湖南茯砖茶香气成分的SPME-GC-TOF-MS分析

颜鸿飞1,2，王美玲1,2，白秀芝2，朱绍华1,2，戴 华1，李拥军1,2,*

（1.湖南出入境检验检疫局，湖南 长沙 410004；2.国家食品安全检测重点实验室，湖南 长沙 410004）

摘 要：采用单因素对比试验方法确定固相微萃取湖南茯砖茶中香气成分的优化条件，并结合气相色谱-飞行时间-质谱法鉴定湖南茯砖茶香气组分。结果表明：固相微萃取与气相色谱-飞行时间-质谱联用分析湖南茯砖茶香气成分的最佳条件为DVB/CAR/PDMS萃取头（50/30 µm）、萃取温度80 ℃和萃取时间60 min。气相色谱-飞行时间-质谱法从3 个茯砖茶中共分离鉴定出93 种香气成分，占检出挥发性成分总量的90%以上，主要由酮类、醛类、碳氢类、杂氧类、醇类、酸类、酯类、含氮类8 类化合物构成。在鉴定出的香气化合物中共有香气组分50 个，其中含量较高的组分有反,反-2,4-庚二烯醛、甲基庚烯酮、2-戊基呋喃、香叶基丙酮、3,5-辛二烯-2-酮（E,E）、6-甲基-3,5-庚二烯-2-酮等。

关键词：固相微萃取；气相色谱-飞行时间-质谱法；湖南茯砖茶；香气成分

Analysis of Aroma Composition in Hunan Fuzhuan Tea by Solid-Phase Microextraction Combined with
Gas Chromatography-Time of Flight-Mass Spectrometry

YAN Hong-fei1,2, WANG Mei-ling1,2, BAI Xiu-zhi2, ZHU Shao-hua1,2, DAI Hua1, LI Yong-jun1,2,*

(1. Hunan Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Changsha 410004, China;

2. National Key Testing Laboratory of Food Safety, Changsha 410004, China)

Abstract: The aroma components of Hunan Fuzhuan tea were extracted by space solid phase microextraction (SPME) technique and determined by gas chromatography-time of flight-mass spectrometry (GC-TOF-MS). The optimum extraction conditions were determined as follows: DVB/CAR/PDMS extraction head (30/50 µm), extraction temperature 80 ℃, and extraction time 60 min. A total of 93 aroma components of Hunan Fuzhuan tea accounting for over 90% of the total volatile components were identified, including ketones, aldehydes, hydrocarbon, heterocyclicoxygen compounds, alcohols, acids, esters, and nitrogen-containing compounds. There were 50 same aroma components identified in three kinds of Fuzhuan teas, where the major volatile components were E,E-2,4-heptadienal, 6-methyl-5-hepten-2-one, 2-pentyl-furan, geranyl acetone, 3,5-octadiene-2-one (E,E), 6-methyl-3,5-heptadien-2-one, and so on.

Key words: solid phase microextraction (SPME); gas chromatography-time of flight-mass spectrometry (GC-TOF-MS); Hunan Fuzhuan tea; aroma composition

中图分类号：TS272 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）22-0176-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201422033

传统的湖南黑茶是采用湖南雪峰山脉茶区的大中叶群体品种鲜叶，经过杀青、揉捻、渥堆、松柴明火干燥四大工艺加工而成的毛茶和以其为原料蒸压成形的紧压茶总称[1]。湖南黑茶始于安化，安化黑茶中的茯茶制作技艺已列入国家级非物质文化遗产。茯砖茶是湖南安化黑茶代表性产品之一，渥堆发酵过程中，由于冠突散囊菌等微生物的大量介入，形成孢外酶，在孢外酶促作用和茶叶本身湿热作用的协同下，形成湖南安化茯砖茶典型独特的“菌花香”香气品质[2-8]。

茶叶的香气成分主要是挥发性与半挥发性化合物，含量低，且复杂不稳定，其分析结果的准确性很大程度上取决于香气物质的萃取方式。常用的茶叶香气提取方法有水蒸气蒸馏法[9]、同时蒸馏-萃取法[10]、顶空吸附法[11]、超临界流体萃取法[12]、吹扫捕集法[13]以及固相微萃取等[14]。固相微萃取（solid phase microextraction，SPME）法是20世纪90年代出现的一种集采集、萃取、浓缩、进样于一体的样品前处理技术，并可直接与气相色谱、气相色谱-质谱等仪器联用实现在线分析。近些年来，SPME法由于其表征香气品质高可信度的优点，日渐成为茶叶香气成分研究的重要方法[15-21]。但检索发现运用SPME技术分析湖南黑茶香气物质的研究鲜见报道。本实验拟通过对SPME萃取参数的优化，采用自动顶空SPME技术对湖南茯砖茶香气成分进行捕集，并结合气相色谱-飞行时间-质谱（gas chromatography-time of flight-mass spectrometry，GC-TOF-MS）联用技术快速分析湖南茯砖茶香气成分，旨在为湖南茯砖茶的质量控制、品质量化及原产地保护提供一种科学的技术手段。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黑茶样品1号为湖南省益阳市益阳茶厂的金湘益茯砖、2号为湖南省安化县安化茶厂的金花茯砖、3号为湖南省桃江县湘丰浩茗茶业有限公司的特制茯砖。

