双歧杆菌RH胞外多糖提取纯化及体外
抗凝血活性评价

李 辉，宋居易，刘 蕾，李平兰*

（中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083）

摘 要：为得到高纯度双歧杆菌RH胞外多糖，并探讨其抗凝血功效，采用正交试验优化酶解提取工艺。优化最佳酶解条件为：蛋白酶添加量2 g/L，中性蛋白酶与胰蛋白酶质量比例为1∶2，在pH 7.5的条件下酶解120 min。再经凝胶Sepharose CL-6B柱层析纯化，得到胞外多糖纯品。利用凝胶色谱结合多角度激光散射仪测得该胞外多糖分子质量为5.946×104 D。进一步对其抗凝血活性进行评价，不同质量浓度胞外多糖可以显著延长活化部分凝血活酶时间和凝血酶时间，且具有剂量依赖效应。纯化后胞外多糖纯度可以达到97%以上，纯多糖具有较好的体外抗凝血活性，主要参与内源凝血途径。

关键词：双歧杆菌；胞外多糖；提取；纯化；抗凝血

Extraction, Purification and in vitro Anticoagulant Activity of Exopolysaccharides from Bifidobacterium animalis RH

LI Hui, SONG Ju-yi, LIU Lei, LI Ping-lan*

(College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China)

Abstract: Exopolysaccharides (EPS) are water-soluble extracellular polysaccharides with potential biological activities. In this study, we investigated the extraction, purification and anticoagulant activity of the EPS produced by Bifidobacteria animalis RH. The optimal enzymatic hydrolysis conditions were found to be 120 min hydrolysis using a mixture of neutral protease with trypsin (1:2) at a total concentration of 2 g/L with an initial pH of 7.5 by orthogonal array design. The EPS was purified by Sepharose CL-6B column chromatography. The purity was 97.045% and the average molecular mass of the EPS was 5.946 × 104 D as determined by GPC/MALLS. Furthermore, anticoagulant activity in vitro tests showed the EPS could significantly prolong activated partial thromboplastin time (APTT) and thrombin time (TT) in a dose-dependent manner, rather than prothrombin time (PT). These results demonstrated that the EPS exhibited a significant anticoagulant activity in vitro.

Key words: Bifidobacterium; exopolysaccharides; extraction; purification; anticoagulation

中图分类号：Q939.99 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）23-0129-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201423026

微生物能够产生多种类型的多糖，根据其与细胞壁的相对位置可以分为：荚膜多糖和胞外多糖[1-2]。胞外多糖（exopolysaccharides，EPS）是细菌在生长过程中分泌到细胞外的长链多糖，可以松散地附着在菌体表面或者完全释放到环境中[3]。EPS属于微生物的次级代谢产物，并不作为产生菌的能源物质。EPS具有生物防御功能，例如：抗干燥、抵抗原生动物的吞噬及噬菌体的浸染、拮抗渗透胁迫等；此外，EPS还具有细胞识别、表面黏附、形成生物被膜促进菌体定植的功能[4-5]。乳酸菌EPS在水溶液里具有增稠和凝胶的特性，能够改善发酵乳的质地，且乳酸菌具有公认的安全性，其产生的EPS可以替代工业增稠剂、凝胶剂和稳定剂广泛用于食品配方中[6]。20世纪40年代开发出的由肠膜明串珠菌产生的右旋糖酐是最早被开发利用的乳酸菌EPS，也是FDA批准的第一种可用于食品的微生物EPS[7]。众多研究表明藻类多糖和真菌多糖具有抗凝血功能，对凝血酶原、凝血酶、白陶土部分凝血活酶进行测定，发现多糖在凝血过程中能显著延长这些酶和酶原凝血时间，且与剂量呈正相关[8-11]。乳酸菌EPS是否同样具有抗凝血活性有待进一步验证。

双歧杆菌RH菌株源自世界长寿之乡——广西巴马瑶族自治县长寿老人肠道，由实验室分离并保存。菌株经生理化实验和16S rDNA序列分析，鉴定为动物双歧杆菌（Bifidobacterium animalis）。该菌株能够产生水溶性EPS，其基因组信息（GenBank登录号：CP007755.1）也表明该菌株具有EPS生物合成特性[12]。前期研究表明该胞外多糖具有修复肠黏膜损伤、引起肠黏膜免疫调节、平衡肠道菌相等功能[13]，还具有体内体外的抗氧化活性[14]。因此，对EPS生物活性的研究具有重要意义。

