几种醇对Lipozyme RM IM催化卵磷脂乙醇解的影响及其工艺条件优化

马娇娜，杨国龙*，陈素琴，毕艳兰，刘 伟

（河南工业大学粮油食品学院，河南 郑州 450001）

摘 要：研究脂肪酶Lipozyme RM IM催化大豆卵磷脂（phosphatidylcholine，PC）乙醇解反应制备溶血卵磷脂（lysophosphatidylcholine，LPC）过程中其他几种醇对PC乙醇解的影响，并对乙醇解条件进行了优化。发现正丁醇对PC乙醇解无明显影响，叔丁醇对PC乙醇解有一定的抑制作用，1,2-丙二醇和丙三醇呈现较好的促进作用。最后选用丙三醇作为乙醇解的促进剂，通过响应面分析法确定了无溶剂体系中Lipozyme RM IM催化PC醇解的最佳工艺条件为加酶量15%（以PC质量计，m/m）、反应温度28 ℃、加水量8%（水/乙醇溶液，V/V）、丙三醇10% （丙三醇/乙醇溶液，V/V）、底物质量浓度1.49 g/mL（PC/乙醇溶液，m/V）、反应时间11h，此条件下 LPC转化率高达98.2%。实验证明，丙三醇对无溶剂体系中Lipozyme RM IM催化条件下的PC乙醇解反应有很好的促进作用。

关键词：卵磷脂；Lipozyme RM IM；乙醇解；溶血卵磷脂

Effect of Other Alcohols on Lipozyme RM IM-Catalyzed Ethanolysis of Phosphatidylcholine and
Optimization of the Ethanolysis Process

MA Jiao-na, YANG Guo-long*, CHEN Su-qin, BI Yan-lan, LIU Wei

(School of Food Science and Technology, Henan University of Technology, Zhengzhou 450001, China)

Abstract: The effects of other alcohols on the Lipozyme RM IM-catalyzed ethanolysis of soy phosphatidylcholine (PC) for the preparation of lysophosphatidylcholine (LPC) were studied and the ethanolysis conditions were optimized. The results showed that n-butanol had no significant synergistic or inhibitory effect on the ethanolysis of PC, while tert-butanol displayed an inhibitory effect, and 1,2-propylene glycol and glycerol exhibited a significant synergistic effect. Glycerol was chosen as the synergistic agent for PC ethanolysis. The optimal conditions for the ethanolysis catalyzed by Lipozyme RM IM in solvent-free system were obtained by response surface methodology as follows: lipase dosage, 15% (based on the mass of PC); temperature, 28 ℃; ratio of water to ethanol solution, 8% (V/V); ratio of glycerol to ethanol solution, 10%
(V/V); substrate concentration, 1.49 g/mL (PC/ethanol solution ratio, m/V), and reaction time, 11 h. Under these conditions, the conversion rate of LPC was 98.2%. Glycerol exhibited a significant synergistic effect on the ethanolysis of PC.

Key words: phosphatidylcholine; Lipozyme RM IM; ethanolysis; lysophosphatidylcholine

中图分类号：TS201.2 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）22-0092-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201422017

由于磷脂亲水亲油平衡值较低，仅适用于做水/油型乳化剂，限制了其在很多行业中的应用，因此国内外很多学者都致力于磷脂的改性研究。其中，酶法改性因其有优于物理改性和化学改性的诸多特点，是国内外磷脂改性研究的热点。溶血磷脂的生产，则是磷脂酶法改性技术的重要应用。溶血磷脂在低pH值、高温、高离子浓度及不同油水比环境下的乳化性和稳定性都远远优于普通磷脂，且因其在生理功能、表面活性和抗菌能力等方面的独特性能，已被广泛用于医药、食品、化妆品和饲料加工等领域[1-2]。

