胶体金免疫层析法联检食品中5 种典型
沙门氏菌模型的建立和优化

夏诗琪，徐超莲，刘道峰，郭 琦，吴松松，赖卫华*

（南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047）

摘 要：采用胶体金标记抗沙门氏菌单克隆抗体，将沙门氏菌单克隆抗体和驴抗鼠抗体（二抗）喷涂于硝酸纤维膜上分别作为检测线和质控线，研制能联检5 种典型沙门氏菌（甲型副伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、鸭沙门氏菌）的胶体金免疫层析试纸条。结果表明，该试纸条能达到同时检测5 种沙门氏菌的目的，其中甲型副伤寒沙门氏菌的检测灵敏度最高，为105 CFU/mL；鼠伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、肠炎沙门氏菌和鸭沙门氏菌的检测灵敏度为106 CFU/mL。沙门氏菌加入量为10～100 CFU时，增菌16～20 h，该试纸条能够检测出牛奶、鸡蛋样本中的5 种沙门氏菌。本实验研制的试纸条能快速高效地联检食品中5 种典型的沙门氏菌，特异性高、灵敏度好，在对多种沙门氏菌进行联检方面有很重要的应用价值。

关键词：沙门氏菌；胶体金免疫层析试纸条；联检；食品样本

Preparation and Optimization of Colloidal Gold Strip for Simultaneously Detecting Five Typical Salmonella in Foods

XIA Shi-qi, XU Chao-lian, LIU Dao-feng, GUO Qi, WU Song-song, LAI Wei-hua*

(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

Abstract: Colloidal gold immunochromatographic assay was chosen to simultaneously detect five typical Salmonella (Salmonella paratyphi A, Salmonella typhimurium, Salmonella choleraesuis, Salmonella enteritidis and Salmonella anatum) in foods. In this assay, anti-Salmonella monoclonal antibody was labeled with colloidal gold while anti-Salmonella monoclonal antibody and donkey anti-mouse IgG were dispensed onto nitrocellulose membrane as the test line and the control line, respectively. The sensitivity of the developed strip to Salmonella paratyphi A was 105 CFU/mL and to the other four strains was 106 CFU/mL. When food samples (e.g., milk and egg) were inoculated with 10–100 CFU Salmonella and cultured for 16–20 h, positive results appeared on the test line of the strip. The developed method is rapid, efficient, sensitive and specific. Therefore, it provides a valuable tool for simultaneously detecting different Salmonella species.

Key words: Salmonella; colloidal glod immunochromatographic assay; detection; food samples

中图分类号：TS207.3 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）22-0154-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201422029

沙门氏菌（Salmonella）是一类重要的食源性致病菌。目前，沙门氏菌血清型约有2 500多种[1]，它可以引发胃肠炎、伤寒、败血症等多种疾病[2-3]。沙门氏菌的暴发具有全球性，据统计，全球每年因感染沙门氏菌而患胃肠炎的患者约有9 380万，死亡人数高达15万人[4]。美国、丹麦、俄罗斯等发达国家均有沙门氏菌感染事件的报道。在美国，每年被食源性病原菌感染的患者中约100万 例是由沙门氏菌导致的[5]。2010年3—9月，在丹麦由鼠伤寒沙门氏菌引起的感染病例高达172 例[6]。2013年，俄罗斯彼尔姆某学校暴发了一场因沙门氏菌而引起的食物中毒案例，导致150 名中学生患病[7]。近年来，我国受沙门氏菌的威胁越来越大。2001年我国疾病预防控制中心在全国11 个省市设点采样并检测了七大类农产品及食品（生肉、熟肉、生奶、冰激淋、酸奶、水产品和蔬菜共4 034 份样品），沙门氏菌平均检出率为3.32%[8]。2009—2011年，相关部门对在东北、西北、华东地区农贸市场随机抽取的1 779 份禽肉样品进行检测，结果显示样品沙门氏菌的平均污染率为12.5%[9]。因此，建立快速有效的检测方法对于沙门氏菌的临床诊断与预防具有重大的意义。

