重组枯草芽孢杆菌PaE菌株的构建及
碳代谢阻遏效应研究

李元召,孙俊良*,梁新红,张永帅

(河南科技学院食品学院,河南 新乡 453003)

 

要:通过基因重组的方法,将枯草芽孢杆菌168的α-淀粉酶基因amyE(除掉启动子)整合在Paxo1质粒上,然后将重组表达质粒Paxo1-amyE导入枯草芽孢杆菌168菌株基因组中的半乳糖苷酶基因lacZ位点。通过转化筛选和重组基因分析,获得含有重组α-淀粉酶基因的工程菌株PaE。经过添加4 种不同的碳源发酵实验检测,在外加2 g/100 mL木糖诱导的情况下,重组菌株的α-淀粉酶产量均有增加。而且重组菌株在一定程度上能够克服葡萄糖等还原性糖引起的碳代谢阻遏现象,提高了α-淀粉酶产量。

关键词:α-淀粉酶;枯草芽孢杆菌;基因重组;木糖

 

Construction and Carbon Catabolite Repression of Recombinant Bacillus subtilis PaE

 

LI Yuan-zhao, SUN Jun-liang*, LIANG Xin-hong, ZHANG Yong-shuai

(School of Food Science, Henan Institute of Science and Technology, Xinxiang 453003, China)

 

Abstract: Using gene recombination method, the alpha amylase gene amyE (without promoter) of Bacillus subtilis was integrated into Paxo1 plasmid and the galactosidase gene lacZ of B. subtilis strain 168 was introduced into the recombinant expression plasmid Paxo1-amyE. After transformation and screening analysis, genetically engineered strain PaE containing the recombinant alpha amylase gene was selected. With the addition of four different carbon sources, the alpha amylase production by the recombinant strain was promoted under the induction of 2 g/100 mL xylose. In addition, the recombinant strain could overcome the carbon catabolic repression caused by reducing saccharides such as glucose to a certain extent to improve the yield of alpha amylase.

Key words: α-amylase; Bacillus subtilis; genetic recombination; xylose

中图分类号:Q789 文献标志码:A 文章编号:1002-6630(2014)23-0134-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201423027

α-淀粉酶,即α-1,4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶(α-1,4-glucan-glucan hydrolase)EC 3.2.1.1,是一种内切酶,它能水解淀粉分子中的α-1,4糖苷键,将其随机切成长短不一的短链糊精和低分子质量糖类[1]。α-淀粉酶是一种十分重要的酶制剂,它被大量应用于粮食加工、食品工业、酿造、发酵、纺织品工业和医药行业中,占了整个酶制剂市场份额的四分之一[2],具有很好的应用前景。

目前自然界中存在的野生型菌株产中温α-淀粉酶的能力很低,在工业化生产所使用的菌株大多是由野生菌株经过诱变得到的突变株。但是,菌株的诱变育种存在周期长、工作量大等缺点,所以利用分子生物学技术构建有效的突变体就成为了获得高产菌株的有效途径[3-4]。

发酵底物中葡萄糖等还原性糖的存在会对枯草芽孢杆菌发酵产物产生阻遏现象。Schumacher等[5]对调节碳代谢阻遏的调控机制进行了简单的报道,但对淀粉酶的代谢调控并未给出明确的解释。谢光蓉等[6]利用基因重组方法成功构建的重组枯草芽孢杆菌能够高效分泌中温α-淀粉酶,这为淀粉酶的工业化生产提供了理论依据。因此本实验利用基因重组技术,构建一株含有木糖启动子的重组枯草芽孢杆菌[7],由于该表达系统包含木糖操纵子元件,木糖诱导下可以增强Paxo1质粒中xylR基因的表达[8]。本实验中构建的重组菌株能够在一定程度上缓解发酵液中还原性糖对发酵产物产生阻遏的现象,同时为后续研究枯草芽孢杆菌发酵生产α-淀粉酶中碳代谢阻遏现象分子机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和质粒