在酶法生产溶血磷脂的研究中，以磷脂酶催化磷脂水解反应居多。本实验采用来源广泛、价格便宜的脂肪酶作为工具酶催化卵磷脂醇解制备溶血卵磷脂。目前酶促醇解反应主要用于甘三酯制备生物柴油的研究[3-8]，而磷脂的醇解反应研究较少，因此有必要对其做深入研究。另有报道表明，脂肪酶在不同醇中的反应活性不同，且不同醇的组合会对酯交换反应产生协同作用[9]。因此，本实验选用醇解法对磷脂进行酶法改性，并研究醇的相互作用对醇解反应的影响，以期寻求最优反应条件，达到提高溶血磷脂产率的目的，为拓展磷脂的应用领域提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大豆卵磷脂（phosphatidylcholine，PC，纯度＞97%） 沈阳天峰生物工程技术有限公司；脂肪酶Lipozyme RM IM 诺维信公司；三氯甲烷、甲醇为色谱纯；无水乙醇、正丁醇、叔丁醇、1,2-丙二醇、丙三醇等试剂均为分析纯，使用前经分子筛脱水处理。

1.2 仪器与设备

MK-6S棒状薄层色谱分析仪 日本三菱公司；BSA224S电子天平（最大称量220 g，感量0.000 1 g） 赛多利斯科学仪器有限公司；DF-101Z集热式恒温加热磁力搅拌器 巩义市京华仪器有限责任公司。

1.3 方法

1.3.1 脂肪酶Lipozyme RM IM催化卵磷脂醇解制备溶血卵磷脂

精确称取一定量的卵磷脂，加入一定体积的醇溶液充分溶解，在恒温磁力搅拌器中稳定20 min后，加入适量脂肪酶，醇解反应开始，定时取样进行检测分析。

1.3.2 PC及其醇解产物的组成分析

采用棒状薄层色谱-氢火焰离子化检测器分析PC及其醇解产物中PC、溶血卵磷脂（lysophosphatidylcholine，LPC）、甘油磷脂酰胆碱（glycerylphosphorylcholine，GPC）及其他物质的相对含量（质量分数）。将PC或醇解产物溶解于三氯甲烷中，配制成质量浓度为10～20 mg/mL的溶液，取1 μL溶液点于薄层色谱棒上，在溶剂体系下展开后在90 ℃红外烘箱中干燥5 min，然后进行检测分析。展开液为：CHCl3-CH3OH-H2O（42∶22∶2.5，V/V）。检测条件：氢气流速100mL/min；空气流速1.5 L/min；扫描速率30 s/棒。

1.3.3 LPC转化率计算

式中：w为质量分数。

1.3.4 响应面优化分析

在研究其他醇对PC乙醇解的影响的单因素试验基础上，找出促进作用较好的醇，对反应条件进行优化。以LPC转化率作为响应值，根据响应面法Box-Behnken试验设计原理，运用Design-Expert 8.0进行响应面优化分析。

2 结果与分析

2.1 无溶剂体系下其他醇对Lipozyme RM IM催化卵磷脂乙醇解的影响

卵磷脂在乙醇中具有极好的溶解性，乙醇作为反应底物的同时，也可为卵磷脂的醇解提供反应体系。无溶剂体系中进行的酶催化反应，产物容易进一步精制纯化。参考前期研究的结果[10]，确定无溶剂体系下酶促卵磷脂乙醇解的反应条件为：加酶量15%（m/m）、反应温度30 ℃、底物质量浓度2 g/mL（PC/醇溶液，m/V），加水量8%（水/醇溶液，V/V）。在卵磷脂乙醇解最优条件的基础上，考察无溶剂体系中其他醇对卵磷脂乙醇解的影响。X醇（正丁醇、叔丁醇、1,2-丙二醇和丙三醇）与乙醇的比例为X醇的体积分数，即其占醇溶液总体积的百分比。