本实验采用酶解法和凝胶柱层析对双歧杆菌RH EPS进行提取纯化，得到纯度较高的EPS，探究EPS体外抗凝血活性。研究结论丰富了现有双歧杆菌EPS功能，并为新型保健品开发提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 菌种与培养基

动物双歧杆菌（Bifidobacterium animalis RH）：由本实验室分离并保存。

兔血：采自新西兰大耳白兔，SPF级成年雄性4 kg。

脱脂乳培养基：脱脂乳粉120 g，蒸馏水1 L，充氮气，105 ℃灭菌10 min。

1.2 试剂

碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶 美国Sigma公司；胰蛋白酶 美国Amresco公司；中性蛋白酶 北京Solarbio公司；风味蛋白酶 江苏锐阳生物技术公司；凝血酶原时间（prothrombintime，PT）测定试剂盒、活化部分凝血活酶时间（activated partial thromboplastin time，APTT）测定试剂盒、凝血酶时间（thrombin time，TT）测定试剂盒 美国太平洋公司；其余试剂均为分析纯。

1.3 仪器与设备

DHL-A电脑恒流泵、BS-100A自动部分收集器 上海青浦沪西仪器厂；FD-1D冷冻干燥机 北京博医康实验仪器有限公司；Tskgel G4000 PWXL凝胶色谱柱 日本
Tosoh公司；DAWN HELEOSⅡ多角度激光散射仪、Optilab rex示差检测器 美国怀雅特技术公司；ACL TOP700自动血凝仪 美国贝克曼库尔特公司。

1.4 方法

1.4.1 产糖发酵

菌种在脱脂乳培养基中活化3 代，取对数末期培养液接种至新鲜无菌脱脂乳培养基，接种量为107 CFU/mL，于37 ℃厌氧发酵60 h。

1.4.2 酶解法除蛋白条件优化

按照1.4.1节所述发酵液用4 层医用纱布过滤，去除酸沉酪蛋白块。过滤液100 ℃加热5 min，8 000 r/min离心10 min，取上清液进行酶解实验。

1.4.2.1 不同蛋白酶酶解效率

根据每种蛋白酶最佳反应条件（表1）调节发酵上清液pH值（胃蛋白酶处理组选用发酵上清液pH值），添加2 mg/mL蛋白酶，最佳反应温度下酶解90 min，沸水浴灭酶5 min，8 000 r/min离心10 min保留上清液；上清液用8 000～12 000 D透析袋，4 ℃透析48 h；添加3 倍体积无水乙醇，4 ℃沉淀过夜；沉淀用原体积蒸馏水复溶，检测蛋白质含量，计算蛋白去除率。对照组除不添加蛋白酶外，其他操作与实验组相同。三氯乙酸处理组，向发酵上清液中添加4%三氯乙酸，4 ℃沉淀2 h，8 000 r/min离心10 min保留上清液，透析、醇沉、复溶步骤同上。

式中：A0为对照组蛋白质含量/（mg/mL）；An为实验组蛋白质含量/（mg/mL）。

表 1 不同蛋白酶性质及酶活力

Table 1 Protease characteristics and enzyme activities

1.4.2.2 蛋白酶添加量对酶解效率的影响

调节发酵上清液pH值为7.5，分别添加1、2、4、6、8、10 mg/mL复合蛋白酶，中性蛋白酶与胰蛋白酶复合质量比（简写为m（中）∶m（胰），下同）为1∶1，45 ℃酶解90 min，沸水浴灭酶5 min，8 000 r/min离心10 min保留上清液，透析、醇沉、复溶步骤同上，检测蛋白质含量，计算蛋白去除率。