胶体金免疫层析技术（colloidal gold immunochromatographic assay，GICA）是一种以胶体金为示踪标记物，基于抗原抗体反应的免疫标记技术[10]。该方法快速便捷，操作简单，不需要特殊设备就能得到肉眼可见的结果，适用于现场大量样品的快速筛查[11-13]。沙门氏菌可分为五大类，其中包括甲组的甲型副伤寒沙门氏菌（Salmonella paratyphi A）、乙组的鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）、丙组的猪霍乱沙门氏菌（Salmonella choleraesuis）、丁组的肠炎沙门氏菌（Salmonella enteritidis）和戊组的鸭沙门氏菌（Salmonella anatum）。本研究建立双抗夹心模型，研制胶体金试纸条联检食品样本中5 种典型的沙门氏菌，并对试纸条的灵敏度和特异性进行了评价。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

牛奶、鸡蛋 南昌天虹购物中心。

氯化金（HAuCl4）、酪蛋白、柠檬酸三钠 美国Sigma公司；正辛酸（纯度＞98.0%） 梯希爱（上海）化成工业发展有限公司；BPW培养基、SBG磺胺增菌液、P-10B新生霉素、P-73 0.1%煌绿溶液 北京陆桥技术有限公司；5 种沙门氏菌（包括甲型副伤寒沙门氏菌（ATCC 9150）、鼠伤寒沙门氏菌（ATCC 13311）、猪霍乱沙门氏菌（ATCC 10708）、肠炎沙门氏菌（ATCC 13076）和鸭沙门氏菌（ATCC 9150），编号分别为A、B、C、D、E）、单核增生李斯特菌ATCC 13932、弗氏柠檬酸杆菌ATCC 43864 美国典型菌种保藏中心；19 种非沙门氏菌，包括阪崎肠杆菌CMCC 45401、阪崎肠杆菌CMCC 45402、大肠杆菌CMCC 25922、金黄色葡萄球菌CMCC 45401、单核增生李斯特菌CMCC 54007、威尔李斯特菌CMCC 35897、西尔李斯特菌CMCC 35967、英诺克李斯特菌CMCC 11288、绵羊李斯特菌CMCC 19119、格式李斯特菌CMCC 25401、蜡样芽胞杆菌CMCC 49027、福氏志贺氏菌CMCC 2457、宋内氏志贺氏菌CMCC 51592 中国医学微生物菌种保藏管理中心；枯草芽孢杆菌168、白色假丝酵母Z1、大肠杆菌NCTC 12900、副溶血弧菌ZDBE 江西疾病预防控制中心。

鼠抗沙门氏菌单克隆抗体（鼠抗甲型副伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、鸭沙门氏菌单克隆抗体，编号为8H10-B3，试纸条T线上的相应抗体编号为5G6-D7；鼠抗猪霍乱沙门氏菌单克隆抗体，编号为11D8-D4，试纸条T线上的相应抗体编号为9G6-A4）为本实验室制备（免疫原：该5 种沙门氏菌外膜蛋白，制备方法：有限稀释法，效价：8H10-B3为640 000；5G6-D7为2 560 000；11D8-D4为2 560 000；9G6-A4为1 280 000）；驴抗鼠IgG 无锡中德伯尔生物技术有限公司。

硝酸纤维素膜、吸水纸、样品垫、结合垫 美国密理博公司；紫外分光光度计 上海棱光技术有限公司；点样仪、试纸条切刀 美国BioDot公司；磁力搅
拌器 江苏金坛市金城国盛实验仪器厂；BHC-1300ⅡA/B3生物安全柜 苏州安泰空气技术有限公司；ZHWY-2102C恒温培养振荡器 上海智诚分析仪器制造有限公司；TGL-16台式离心机 湖南长沙湘仪离心机仪器有限公司；胶体金读取仪 上海互帼科学仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细菌培养

将－80 ℃保存的沙门氏菌划线接种于SS琼脂培养基平板上，37 ℃培养18 h后挑取典型单菌落接种于液体LB培养基上，37 ℃培养18 h。其他菌在LB平板上划线，方法同沙门氏菌。用0.01 mol/L 磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffered saline，PBS，pH 7.4）梯度稀释后进行菌落计数。