2.1.1 正丁醇对PC乙醇解反应的影响

图 1 正丁醇对PC乙醇解中LPC转化率的影响

Fig.1 Effect of n-butanol on the conversion of LPC during ethanolysis of PC

有研究[11-12]使用正丁醇作为油脂醇解底物，进行酯交换反应。本实验尝试考察了正丁醇对卵磷脂乙醇解反应的影响，发现添加正丁醇体积分数为10%和20%时，乙醇解过程中LPC转化率随时间变化趋势与不添加正丁醇的乙醇解一致（图1），反应于16 h达到平衡，LPC转化率达到92%，正丁醇对卵磷脂乙醇解无影响。Rodrigues等[13]研究无溶剂体系下几种脂肪酶催化甘三酯与短碳链醇的酯交换反应时发现：Lipozyme RM IM在甲醇、乙醇等低分子质量醇中易失活，而在正丁醇中转化率较高。本实验结果与之相异可能是由于底物不同所致，卵磷脂的极性比甘三酯大，在乙醇中溶解性很好，从而减弱了乙醇对脂肪酶的失活效果，同时也削弱了正丁醇的促进作用。且正丁醇与乙醇都为直链结构，虽然其碳链长度较乙醇略有增长，但在最适宜乙醇解条件下其分子动能与传质能力并未受到因分子体积增大带来的抑制作用，底物分子间的结合机率未受到影响，故正丁醇与乙醇间未表现出明显的相互作用。

2.1.2 叔丁醇对PC乙醇解反应的影响

随着醇溶液中叔丁醇比例的增加，醇解反应速率逐渐降低，对反应呈现抑制作用（图2）。近年来，叔丁醇在酶促油脂酯交换制备生物柴油的研究中备受重视[14-15]。由于甲醇、乙醇等短碳链醇在油脂中的溶解性不好而易使酶失活[16]，且甘三酯的醇解反应产物——甘油对酶有毒害作用[17]。叔丁醇因其对甘油的溶解性较好，有助于酶的激活并使固定化脂肪酶稳定性增强，还可用作酶的前处理及再利用时的清洗，而被用作酶促酯交换的反应介质[18-20]。本研究中叔丁醇对卵磷脂乙醇解呈现抑制作用，与甘三酯醇解中叔丁醇所表现出的积极作用相反，可能是因为底物的不同，卵磷脂比甘三酯极性大，对乙醇的溶解性好，且反应过程中无甘油产生，叔丁醇对甘三酯醇解的促进作用在此无法体现。而且，由于叔丁醇的空间结构使得羟基受到位阻的影响，叔丁醇羟基与卵磷脂分子的碰撞机率减少，底物与酶的结合也受到影响。叔丁醇对卵磷脂乙醇解表现出抑制作用。

图 2 叔丁醇对PC乙醇解中LPC转化率的影响

Fig.2 Effect of t-butanol on the conversion of LPC during ethanolysis of PC

2.1.3 1,2-丙二醇对PC乙醇解反应的影响

图 3 1,2-丙二醇对PC乙醇解中LPC转化率的影响

Fig.3 Effect of 1,2-propanediol on the conversion of LPC during ethanolysis of PC

向乙醇溶液中添加体积分数为10%和15%的1,2-丙二醇后，醇解反应速率逐步增加，达到反应平衡所用时间缩短，且产品得率有所提升（图3）。添加20%的丙二醇的醇解反应趋势与15%时差别不大，反应于12h接近平衡，LPC转化率达95%。1,2-丙二醇对卵磷脂乙醇解反应表现出较好的促进作用，可能是因为丙二醇作为二元醇，与卵磷脂都是极性物质，且其极性比乙醇大，对体系中微量水有很好的溶解性和分散性，可能会有效调节水与酶的接触[21]。

2.1.4 丙三醇对PC乙醇解反应的影响

图 4 丙三醇对PC乙醇解中LPC转化率的影响

Fig.4 Effect of glycerol on the conversion of LPC during ethanolysis of PC

向反应体系中加入体积分数为5%和10%的丙三醇后，醇解反应速率明显提升，产品得率显著增加；反应于10h达到平衡，LPC转化率达96%（图4）。许多报道研究[22-26]指出脂肪酶催化甘三酯制备生物柴油时，甘油在油中难溶，易吸附于固定化酶表面而对酶的活性及稳定性产生影响。本实验中丙三醇不仅未表现出抑制作用反而有促进作用，是因为丙三醇能够较好地分散于卵磷脂、乙醇和溶血卵磷脂组成的混合体系中，丙三醇很难与固定化脂肪酶发生强的相互作用从而堵塞固定化酶的多孔性通道。丙三醇也可能会使微量水分保留在脂肪酶周围，有助于激活并稳定固定化脂肪酶[27]。加入20%的丙三醇后，反应速率有所提升，但产品最终得率与加入10%丙三醇时一致，因加入过多的丙三醇，底物已经达到饱和，且其极性对酶有不利影响，丙三醇对反应的促进作用保持稳定。总之，无溶剂体系下丙三醇对Lipozyme RM IM催化的卵磷脂乙醇解有显著的促进作用。