1.4.2.3 酶解时间对酶解效率的影响

调节发酵上清液pH值为7.5，添加3 mg/mL中性蛋白酶和胰蛋白酶复合酶，m（中）∶m（胰）＝1∶1，45 ℃酶解60、90、120、150、180 min，沸水浴灭酶5 min，8 000 r/min离心10 min保留上清液，透析、醇沉、复溶步骤同上，检测蛋白质含量，计算蛋白去除率。

1.4.2.4 酶解条件优化正交试验

根据单因素试验结果，将中性蛋白酶和胰蛋白酶复合使用。选取酶的添加量、酶解时间、pH值、酶的复合比例4 个因素，各取3 个水平，以蛋白去除率为指标，进行四因素三水平的正交试验。

1.4.3 EPS分离提取

选取正交试验最优条件进行酶解，反应结束沸水浴灭酶5 min，冷却后8 000 r/min离心10 min；上清液中加入3 倍体积无水乙醇，4 ℃沉淀过夜，沉淀用少量蒸馏水复溶，8 000～12 000 D透析袋4 ℃透析48 h，真空冷冻干燥后获得EPS粗品，避光干燥保存。

1.4.4 EPS纯化

EPS用蒸馏水配制成5 mg/mL糖液，0.45 μm水系滤膜过滤后进行Sepharose CL-6B凝胶柱层析，上样量为4 mL用0.05 mol/L NaCl恒速洗脱，洗脱速率为
0.8 mL/min，每管8 mL部分收集，逐管检测多糖含量（苯酚-硫酸法[15]测定A490 nm），按多糖含量检测值收集峰值管，8 000～12 000 D透析袋透析并冷冻干燥。

1.4.5 EPS鉴定

利用凝胶色谱结合多角度激光散射仪检测EPS纯度和分子质量。将EPS纯品用0.1 mol/L NaNO3配制成2 mg/mL的溶液，进样量200 μL。色谱条件：凝胶柱色谱柱Tskgel G4000 PWXL（78 mm×300 mm），DAWN HELEOSⅡ型多角度激光散射仪，Optilab rex型示差检测器；柱温25 ℃，流动相0.1 mol/L NaNO3溶液，流速0.5 mL/min。

1.4.6 EPS体外抗凝血活性评价

兔耳缘静脉取血，按9∶1比例收集于含3.8 g/100 mL的枸橼酸钠抗凝剂管中。轻轻混匀，3 000 r/min离心15 min，取血清用于凝血活性实验。

检测PT、APTT、TT，向360 µL血清中添加高、中、低不同质量浓度EPS样品各40 µL，使EPS终质量浓度分别为1.0、1.5、2.0 mg/mL，37 ℃孵育10 min，自动凝血仪检测凝血时间，以血清样品作对照[16-17]。

2 结果与分析

2.1 酶解法除蛋白单条件优化

2.1.1 不同蛋白酶酶解效率

不同蛋白酶的酶切位点不同，针对不同底物，不同蛋白酶的酶解效率也存在差异。实验选取6 种蛋白酶对双歧杆菌发酵上清液进行酶解，不同蛋白酶的蛋白去除率见图1。

小写字母不同代表差异显著（P＜0.05）。下同。

图 1 不同蛋白酶酶解效率

Fig.1 Hydrolysis efficiency of different proteases

三氯乙酸处理组蛋白质去除率最高。在不同的蛋白酶处理组中，碱性蛋白酶的酶解效率最高，但需要较高的pH值条件才能发挥活性。中性蛋白酶对酪蛋白的水解能力很强，胰蛋白酶对乳清蛋白的水解能力较强；脱脂乳培养基中酪蛋白和乳清蛋白的含量较高，文献[18]报道将中性蛋白酶和胰蛋白酶复合使用能够提高乳蛋白的水解效率；实验验证复合酶解效率大于两种酶单一使用的效率。胃蛋白酶的酶活力很高，但是酶解效率较低，可能与酶解的pH值条件有关；产糖发酵上清液的pH值为4.53，为保证多糖稳定性未将发酵上清液的pH值调至胃蛋白酶的最佳pH值，从而影响胃蛋白酶的活性。综合酶解效率、反应最适温度和pH值条件，选取中性蛋白酶和胰蛋白酶进行后续实验。

