[14] 李亚娜, 林永成, 佘志刚. 响应面分析法优化羊栖菜多糖的提取工艺[J]. 华南理工大学学报: 自然科学版, 2004, 32(11): 29-31.

[15] 刘洋, 赵谋明, 杨宁. 响应面分析法优化仙人掌多糖提取工艺的研究[J]. 食品与机械, 2006, 22(6): 42-45.

[16] 王永菲, 王成国. 响应面法的理论与应用[J]. 中央民族大学学报: 自然科学版, 2005, 14(3): 236-239.

[17] 郭娜, 肖向红, 徐义刚, 等. 东北林蛙皮肤抗菌肽dybowskin-1ST的表达、纯化及抑菌活性分析[J]. 中国农业科学, 2011, 44(15): 3246-3251.

[18] HAN Jiangwei, JIANG Xingming, ZHANG Lida. Optimisation of extraction conditions for polysaccharides from the roots of Isatis tinctoria L. by response surface methodology and their in vitro free radicals scavenging activities and effects on IL-4 and IFN-γ mRNA expression in chicken lymphocytes[J]. Carbohydrate Polymers, 2011, 86(3): 1320-1326.

[19] 徐定华, 朱文学. 响应面分析法优化怀地黄中梓醇提取工艺[J]. 食品科学, 2011, 32(16): 62-66.

[20] 许子竞, 黎贵卿, 黄丽, 等. 响应面法优化微波辅助提取滇桂艾纳香多糖工艺研究[J]. 食品工业科技, 2010, 31(1): 220-223.

[21] 丁大勇, 马舒伟. 蚂蚁成分及药理研究的进展[J]. 黑龙江医药, 2005, 5(18): 330-331.

[22] 徐立, 方泰惠, 许慧琴, 等. 血红林蚂蚁粉抗炎、镇痛作用的实验研究[J]. 南京中医药大学学报, 1997, 13(4): 213-215.

[23] 邹梅, 孙兰, 王伟. 纯蚂蚁粉胶囊对小鼠免疫功能的影响[J]. 卫生毒理学杂志, 2004, 18(1): 63-64.

[24] 王信锁. 一种治疗阳痿的中成药: 中国, CN 101028369A[P]. 2007-09-05.

[25] 刘湘, 汪秋安. 天然产物化学[M]. 北京: 化学工业出版社, 2005: 10-30.

[26] PATRA A, MUKHOPADHYAY A. Carbon-13NMR signals of some phenothiazine derivatives[J]. Indian Journal of Chemistry(Sec-B), 1979, 17: 638.