2.2 响应面优化分析

通过对无溶剂体系下其他醇对Lipozyme RM IM催化卵磷脂乙醇解影响的考察，发现1,2-丙二醇和丙三醇对卵磷脂的乙醇解反应有促进作用。综合考虑两者的价格及所需添加比例，选择丙三醇体积分数为10%的乙醇溶液进行响应面优化试验。

表 1 Lipozyme RM IM催化醇解反应试验因素与水平

Table 1 Factors and levels used in the experimental design for Lipozyme RM IM catalyzed ethanolysis of PC

以LPC转化率为响应值，选取对其影响较大的3 个因素变量做三因素三水平响应面试验。固定其他反应条件为：加酶量15%（m/m）、加水量为醇溶液总体积的8%、丙三醇占醇溶液总体积10%。试验因素水平见表1，
响应面试验设计及结果见表2。

各因素经二次多项回归拟合后，得到回归方程：LPC转化率=95.91－1.76A－0.61B＋15.48C＋17.49AB－4.48AC＋1.68BC－10.63A2－10.93B2－7.99C2。

表 2 响应面试验设计及结果

Table 2 Experimental design and results

从表3可知，回归方程极显著。相关系数R2=0.984 2，说明响应值的变化有98.42%来源于所选变量，即反应温度、底物质量浓度和反应时间。因此，回归方程可较好地描述各因素与响应值之间的关系。当P值小于0.05时，表示该因素对响应值变化的影响是显著的。由方差分析表可知，因素C、AB、AC、B2、C2是显著的，表明各试验因素对响应值变化的影响并不是简单的线性关系。

表 3 LPC转化率模型方差分析

Table 3 Analysis of variance for the regression model describing LPC conversion

注：*.差异显著，P＜0.05。

图5～7可直观反应各因素间的交互作用对LPC转化率的影响。通过比较可以发现，反应时间和底物质量浓度的交互作用影响不显著，反应温度和反应时间、反应温度和底物质量浓度的交互作用影响显著。

图 5 反应温度和底物质量浓度交互作用对LPC转化率的影响

Fig.5 Interaction between temperature and substrate concentration on LPC conversion

图 6 反应温度和反应时间交互作用对LPC转化率的影响

Fig.6 Interaction between reaction temperature and time on LPC conversion

图 7 反应时间和底物质量浓度交互作用对LPC转化率的影响

Fig.7 Interaction between reaction time and substrate concentration on LPC conversion

以LPC转化率最大化为目标，运用回归模型分析得到最佳反应条件为：反应温度27.92 ℃、底物质量浓度1.49 g/mL、反应时间10.99 h。在此条件下LPC转化率理论值为98.6%。考虑到实际操作的可能性，将工艺条件确定为：反应温度28 ℃、底物质量浓度1.49 g/mL、反应时间11 h。按此条件进行平行验证实验，得LPC转化率平均值为98.2%，与理论值相差不大。因此，基于响应面分析法得到的优化工艺条件可靠，有一定的实际应用价值。

3 结 论

无溶剂体系下Lipozyme RM IM催化PC乙醇解的过程中，正丁醇对PC乙醇解无明显影响，叔丁醇对PC乙醇解有一定的抑制作用，1,2-丙二醇和丙三醇呈现较好的促进作用。最后选用丙三醇与乙醇进行协同作用，通过响应面优化试验确定了无溶剂体系中Lipozyme RM IM催化PC醇解的最佳工艺条件为加酶量15%（m/m）、反应温度28℃、加水量8%（水/醇溶液，V/V）、丙三醇10%（丙三醇/醇溶液，V/V）、底物质量浓度1.49 g/mL
（PC/醇溶液，m/V）、反应时间11 h，此条件下LPC转化率为98.2%。实验证明，利用丙三醇可以使Lipozyme RM IM催化的卵磷脂乙醇解反应速率明显提升，且产品得率得以显著增加，可为溶血磷脂的生产提供一定参考，但其产生协同作用的具体机理还有待深入研究。

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