2.1.2 酶添加量的影响

蛋白酶的添加量是影响酶解效率的重要因素。酶添加量不足，酶被底物饱和，酶解效率低；酶过量，则向溶液引入过多外源蛋白。将中性蛋白酶和胰蛋白酶按照1∶1的复合质量比例进行添加，不同酶添加量对酶解效率的影响见图2。

图 2 不同蛋白酶添加量酶解效率

Fig.2 Hydrolysis efficiency of different proteases at various addition amounts

由图2可知，添加1 mg/mL蛋白酶，酶量不足，酶解效率偏低；添加2 mg/mL蛋白酶，酶解效率最高；添加量超过4 mg/mL，外源蛋白引入量加大，残留蛋白含量增加。所以，蛋白酶添加量在2～4 mg/mL最佳。

2.1.3 酶解时间的影响

图 3 不同酶解时间酶解效率

Fig.3 Hydrolysis efficiency of mixture of neutral protease and trypsin as a function of hydrolysis duration

按m（中）∶m（胰）＝1∶1的比例添加3 mg/mL蛋白酶，分别酶解60、90、120、150、180 min，定期取样灭活，透析后测定蛋白去除率。由图3可知，延长酶解时间能够提高蛋白去除率，但长时间的处理可能会影响多糖保留率及活性，应兼顾节能高效选取最佳作用时间。

2.1.4 正交试验优化

由单因素试验结果可知，蛋白酶最佳添加量在2～4 mg/mL，延长酶解时间可以提高蛋白去除率。中性蛋白酶最佳pH值为7.0，胰蛋白酶最佳pH值为8.0。选择酶的添加量、酶解时间、pH值、酶的复合比例，各取三水平，以蛋白去除率为指标进行正交试验。

表 2 酶解条件正交试验优化方案及结果

Table 2 Orthogonal array design with experimental results for optimization of enzymatic hydrolysis conditions

根据表2直观分析可知，各因素对蛋白质去除效果的影响由大到小依次为：酶的添加量＞m（中）∶m（胰）＞
酶解时间＞pH值。根据各因素各水平均值确定酶解条件的最优组合是A1B2C2D3，即按照m（中）∶m（胰）＝1∶2，添加量2 mg/mL，在pH 7.5的条件下酶解120 min。方差分析结果表明，因素A和D的P值＜0.05，即因素A和D
对试验结果有显著影响。因此因素A和D为主要因素，B和C为次要因素，直观分析结果可信。

因中性蛋白酶酶解最适温度在40 ℃左右，胰蛋白酶酶解最适温度为45 ℃，在单因素试验中，酶解温度40～50 ℃的范围对酶解效果的影响很小，结合两种酶的特性，确定酶解温度为45 ℃。

2.2 凝胶柱层析纯化

凝胶柱层析具有分子筛的作用，可根据分子质量不同或聚合度不同将混合物分离开。利用Sepharose CL-6B凝胶柱对EPS进行分离纯化。EPS在Sepharose CL-6B凝胶柱上洗脱曲线如图4所示，洗脱曲线呈现单一的对称峰，峰型完整无拖尾现象，说明其为分子质量均一的单一组分。收集峰值管的洗脱液，透析后冷冻干燥即为EPS纯品，用于后续纯度和分子质量测定。

图 4 EPS Sepharose CL-6B凝胶柱层析洗脱曲线

Fig.4 Gel permeation chromatography of EPS on Sepharose CL-6B column

2.3 EPS纯度和分子质量

多糖的分子质量只代表链长的平均分布，利用不同方法测得多糖分子质量的结果也有较大差别。实验利用凝胶色谱结合多角度激光散射仪（gel permeation chromatography multiangle laser light scattering，GPC/MALLS）检测多糖分子质量及分布。双歧杆菌EPS凝胶色谱如图5所示，第1个峰是大分子颗粒峰，但该峰只有激光值，没有示差值，代表该物质浓度很低。第2个峰是多糖峰，且三氯乙酸纯化的EPS经GPC/MALLS检测峰型与此相同，激光值与示差值相继出峰，示差峰与紫外峰同步，推测该EPS为糖蛋白。后续的小峰是杂质峰。

