桑枝提取物中1-脱氧野尻霉素的稳定性研究

刘 超,徐 立*,刘 静,郑 曼

(西南大学生物技术学院,重庆 400715)

 

摘 要:1-脱氧野尻霉素(1-deoxynojirimycin,DNJ)是桑树中的一种含氮糖类化合物,具有高效的降血糖活性、巨大的保健和药用潜力,其稳定性研究非常必要。本实验借助高效液相色谱仪测定DNJ含量的变化,分别研究微波、超声波、酸碱、加热、紫外光和自然光6 个因素对桑枝提取物中DNJ稳定性的影响。结果表明微波可以明显破坏DNJ,800 W功率处理1 h可使DNJ的损耗率达65%,而超声波对DNJ稳定性的影响不大,且在不同功率的一定时间点还可以增加提取物中DNJ的含量;加热对DNJ的稳定性有一定程度的影响;pH值与光照对DNJ的稳定性影响较微弱。这些结果可为天然DNJ的生产和储存工艺的研究以及桑枝的开发利用提供有效参考。

关键词:1-脱氧野尻霉素;桑枝提取物;稳定性;高效液相色谱

 

Stability Analysis of 1-Deoxynojirimycin in Ramulus mori Extract

 

LIU Chao, XU Li*, LIU Jing, ZHENG Man

(College of Biotechnology, Southwest University, Chongqing 400715, China)

 

Abstract: 1-Deoxynojirimycin (DNJ) has efficient hypoglycemic activity and huge health and medicinal potential. Therefore, the study of its stability is very meaningful. In this study, the effects of six factors including microwave, ultrasonic, acid and alkali, heat, ultraviolet light and natural light on the stability of DNJ in Ramulus mori extract were explored, and the contents were measured by high performance liquid chromatography (HPLC). The results showed that microwave could destabilize DNJ obviously, and DNJ loss rate was 65% when treating it for 1 h with a power of 800 W. Yet ultrasound had little effect on DNJ stability, and the content of DNJ in the extract was increased at a certain time point during the treatment under various powers. Heating had an observable influence on the stability of DNJ, but the effects of pH and light on the stability of DNJ were weak. The results can provide effective references for the production and storage of natural DNJ.

Key words: 1-deoxynojirimycin (DNJ); Ramulus mori extract; stability; high performance liquid chromatography

中图分类号:TQ464.4 文献标志码:A 文章编号:1002-6630(2014)23-0052-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201423011

桑枝是一种中国传统草药,其药用与保健功效在历代药典中多有记载。现代植物化学研究表明,桑树中富含的结构与α-1,4-葡萄糖类似的天然活性物质1-脱氧野尻霉素(1-deoxynojirimycin,DNJ)具备明显的降血糖[1-6]、抗肿瘤[7]和抗病毒[8-9]活性,有治疗病毒感染、肥胖症、糖尿病等多种疾病的潜能[10],已经成为多种功能性食品的主要活性成分[11],是目前天然活性物质研究中的热点之一。因此,天然DNJ的提取、分离纯化与基团改造等研究及生产过程中的稳定性研究是非常必要的,目前除了Kazuhisa等[12] 对蚕粉中DNJ在121 ℃的稳定性进行过描述外,却鲜见其他稳定性方面的研究和探索。

影响天然活性物质稳定性的因素主要包括温度、酸碱度及光照。此外,作为在传统有机溶剂萃取基础上发展起的新型萃取技术,微波和超声波辅助萃取因具有方便快速、节能环保、回收率高等优点[13-16],已被广泛应用于食品化学和中药提取方面,且在DNJ的研究中也有利用[17-19]。本实验基于此研究了微波、超声波、温度、酸碱度及光照对DNJ稳定性的影响,以期为DNJ的提取、分离和贮藏等研究和生产过程以及桑枝的开发利用提供数据参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新疆药桑枝条由新疆维吾尔自治区和田蚕桑科学研究所提供。

DNJ标准品、9-芴甲氧羰酰氯(9-fluorenylmethyl chloroformate,Fmoc-Cl)、乙腈(色谱级) 美国Sigma公司;甘氨酸 大川精细化工有限公司;氯化钾、硼酸 成都科龙化工试剂厂;乙酸(分析级)、乙醇(工业级) 重庆川东化工有限公司。