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168模式菌株购自中国工业微生物菌种管理保藏中心;整合质粒Paxo1来源于河南科技学院食品学院微生物实验室冷藏保存。

1.1.2 酶和试剂

Taq DNA聚合酶、细菌基因组提取试剂盒、DNA凝胶试剂盒 生工生物工程(上海)股份有限公司;质粒DNA小剂量制备试剂盒(离心柱型) 上海捷瑞生物工程有限公司;dNTP、Prime STAR HS DNA Polymerase、核酸限制性内切酶NotⅠ、SacⅠ、分子质量标准(2 000 bp和500~12 000 bp)、T4 DNA连
接酶 日本TaKaRa公司;氨苄青霉素(Amp)、红霉素(erm) 美国Sigma公司;其余试剂均为分析纯。

1.1.3 仪器与设备

Bio-Rad电转化仪、琼脂糖凝胶电泳系统 北京市六一仪器厂;D-37520高速冷冻离心机 德国Sigma公司;T-Gradient PCR热循环仪 德国Biometra公司;WFJ 7200紫外分光光度计 上海尤尼柯仪器有限公司;GeIX1650凝胶图像分析系统 上海欧翔科学仪器有限公司。

1.1.4 培养基

LB液体培养基:蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、NaCl 5 g/L,磁力搅拌器搅拌均匀后分装50 mL培养基于250 mL三角瓶中高压灭菌处理。LB固体培养基:向液体培养基中添加2 g/100 mL琼脂高压灭菌后冷却后使用。发酵培养基(g/L):玉米粉20、黄豆饼粉15、氯化钙0.2、硫酸镁0.2、磷酸氢二钾2、柠檬酸钠2、硫酸铵0.75、磷酸氢二钠2。调节pH值至7.0后分装20 mL于100 mL三角瓶中高压灭菌处理。枯草芽孢杆菌感受态相关培养基GM:LB+0.5 mol/L山梨醇,ETM:0.5 mol/L山梨醇+0.5 mol/L
甘露醇+10%甘油,RM:LB+0.5 mol/L山梨醇+
0.38 mol/L甘露醇。

1.2 方法

1.2.1 α-淀粉酶基因(amyE)的克隆以及重组质粒Paxo1-amyE的构建

按照GenBank上提供的枯草芽孢杆菌α-淀粉酶基因序列设计引物,其中上游引物为P1:5’-CATGGATCCATGTTTGCAAAACGATTCAA-3’,下游引物序列为P2:5’-CATGCGGCCGCTCAATGGGGAAGAGAAT-3’。其中在P1中引入NotⅠ酶切位点,在P2中引入HindⅢ酶切位点。利用细菌基因组提取试剂盒提取枯草芽孢杆菌基因组DNA,以该基因组为模板,采用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术扩增amyE基因序列。PCR扩增体系:5×Prime STAR Buffer 10.0 μL,dNTP mixture 4.0 μL,P1 1.0 μL,P2 1.0 μL,Primer STAR HS DNA聚合酶0.5 μL,ddH2O 32.5 μL,DNA模板1 μL。反应参数:94 ℃预变性5 min,94 ℃变性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,28 个循环数。将PCR产物用NotⅠ和HindⅢ双酶切,Paxo1质粒用NotⅠ和SacⅠ双酶切,酶切产物16 ℃过夜连接。连接产物转化E. coli DH5α中,在含有100 µg/mL的氨苄青霉素(Amp)抗性平板上筛选阳性转化子并加以验证。其中利用Primer 5.0软件设计验证引物,上游引物P3:5’-GCAAAGTCCCCCTGTTACGA-3’,下游引物P4:5’-TGAACAATCCAAAAGCGGGC-3’。相关基因操作技术参考文献[9-10]。