100 µm聚二甲基硅氧烷涂层纤维（polydimethy-lsiloxane，PDMS）、30/50 µm二乙烯涂层纤维-碳分子筛-聚二甲基硅氧烷（divinylbenzene/carboxen/PDMS，DVB/CAR/PDMS）、75µm碳分子筛聚二甲基硅氧烷涂层纤维（CAR/PDMS） 美国Supelco公司。

1.2 仪器与设备

LECO气相色谱-飞行时间-质谱仪（配有电子电离源及PEGAS 4.0数据处理系统） 美国LECO公司；Combi PAL全自动SPME进样系统 瑞士CTC公司。

1.3 方法

1.3.1 SPME萃取

固相微萃取使用前先将萃取头在GC进样口280 ℃活化1 h。称取2.0 g（精确至0.001g）粉碎均匀茶样，放入20 mL SPME萃取瓶中，封口。将其置于预先设置好温度的SPME萃取自动进样系统进行分析。SPME自动进样系统条件：恒温80 ℃振荡20 min，使茶叶香气充分挥发和平衡，插入固相微萃取针，搅拌转数为600 r/min条件下，80 ℃萃取60 min，完成萃取后，迅速插入GC进样口，进样口温度250 ℃，解吸5 min，进行GC-TOF-MS测定。

1.3.2 GC条件

色谱柱：Rtx-5MS石英毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25 µm）；升温程序：50 ℃保持3 min，以3 ℃/min升至210 ℃保持1 min，以10 ℃/min升至250 ℃，保持5 min；进样温度250 ℃；载气（He）流速1.2 mL/min；进样模式：分流，分流比10∶1。

1.3.3 TOF-MS条件

电子电离源；电子能量70 eV；传输线温度270 ℃；离子源温度230 ℃；离子采集方式：一维全扫描；质量扫描范围m/z 35～400；采集频率20张/s；检测器电压1 700 V；溶剂延迟时间5 min。

1.3.4 单因素优化试验设计

采用单因素逐步优化的方法，根据不同条件下色谱峰的总面积和出峰数目共同确定最佳的萃取头类型、萃取温度和萃取时间。

表 1 SPME萃取参数单因素优化试验设计

Table 1 SPME extraction parameters used in single factor design optimization

1.4 定性定量分析

定性分析：香气化合物成分的定性采用NIST 11谱库进行检索匹配，仅报道相似指数（similarity index，SI）大于800的化合物，部分化合物结合人工解析质谱图并参照已发表的相关文献进行确证。定量分析：采用峰面积归一化法进行定量，求得各挥发性成分的相对含量。

2 结果与分析

2.1 SPME萃取条件的优化

2.1.1 萃取头的选择

3 种不同类型萃取头的比对结果表明，萃取挥发性成分物质总量最多的是30/50 µm（DVB/CAR/PDMS），75 µm（CAR/PDMS）次之，100 µm（PDMS）最少，其萃取物质总量之比依次为142.7∶131.1∶6.8。30/50、75、100 µm 3 种萃取头萃取挥发性成分数目分别为87、77、32 种。3 种萃取头中，30/50 µm（DVB/CAR/PDMS）对挥发性低沸点和高沸点风味成分的萃取能力都较强，萃取成分沸点分布范围更宽，更能反映茶叶香气的整体特征，因而选择30/50 µm DVB/CAR/PDMS萃取头。

2.1.2 萃取温度的选择

萃取温度是影响SPME萃取效率的一个重要因素。一方面，升高温度有助于分析物脱离基体加快向涂层靠拢而被吸附，缩短萃取平衡时间。另一方面，温度升高，会导致分配系数K降低，影响萃取灵敏度。结果显示（图1），随着水浴温度的升高，总峰面积呈持续上升态势，而总峰个数的增速在80 ℃后趋于平缓。值得一提的是，萃取温度高于80 ℃时总峰面积的增加主要集中在咖啡因和N-乙基琥珀酰亚胺2 种高沸点物质的贡献上，并没有体现在产生新化合物的贡献上。低于80 ℃时低沸点物质较多，高沸点物质很少，总峰面积和总峰个数也较少。80 ℃时萃取物质范围较广，低沸点和中高沸点组分分布比较均衡，主要茶叶特征香气成分相对含量较适中，克服了较低萃取温度和较高萃取温度所带来的问题，所以萃取温度选为80 ℃。