1.2 仪器与设备

高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)仪 美国Waters公司;微波炉(频率2 450 MHz,最大输出功率800 W) 格兰仕微波炉电器有限公司;数控超声波清洗器(频率40 kHz,最大输出功率700 W) 昆山市超声仪器有限公司;纯水仪 法国Millipore公司;旋转蒸发仪 巩义市予华仪器有限责任公司;超净工作台 苏州净化设备有限公司;恒温水浴锅 国华电器有限公司;粉碎机 温岭市林大机械有限公司;电子计价秤 大阳衡器有限公司;涡旋仪 海门市其林贝尔仪器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品的制备

4.5 kg桑枝粉碎后,用75%的乙醇以液料比101
V/m)提取4 次,每次24 h。提取液用砂芯漏斗过滤并减压浓缩至无醇味,正丁醇萃取。所得正丁醇部分减压浓缩至浸膏,用1 500 mL蒸馏水溶解,保存于棕色瓶中待用。

1.3.2 微波和超声波对提取物的处理

每个6 mL的玻璃收集瓶中加入1 mL样品,分别在320、480、640、800 W微波功率下处理0、5、10、20、30、40、50、60 min。各瓶样品用蒸馏水定容至2 mL,并取10 μL衍生化,放在4 ℃冰箱中待测。每个处理3 个重复。

每个4 mL的离心管中加入2 mL样品,分别在280、420、560、700 W超声波功率下处理0、10、20、40、60、80、100、120 min。各管样品取10 μL衍生化,放在4 ℃冰箱中待测。每个处理3 个重复。

1.3.3 酸碱和加热对提取物的处理

用1 mol/L盐酸和氢氧化钠溶液调样品的pH值至2.0、4.5、7.0、9.5、12.0,分别移取25 mL于25 mL棕色容量瓶中。每8 d取10 μL于0.5 mL离心管中,衍生化,放在4 ℃冰箱中待测,连续取5 次。每个处理3 个重复。

移取25 mL样品于25 mL棕色容量瓶中,分别在55、70、85、100 ℃的水浴条件下加热0、4、8、12、16、20、24、30 h。各温度处理组每4 h(最后一次间隔6 h)用蒸馏水定容至25 mL后取10 μL,衍生化,放在4 ℃冰箱中待测。每个处理3 个重复。

1.3.4 自然光和紫外光对提取物的处理

25 mL样品分别定容于25 mL棕色和白色容量瓶中,置于20 W荧光灯下距离20 cm处照射[20],每2 d取10 μL于0.5 mL离心管中,衍生化,放在4 ℃冰箱中待测,连续取6 次(最后两次分别间隔3 d和4 d)。每个处理3 个重复。

25 mL样品分别定容于25 mL棕色和白色容量瓶中,置于18 W紫外灯下距离20 cm处照射[20],其他处理同荧光灯处理。

1.3.5 超声波和100 ℃加热对DNJ标准品的处理

由于超声波和100 ℃加热对提取物的处理结果出现DNJ含量中途增加的趋势,为一定程度上验证推测的结果,增加了超声波和100 ℃加热对DNJ标准品的处理,方法分别同1.3.2节中超声波对提取物的处理和1.3.3节加热对提取物的处理。

1.3.6 DNJ含量的HPLC测定

参照Kim[16]、Chen Yajie[21]、魏兆军[22]等的方法,将30 μL以上各种处理后的处理液或DNJ标准品溶液与30 μL的硼酸钾缓冲液(0.4 mol/L,pH 8.5)混合于0.5 mL离心管中,加入60 μL 5 mmol/L的Fmoc-Cl,25 ℃条件下水浴20 min,再加入30 μL 1 mol/L的甘氨酸终止反应。用30 μL体积分数0.1%乙酸溶液稳定新生成的DNJ-Fmoc,并以蒸馏水定容至300 μL,0.22 μm尼龙滤膜过滤,置于4 ℃冰箱待测。每步都涡旋振荡10 s,以使溶液充分混合。

DNJ的HPLC检测条件:5 μm C18(4.6 mm×150 mm)反相色谱柱,流动相为乙腈-0.1%醋酸(5545,V/V)流速1 mL/min,柱温30 ℃,检测波长254 nm,进样量10 μL