1.2.2 腹水辛酸硫酸铵沉淀法纯化抗体

取腹水离心（9 000 r/min、4 ℃、30 min）后取上清液，向上清中加入2 倍体积的0.06 mol/L CH3COONa溶液（pH 5.0），用1 mol/L HCl溶液调节pH 4.2～4.8。在搅拌条件下向每毫升原始腹水中逐滴加入33 µL正辛酸（纯度＞98.0%）后，继续搅拌30 min，4 ℃静置2 h。离心（9 000 r/min、4 ℃、45 min），收集上清液，向上清液中加入1/10体积的0.1 mol/L PBS缓冲溶液（pH 7.4），用1 mol/L NaOH溶液调节pH 7.4。4 ℃条件下缓慢加入(NH4)2SO4至终质量浓度为0.277 g/mL（30 min内完成），4 ℃静置过夜。离心（9 000 r/min、4 ℃、45min），弃上清液，收集沉淀。沉淀用0.01 mol/L PBS缓冲溶液（pH 7.4）溶解，4 ℃透析3 d。

1.2.3 柠檬酸三钠法制备胶体金

将100 mL 0.01% HAuCl4溶液加热至沸腾，在搅拌的条件下迅速加入1.3 mL 1%柠檬酸三钠溶液，继续加热搅拌，当溶液的颜色完全变成红色时，继续加热10 min后停止加热，冷却至室温，4 ℃条件下保存。

1.2.4 胶体金的标记

取60 个小烧杯按5×12呈矩阵排列，向每个小烧杯中分别加入1 mL胶体金。每列小烧杯用0.1 mol/L K2CO3溶液依次调节pH值至6、7、8、9、10。将每行小烧杯分为两组，前6 行烧杯为第一组，其余为第2组。第1组标记抗体8H10-B3，第2组标记抗体11D8-D4，每一组每行抗体标记量分别为5、10、15、20、25、30 µg/mL。封闭剂为5%酪蛋白。

1.2.5 胶体金标记pH值和抗体标记量的优化

将A、B、C、D、E沙门氏菌菌液用0.01 mol/L PBS缓冲溶液（pH 7.4）稀释至107 CFU/mL。分别取100 µL A、B、D、E沙门氏菌菌液分别与4 µL第1组金标抗体孵育5 min，用T线上喷有1.5 mg/mL抗体5G6-D7的试纸条检测，10～15min后用胶体金读取仪读取试纸条T线的信号值；取100 µL C沙门氏菌菌液与4µL第2组金标抗体孵育5min，用T线上喷有1.5 mg/mL抗体9G6-A4的试纸条检测，10～15 min后用胶体金读取仪读取试纸条T线的信号值。对照组为0.01mol/L PBS缓冲溶液（pH 7.4）。

1.2.6 试纸条T线抗体质量浓度的确定

按照表1制备5 种不同T线抗体质量浓度的试纸条，编号为a、b、c、d、e。在最优pH值和抗体标记量条件下，分别制备标记了抗体8H10-B3和11D8-D4的免疫金。将A、B、C、D、E沙门氏菌菌液用0.01 mol/L PBS缓冲溶液（pH 7.4）稀释至107 CFU/mL，分别取100 µL菌液与4 µL免疫金（2 µL抗体8H10-B3免疫金、2 µL抗体11D8-D4免疫金）孵育5 min，用5 种试纸条单检。对照组为0.01 mol/L PBS缓冲溶液（pH 7.4）。

表 1 试纸条T线质量浓度实验方案

Table 1 Concentrations for test line

mg/mL

1.2.7 试纸条灵敏度实验

将A、B、C、D、E沙门氏菌菌液用0.01 mol/L PBS缓冲溶液（pH 7.4）稀释至104～108 CFU/mL，分别取100 µL菌液与4 µL免疫金（2 µL抗体8H10-B3免疫金、2 µL抗体11D8-D4免疫金）孵育5 min，用最优T线浓度的试纸条检测，10～15 min 后读取结果。对照组为0.01 mol/L PBS缓冲溶液（pH 7.4）。

1.2.8 试纸条特异性实验

将培养好的非靶标细菌用0.01 mol/L PBS缓冲溶液（pH 7.4）稀释至107 CFU/mL，各取100 µL菌液加入试纸条中，10～15 min后读取结果。对照组为0.01 mol/L PBS缓冲溶液（pH 7.4）。