图 5 EPS GPC/MALLS凝胶色谱

Fig.5 GPC/MALLS of EPS

表 3 EPS纯度及分子质量

Table 3 Molecular weight and purity of EPS

由表3可知，利用凝胶色谱结合多角度激光散射仪测得双歧杆菌RH所产EPS的分子质量为5.946×104 D，根据积峰值计算纯度为97.045%。三氯乙酸纯化EPS分子质量为5.607×104 D，两种去蛋白方法对EPS分子质量的影响较小，蛋白酶并未降解糖苷键。

Mw/Mn的值为多糖多分散系数（d），其大小是判断样品摩尔质量分布是否均匀的指标。样品分子大小均一时，d值应比较小或接近1.0，表3显示EPS的多分散系数为1.231，进一步说明双歧杆菌EPS是宽分散的。

2.4 EPS体外抗凝血活性评价结果

凝血的过程包括：凝血酶原激活物的形成，凝血酶的形成，进一步促进纤维蛋白的形成[19]。根据凝血酶原激活物形成的途径和参与因子，可将凝血分为内源性凝血和外源性凝血两条途径。内源性凝血，参与凝血的全部因子来源于血浆；外源性凝血，启动源于组织因子。PT、APTT、TT作为评价血液凝固能力的指标，其中PT反映外源凝血系统状况，APTT反映内源凝血系统状况。

表 4 不同质量浓度EPS体外抗凝血活性

Table 4 Anticoagulant activity of EPS with different concentrations in vitro

注：*.与对照组相比，P＜0.05；**.与对照组相比，P＜0.01。

由表4可知，不同质量浓度EPS可以显著延长APTT和TT，且具有剂量依赖效应，但对PT没有延长作用。说明EPS具有一定的抗凝血活性，主要参与内源凝血途径，并且进一步抑制凝血酶介导的纤维蛋白的形成来发挥抗凝血功效。

3 结 论

多糖提纯的第一步是除蛋白，已报道的多糖除蛋白方法多为化学试剂法[20-21]。该方法不仅大量消耗有机试剂，多次、长时间处理可能会影响多糖的生物活性，并且残留的化学试剂存在安全隐患，也不符合食品和保健品生产规范。本实验尝试利用酶解法降解蛋白，使之酶解为分子质量较小的多肽或氨基酸，最后通过乙醇沉淀和透析除去保留在溶液中的多肽和氨基酸，由此达到去除蛋白的目的。实验结果表明，复合酶解法对乳蛋白的水解效果较好，可以替代有机试剂法作为EPS的纯化方法。

肝素是临床上广泛应用的抗凝剂，但肝素多来源于动物组织和脏器，可能携带致敏原或致病微生物对患者造成危害[22]。此外，肝素还容易造成自发性出血和血小板减少症，寻找更加安全有效的肝素替代物成为研究热点。血浆中添加抗凝剂，若PT、TT大于正常范围3 s，APTT大于正常范围10 s，被认为可以延长凝血时间具有抗凝效果[23]。实验证明双歧杆菌RH EPS可显著延长APTT和TT，具有一定的体外抗凝血活性，主要参与內源凝血途径，这与肝素的作用机理相似。前期研究表明，该EPS含有糖醛酸[13]，D-葡萄糖醛酸又是构成肝素、硫酸软骨素、透明质酸的成分，所以EPS具有抗凝血活性可能与其含有糖醛酸有关。双歧杆菌RH EPS具有一定的体外抗凝血活性为进一步研究乳酸菌EPS的药用价值提供了依据，但其具体的抗凝血机制有待进一步的体内实验验证。

参考文献：

[1] SUTHERLAND I W. Novel and established applications of microbial polysaccharides[J]. Trends in Biotechnology, 1998, 16(1): 41-46.

[2] de VUYST L D, de VIN F, VANINGELGEM F, et al. Recent developments in the biosynthesis and applications of heteropolysaccharides from lactic acid bacteria[J]. International Dairy Journal, 2001, 11(9): 687-707.

[3] RUAS-MADIEDO P, HUGENHOLTZ P, ZOON P. An overview of the functionality of exopolysaccharides produced by lactic acidbacteria[J]. International Dairy Journal, 2002, 12(2/3): 163-171.