图 1 萃取温度对萃取效果的影响

Fig.1 Effect of adsorption temperature on extraction efficiency

2.1.3 萃取时间的选择

SPME技术的萃取过程是一个平衡分配过程，萃取时间由待分析物与涂层之间的吸附快慢来决定的。在未达到吸附平衡前，涂层萃取量随时间变化而改变，直至达到萃取平衡。如图2所示，随着吸附时间的延长，总峰面积略有增加，无明显变化。在萃取时间20～60 min内，总峰个数显著增加，60 min后增加趋于平缓，吸附-解吸动态平衡达到最佳状态。因此，60 min为最佳萃取时间。

图 2 萃取时间对萃取效果的影响

Fig.2 Effect of adsorption time on extraction efficiency

2.2 湖南茯砖茶主要香气化合物成分分析

图 3 3 个茯砖茶主要香气化合物类型的相对含量

Fig.3 Relative contents of major chemical classes of aroma compounds in 3 kinds of Fuzhuan tea

在优化的SPME条件下，萃取得到的茯砖茶香气化合物经GC-TOF-MS检测，共鉴定出93 种挥发性组分，分别占挥发性化合物总量的92.661%、90.841%和93.919%（表2）。由图3可知，从香气成分种类及数量分析，碳氢类化合物有34 种，其次是醛类有20 种，酮类有17 种。检出的化合物中脂肪族醛、酮类化合物、萜烯类化合物以及芳香醇等构成茯砖茶基本香气，同时表现出较强火功香的杂环化合物对茯砖茶的特征香型可能给以协调作用。

图 4 茯砖茶样1号（A）、2号（B）、3号（C）香气成分
总离子流色谱图

Fig.4 Total ion current chromatograms of aroma constituents from
3 kinds of Fuzhuan teas

由图3可知，3 种茯砖茶中共有组分有50 个，分别占各自检出挥发性成分数量总数的65.79%、66.67%和71.40%；共有组分相对含量占各自检出挥发性成分总量的83.691%、81.802%和87.517%，是湖南茯砖茶挥发性成分的主体成分，其总离子流图见图4。从表2可知，3 种茯砖茶中相对含量较高的共有组分有反,反-2,4-庚二烯醛、甲基庚烯酮、2-戊基呋喃、香叶基丙酮、3,5-辛二烯-2-酮（E,E）、6-甲基-3,5-庚二烯-2-酮等。其中反,反-2,4-庚二烯醛、3,5-辛二烯-2-酮（E,E）、6-甲基-3,5-庚二烯-2-酮等烯醛、烯酮类化合物对茯砖茶的“菌花香”有重要贡献。同时，在GC-TOF-MS检测中还发现了一些重要的香气化合物，如香叶基丙酮，具有花香及木香，对茯砖茶独特香型有特殊贡献；α-紫罗酮、β-紫罗酮等紫罗酮类化合物是由茶叶中类胡萝卜素先质降解产生的一类重要的香气特征化合物；2-戊基呋喃等呋喃类化合物具有较高的香气强度和较低的阈值，赋予茯砖茶的烘焙香或火功香；藜芦醚、1,2,3-三甲氧基苯等甲氧基苯类化合物在茯砖茶中有检出。它们共同构成了湖南茯砖茶主要的香气特征化合物。

表 2 湖南茯砖茶中主要挥发性香气成分（n=3）

Table 2 Aroma components identified in Hunan Fuzhuantea (n = 3)

注：—.化合物含量未鉴别到。

3 讨 论

本实验通过对SPME的影响因素萃取头类型、萃取温度、萃取时间等进行优化（以鉴定出的色谱峰个数和总峰面积评估），建立湖南茯砖茶中香气成分的SPME-GC-TOF-MS分析方法，共鉴定出湖南茯砖茶香气成分93 种，以酮类、醛类、碳氢类、杂氧类、醇类、酸类、酯类和含氮类化合物为主。其中含量较高的共有香气成分有反,反-2,4-庚二烯醛、甲基庚烯酮、2-戊基呋喃、香叶基丙酮、3,5-辛二烯-2-酮（E,E）、6-甲基-3,5-庚二烯-2-酮等。

有研究[22]表明，茯砖茶香气化合物主要以醇类和酯类为主，而本实验结果发现，湖南茯砖茶的香气化合物主要是醛类和酮类化合物。可能与不同的香气物质提取方式有关。前者采用的是同时蒸馏萃取法，萃取时间长、产量高，易得到高沸点的化合物。如蒸馏后
反,反-2,4-庚二烯醛、反-2-葵烯醛等几乎检测不到，而产生了一些亚油酸甲酯、亚麻酸甲酯和亚麻酸乙酯等化合物。同时，有研究认为同时蒸馏萃取法萃取过程中的一些次生反应有可能导致检测结果的失真现象[23-24]。而SPME法不需要有机试剂，萃取得到的挥发性化合物更能贴近茶叶本身的香型。结果表明，SPME-GC-TOF-MS法应用于湖南茯砖茶香气成分的提取、分析和鉴定，不需要复杂的香精油制备前处理过程，再结合TOF-MS强大的数据采集功能，是一种较真实地反映湖南茯砖典型香气特征的分析手段。

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