1.2.9 试纸条稳定性实验

将密封好的试纸条放入60 ℃恒温箱中加速保藏，每24 h取出，检测105～106 CFU/mL沙门氏菌，重复测定3 次。根据实验结果判定试纸条稳定性。

1.2.10 食品样本的检测

1.2.10.1 样品前处理

将市售盒装牛奶在无菌条件下分装成每等份25 mL。将市售鸡蛋（全蛋）在无菌条件下搅拌匀浆后分装成每等份25 mL。

1.2.10.2 增菌

向225 mL BPW培养基中加入25 mL样品，分别接种A、B、C、D、E 5 种沙门氏菌菌液。每份鸡蛋基质中另需加入1 mL新生霉素和2.5 mL 0.1%煌绿溶液，牛奶基质不加入。37 ℃振荡培养前增菌8 h。取1 mL菌液转种到10 mL SBG磺胺增菌液中进行选择性增菌，37 ℃振荡培养8～12 h。

1.2.10.3 检测

选择性增菌8 h后，每隔1 h各取100 µL菌液加入试纸条中，10～15 min后读取结果。

2 结果与分析

2.1 胶体金的表征分析

图 1 胶体金紫外-可见扫描图

Fig.1 UV-visible spectrum of colloidal gold

从图1可以看出，胶体金在530 nm左右有强吸收峰。用透射电子显微镜观察可以看出胶体金颗粒大小均一，约为35 nm左右（图2）。

图 2 胶体金电镜图

Fig.2 TEM image of colloidal gold particles

2.2 标记pH值的优化结果

抗体标记量为10 µg/mL，标记pH值为6、7、8、9、10时，用胶体金读取仪读取试纸条T线的信号值结果如图3所示。当pH值为7时，甲型副伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌和鸭沙门氏菌试纸条T线信号值最高，因此选择pH值为7作为抗体8H10-B3标记pH值。猪霍乱沙门氏菌试纸条T线的信号值在pH值为6时最高，因此选择pH值为6作为抗体11D8-D4标记pH值。

图 3 标记pH值的优化结果

Fig.3 Optimization of pH for antibody labeling

2.3 抗体标记量的优化结果

在最优标记pH值条件下，抗体标记量的优化结果如图4所示。当抗体标记量为15 µg/mL时，甲型副伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、鸭沙门氏菌试纸条T线信号值最高，抗体标记量为15 µg/mL和20 µg/mL时鼠伤寒沙门氏菌试纸条T线信号值相差不大，从节约抗体用量的角度考虑，本实验选择15 µg/mL作为抗体8H10-B3标记量。当抗体标记量为5 µg/mL时，猪霍乱沙门氏菌试纸条T线的信号值最高，因此本实验选择5 µg/mL作为抗体11D8-D4标记量。

图 4 抗体标记量的优化结果

Fig.4 Optimization of the amount of antibody labeled

2.4 试纸条T线抗体质量浓度的优化结果

表 2 试纸条T线抗体质量浓度的优化结果

Table 2 Optimization of test line concentration

注：－.阴性，＋、±.阳性。±比＋显色弱，越多＋表示T线显色越强。表3同。

表2结果显示，试纸条T线抗体质量浓度编号为a（抗体5G6-D7质量浓度1.5 mg/mL，抗体9G6-A4浓度2.0 mg/mL）时，T线显色最强。因此，本实验选择T线抗体质量浓度为a号的试纸条。

2.5 试纸条灵敏度分析

本实验制备的胶体金试纸条能联检5 种沙门氏菌。甲型副伤寒沙门氏菌灵敏度最高，为105 CFU/mL；鼠伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、肠炎沙门氏菌和鸭沙门氏菌灵敏度为106 CFU/mL，结果见图5。

1号为PBS缓冲液阴性对照，2～7号为甲型副伤寒沙门氏菌（A），8～12号为鼠伤寒沙门氏菌（B），13～17号猪霍乱沙门氏菌（C），18～22号为肠炎沙门氏菌（D），23～27号为鸭沙门氏菌（E）。除A组外每组试纸条从左至右细菌浓度为105、5×105、106、107、108 CFU/mL；A组中增加了一条（2号），浓度为104 CFU/mL，剩下的与其他组一致。

图 5 试纸条灵敏度实验结果

Fig.5 Sensitivity of the strip

2.6 试纸条特异性分析

1～19.依次为阪崎肠杆菌CMCC 45401、阪崎肠杆菌CMCC 45402、大肠杆菌CMCC 25922、大肠杆菌NCTC 12900、副溶血弧菌ZDBE、金黄色葡萄球菌CMCC 45401、单核增生李斯特菌ATCC 13932、单核增生李斯特菌CMCC 54007、威尔李斯特菌CMCC 35897、西尔李斯特菌CMCC 35967、英诺克李斯特菌CMCC 11288、绵羊李斯特菌CMCC 19119、格式李斯特菌CMCC 25401、蜡样芽胞杆菌CMCC 49027、福氏志贺氏菌2457、宋内氏志贺氏菌CMCC 51592、白色假丝酵母Z1、弗洛柠檬酸杆菌ATCC 43864、枯草芽孢杆菌168；20.PBS缓冲溶液阴性对照。