[4] LOOIJESTEIJN P J, TRAPET L, VRIES E, et al. Physiological function of exopolysaccharides produced by Lactococcus lactis[J]. International Journal of Food Microbiology, 2001, 64(1/2): 71-80.

[5] WHITFIELD C, VALVANO M A. Biosynthesis and expression of cell surface polysaccharides in gram-negative bacteria[J]. Advances in Microbiology and Physiology, 1993, 35: 135-146.

[6] ISMAIL B, NAMPOOTHIRI K M. Production, purification and structural characterization of an exopolysaccharide produced by a probiotic Lactobacillus plantarum MTCC 9510[J]. Archives of Microbiology, 2010, 192(12): 1049-1057.

[7] STAAT R H, GAWRONSKI T H, SCHACHTELE C F. Detection and preliminary studies on dextranase-producing microorganisms from human dental plaque[J]. Infection and Immunity, 1973, 8(6): 1009-1016.

[8] MATSUBARA K, MATSUURA Y, BACIC A, et al. Anticoagulant properties of a sulfated galactan preparation from a marine green alga Codium cylindricum[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2011, 28(5): 395-399.

[9] MAJDOUB H, ROUDESLI M S, MANSOUR M B. Anticoagulant activity of a sulfated polysaccharide from the green alga Arthrospira platensis[J]. Biochimica et Biophysica Acta, 2009, 1790(10): 1377-1381.

[10] 汪艳秋, 刘宪丽, 刘东颖, 等. 刺松藻多糖抗凝血及抗血栓作用的研究[J]. 安徽医药, 2011, 15(7): 804-806.

[11] MOURAO P A, YOON S J, YU M A, et al. The nontoxic mushroom Auricularia auricula contains a polysaccharide with anticoagulant activity mediated by antithrombin[J]. Thrombosis Research, 2003, 112(3): 151-158.

[12] 刘丽莎, 范熠, 旭日花, 等. 动物双歧杆菌RH胞外多糖基因簇的克隆及分析[J]. 食品科学, 2013, 34(15): 136-142.

[13] 旭日花. 双歧杆菌胞外多糖的结构解析及调节肠黏膜免疫功能研究[D]. 北京: 中国农业大学, 2011.

[14] XU Rihua, SHANG Nan, LI Pinglan. in vitro and in vivo antioxidant activity of exopolysaccharide fractions from Bifidobacterium animalis RH[J]. Anaerobe, 2011, 17(5): 226-231.

[15] DUBOIS M, GILLES K, HAMILTON J K, et al. Colorimetric method for determination of sugar and related substances[J]. Analytical Chemistry, 1956, 28(3): 350-365.

[16] CAI Weirong, XIE Liangliang, CHEN Yong, et al. Purification, characterization and anticoagulant activity of the polysaccharides from green tea[J]. Carbohydrate Polymers, 2013, 92(2): 1086-1090.

[17] 杨曦明, 范聪, 李慧萍, 等. 白树花多糖硫酸酯的抗凝血活性研究[J]. 中国实验诊断学, 2010, 14(7): 1031-1034.

[18] 齐世宇. 酶水解法降低乳蛋白致敏性的研究[D]. 北京: 中国农业大学, 2012.

[19] MACFARLANE R G. An enzyme cascade in the blood clotting mechanism, and its function as a biochemical amplifier[J]. Nature, 1964, 202: 498-499.

[20] PAULO E, BOFFO E F, BRANCO A, et al. Production, extraction and characterization of exopolysaccharides produced by the native Leuconostoc pseudomesenteroides R2 strain[J]. Anais da Academia Brasileira de Ciências, 2012, 84(2): 495-507.

[21] DABOUR N, LAPOINTE G. Identification and molecular characterization of the chromosomal exopolysaccharide biosynthesis gene cluster from Lactococcus lactis subsp. cremoris SMQ-461[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2005, 71: 7414-7425.

[22] CHARLES H B. Heparin and thrombosis[J]. British Medical Journal, 1938, 2: 977-981.

[23] 朱立华. 实验诊断学[M]. 北京: 北京医科大学出版社, 2002: 144-146.