DNJ含量/%= ×100

处理组DNJ含量

空白组DNJ含量

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2 结果与分析

2.1 DNJ标准曲线的测定与HPLC分析

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图 1 DNJ标准品(a)和桑枝提取物(b)的HPLC图

Fig.1 Chromatogram of DNJ standard (a) and Ramulus mori extract (b)

DNJ标准曲线的线性回归方程为y = 2 870.6x-1 709,R2=0.999 4,其线性取值范围是0~240 μg/mL。如图1所示,DNJ的保留时间约为2.15 min,色谱吸收峰较明显,说明本实验的检测条件可行。

2.2 微波和超声波对DNJ稳定性的影响

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图 2 微波对提取物中DNJ稳定性的影响

Fig.2 Effect of microwave on DNJ stability in the extract

由图2可知,随着微波处理时间的延长,同一功率组中DNJ的含量逐渐下降,且功率越大,含量下降的速率越快;480、640、800 W处理组的DNJ变化走势较相似,1 h内损耗率达50%~65%,而320 W较平缓,1 h内损耗率为22.6%。说明微波对DNJ稳定性有明显的影响。在微波热效应作用下,高频振荡可使受热物质中的极性分子间产生内摩擦而整体致热,温度均匀升高。且有报道显示微波能引起蛋白亚基结构的变化,削弱亚基间的相互作用[23]。所以推断DNJ在微波热效应作用下,结构中的基团被破坏或发生反应,进而致使其含量降低,即稳定性下降。也不排除受到了微波的电、磁及化学等非热效应的综合影响。此外,实验发现,样品经微波短时间处理就可挥发掉其中几乎所有的水分,变为浸膏,因此建议在获取DNJ浸膏的过程中,可先用旋转蒸发仪去掉大部分溶剂,而后在其稳定性较好的处理时段内,用微波除去黏稠液中剩余的难挥发液体,快速得到浸膏。

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图 3 超声波对提取物中DNJ(a)和DNJ标准品(b)稳定性的影响

Fig.3 Effects of ultrasonic on the stability of DNJ in the extracts (a) and DNJ standards (b)

由图3a可知,不同超声波功率组中,处理开始的一段时间,随着时间的延长,DNJ的含量逐渐下降;中间突然出现一增长点后DNJ的含量又随着时间的延长而逐渐下降,但各功率间变化的幅度和趋势都相差不大。由图3b可知,处理2 h后各组的损耗率都在20%之内,说明超声波对DNJ的稳定性有一定的影响。有研究发现超声波能破坏淀粉支链结构和长链,使直链淀粉含量增加[24]。故结合图3a、3b推测700 W处理20 min、560 W处理60 min、420 W处理80 min和280 W处理100 min后出现的含量突然增加的变化趋势,可能是由于桑树中含有的DNJ糖苷,DNJ类似物(如N-甲基-1-脱氧野尻霉素、2-O-α-D-吡喃半乳糖基-l-脱氧野尻霉素、6-O-β-D-吡喃葡萄糖基-l-脱氧野尻霉素、4-O-D-吡喃葡萄糖基-l-脱氧野尻霉素、6-O-α-D-吡喃半乳糖基-l-脱氧野尻霉素、2-O-D-吡喃葡萄糖基-l-脱氧野尻霉素或3-O-α-D-吡喃葡萄糖基-l-脱氧野尻霉素等)[25-28],或以酰胺、酯等形式存在的DNJ[29]在超声波机械效应、空化效应及热效应的作用下,与溶剂分子之间的的摩擦碰撞被加速,产生的高压环境导致了链的断裂,即超声波可能促进某些化学反应的进行[30],进而导致了类似物结构发生变化,部分变成了DNJ。但这些桑树DNJ的类似物中只有N-甲基-1-脱氧野尻霉素在桑枝内被发现[31],而N-甲基-1-脱氧野尻霉素不能与Fmoc-Cl发生衍生反应[16],在实验所得的结果图中无法推测其出峰位置,难于为此推论提供结果依据,但理论上N-甲基-1-脱氧野尻霉素在超声波催化下变化致DNJ含量增高的可行性很大。然而,由图3a、3b也可以看出,DNJ标准品单位时间内的损耗率比提取物中DNJ的损耗率要大,可能是由于提取物中各种大小分子物质在波的传递过程中,一定程度上损耗了其部分能量,致使在相同功率的处理条件下,作用于提取物中DNJ的能量要低于DNJ标准品的能量。当然,也不排除提取物中一些黏性物质的物理作用或带有特殊官能团物质的分子间作用对DNJ起到了一定程度上的保护效果。