图 6 试纸条特异性实验结果

Fig.6 Specificity of the strip

试纸条与19 株非沙门氏菌的反应结果如图6所示。试纸条与大肠杆菌CMCC 25922（3号）、大肠杆菌NCTC 12900（4号）、金黄色葡萄球菌CMCC 45401（6号）、弗氏柠檬酸杆菌ATCC 43864（18号）存在弱阳性反应；与其他菌以及PBS缓冲溶液呈阴性反应。与大肠杆菌CMCC 25922（3号）、大肠杆菌NCTC 12900（4号）和弗氏柠檬酸杆菌（18号）存在交叉反应的原因可能是因为本实验的目的菌与这3株菌有较多的相似抗原。金黄色葡萄球菌CMCC 45401（6号）细胞壁表面含有蛋白A，它和许多抗体的Fc片段具有亲和能力，这可能是导致阳性结果的原因。

2.7 试纸条稳定性实验结果分析

结果显示，从第3天开始试纸条T线显色变弱。根据经验，胶体金免疫层析试纸条在60 ℃条件下稳定1 d，相当于室温保质3 个月。因此，本方法研制的试纸条在常温干燥的条件下预计能保存6 个月。

2.8 食品样品检测

前处理后的食品样本通过SS琼脂培养基平板计数确定为阴性样本；通过LB平板计数，确定加入样品中增菌的目的菌均为10～100 CFU。取选择性增菌8、9、10、11、12 h的沙门氏菌菌液用试纸条进行检测。试纸条的检测结果如表3所示，在食品样本（牛奶、鸡蛋）中，通过前增菌8 h，选择性增菌12 h能够检出该5 种沙门氏菌。这说明本实验研制的试纸条是可以用于食品样本中5 种沙门氏菌的检测。

表 3 食品样品检测结果

Table 3 Detection of target Salmonella in food samples using the strip

3 结 论

食源性致病菌的监控与预防是全球面临的重要问题之一，其中沙门氏菌的安全风险监测是我国疾病预防控制机构的重要任务之一。近年来，胶体金免疫层析试纸条法在沙门氏菌的检测中应用得越来越广泛，与其他快速检测方法（酶联免疫吸附实验、聚合酶链式反应、环介导等温扩增技术等）相比，胶体金免疫层析试纸条法具有花费低、操作简单、适合用于非专业人员对大量样本进行检测的特点。柳健等[14]制备免疫层析试纸条检测肠炎沙门氏菌的最低检测量为2×105 CFU/mL。李翠萍等[15]对沙门氏菌胶体金试纸条进行了评价，该方法的检测灵敏度为106 CFU/mL。Preechakasedkit等[16]研制一步法胶体金免疫层析试纸条检测鼠伤寒沙门氏菌，检测灵敏度为1.14×106 CFU/mL。

多元检测是胶体金免疫层析法发展的趋势，它能同时高效地检测目标物，降低检测成本，在对多个指标进行联检方面有很重要的应用价值[17]。Moongkarndi等[18]首次建立了有两条T线的免疫层析试纸条模型，可以同时检测肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌，检测灵敏度分别为106 CFU/mL和104 CFU/mL。本实验针对5 种典型的沙门氏菌（甲型副伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、肠炎沙门氏菌和鸭沙门氏菌），建立能同时检测该5 种沙门氏菌的胶体金免疫层析方法，结果表明本实验研制的试纸条能达到联检的目的，检测灵敏度为105～106 CFU/mL，特异性较高。此外，鄢志刚等[19]通过比较胶体金免疫层析技术、酶联免疫吸附实验、聚合酶链式反应3 种方法对牛奶、鸡蛋等401 份样品中沙门氏菌的检测结果，最终确定在大量样品的检测过程中可采用胶体金免疫层析技术进行筛检。通过两步增菌，本方法研制的试纸条可以同时检测出食品样本（牛奶、鸡蛋）中5 种沙门氏菌，在对大量食品样本现场筛检方面具有重要的应用价值。

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