2.3 酸碱和加热对DNJ稳定性的影响

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图 4 pH值对提取物中DNJ稳定性的影响

Fig.4 Effect of pH on DNJ stability in the extract

如图4所示,同一pH值处理组中,随着放置时间的延长,DNJ的含量缓慢降低,变化趋势近似,且40 d损耗率在10%之内;不同处理组间,DNJ的损耗率具有一定的差异性,但总体相差不大,说明pH值对DNJ的稳定性影响不大。从图中可以看出在酸性环境比碱性环境中的稳定性稍好,这可能由于DNJ属于一种生物碱,本身略带正电荷,显碱性,在酸性条件下成盐,增加了其稳定性;而碱性条件一定程度上可促使胺键开环[32],破坏了DNJ的结构,进而降低了其稳定性。

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图 5 温度对提取物中DNJ(a)和100 ℃对DNJ 标准品(b)
稳定性的影响

Fig.5 Effect of temperature on DNJ stability in the extract (a) and effect of treatment at 100 ℃ on the stability of DNJ standard (b)

如图5a所示,在55、70和85 ℃处理组中,DNJ的含量随着时间的延长而减少,温度越高含量减少的越快,30 h的损耗率在10%~15%之间,且时间越长变化的趋势越明显。但100 ℃处理组中,DNJ含量的变化趋势却是先降低再增加,然后再降低的过程,结合图5b推测是由于一定时间的高温使样品中N-甲基-1-脱氧野尻霉素等DNJ类似物或DNJ糖苷的结构遭到破坏,从而导致DNJ含量增加。但其趋势线中的凸起不像超声波那样突现,是由于超声波有一定的穿透性,可使样品内外短时间内受到同样的影响,而水浴加热则需一个传导过程,故变化趋势相对平缓。结果总体表明加热可降低DNJ的稳定性,时间越长、温度越高稳定性变化越大。

2.4 紫外光和自然光对DNJ稳定性的影响

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图 6 光照对提取物中DNJ稳定性的影响

Fig.6 Effect of light on DNJ stability in the extract

如图6所示,紫外光和自然光处理组,白色瓶和棕色瓶中的DNJ含量变化趋势都比较接近,说明光照对DNJ的稳定性几乎没有影响。但对于白色瓶中DNJ的损耗率,紫外光组却稍微高于自然光组,15 d内其损耗率仅相差0.65%。说明与其他物质相似,紫外光所能引起的光降解反应[33]也可能适用于DNJ,但其作用比较微弱。也不排除样品中物质种类较多,不乏一些有色物质吸收或阻挡了部分光线,一定程度上减小了光照对DNJ的破坏程度。

3 结 论

环境因素是影响活性物质稳定性的主要因素之一,一般由温度、酸碱度及光组成。此外,在天然DNJ提取、分离及应用过程中,微波与超声波以其高效、方便和环保等方面的先进性正在越来越多的被运用到。由此,本实验分别研究了微波、超声波、酸碱、加热、紫外光和自然光对桑枝粗提物中DNJ稳定性的影响。结果表明微波可以明显破坏DNJ的稳定性,而超声波的破坏作用不强,且在一定功率的一定时间点还可以增加提取物中DNJ的含量;加热对DNJ的稳定性有一定程度的影响;pH值与光照对DNJ的稳定性影响较微弱。实验结果为天然DNJ的生产和贮藏工艺提供了可用的数据参考。

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收稿日期:2013-12-31

基金项目:中央高校基本科研业务费专项资金项目(XDJK2013C053)

作者简介:刘超(1988—),男,硕士研究生,主要从事植物化学研究。E-mail:liuchao212@foxmail.com

*通信作者:徐立(1976—),男,副教授,博士,主要从事植物化学研究。E-mail:mulberry@swu.edu.cn