1.2.2 枯草芽孢杆菌感受态制备

采用Xue Gangping等[11]方法,挑取新鲜固体LB平板中的枯草芽孢杆菌单菌落接种于5 mL的LB培养基中,37 ℃、190 r/min过夜培养,测定管内OD600 nm值,控制好接种量使得接种后的培养基OD600 nm值在0.1~0.25之间,培养基为50 mL的GM。然后37 ℃、200 r/min培养至OD600 nm值约为1.0(大约3~4 h),用预冷的电转液ETM洗涤菌体,4 ℃、5 000 r/min离心8 min去上清液,如此反复4 次。将洗涤后的菌体重悬于500 μL的ETM中,每支1.5 mL离心管分装60 μL,置于-80 ℃保存。

1.2.3 重组枯草芽孢杆菌α-淀粉酶工程菌株构建及阳性克隆筛选

以枯草芽孢杆菌168菌株作为宿主,将6 μL的质粒Paxo1采用电转化的方法导入,在含有50 µg/mL的红霉素(erm)的固体LB培养基上37 ℃过夜培养筛选,将获得阳性克隆。用无菌牙签挑取单克隆均匀点种在无抗生素压力的含有2 g/100 mL可溶性固体LB平板上,同时点种原始菌株做空白。37 ℃培养48 h后或将平板放在4 ℃培养72 h,迅速将平板置于37 ℃水浴环境保温10 min,用碘-碘化钾(I2-KI)溶液浸泡0.5 h,测量淀粉水解圈与菌落直径的比值[12]。

1.2.4 重组枯草芽孢杆菌α-淀粉酶的酶活力[13]

从平板上筛选水解圈最大的菌落转接于20 mL的LB培养基中过夜活化。然后按2%的接种量接种于100 mL的发酵培养基中,其中碳源分别用葡萄糖、糖原、麦芽糊精和可溶性淀粉。37 ℃、210 r/min发酵培养72 h,期间在培养12 h后添加2 g/100 mL木糖诱导,每隔6 h取样离心留上清液,进行活性测定。

淀粉标准曲线绘制:分别配制0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 g/L的可溶性淀粉溶液,分别准确量取1 mL于10 支试管中,每支试管加入5 mL的稀碘液,测定OD660 nm,以OD660 nm为横坐标、淀粉质量浓度为纵坐标得标准曲线y=1.428 3x-0.093 5(R2=0.999 5)。

酶活力测定的反应体系:取10 mL试管,依次加入4 mL 2 g/100 mL可溶性淀粉溶液,1 mL pH 6.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液,60 ℃条件下预热5 min。然后加入稀释过的200 μL酶液,混匀,60 ℃准确保温5 min。加入1 mL 1 mol/L HCl终止反应后放在冰上。吸取1 mL混合反应液与5 mL稀碘液显色,测定OD660 nm,以蒸馏水代替酶液测定的结果作为对照。计算酶活力,所得的结果保留整数。

X=KΔOD660 nm×(0.062/5/0.2)×n×60

=0.372nKΔOD660 nm

式中:ΔOD660 nm为对照液的光密度值减去反应液的光密度值;X为样品的酶活力/(U/mL);n为样品的稀释倍数;K为1.428 3;0.062为混合反应液总体积/L;5为反应时间/min;0.2为反应的酶液量/mL;60为时间/min。

酶活力单位定义:1 mL液体酶于60 ℃、pH 6.0条件下,1 h液化1 g可溶性淀粉为一个活力单位,用
U/mL表示。

1.2.5 重组枯草芽孢杆菌PaE蛋白的活性电泳分析[14-15]

取发酵培养48、60、72 h的重组枯草芽孢杆菌PaE分泌的淀粉酶初纯化后分别进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)凝胶电泳和PAGE凝胶电泳。其中10%分离胶,5%浓缩胶,电泳结束后固定、染色和脱色后将胶片置于凝胶图像分析系统中照相,分析蛋白表达量的差异性。

1.2.6 发酵底物中不同碳源对重组枯草芽孢杆菌PaE分泌α-淀粉酶活力的影响[16]

在发酵培养的过程中利用麦芽糊精、糖原、葡萄糖和可溶性淀粉作为碳源。发酵培养12 h后添加2 g/100 mL木糖进行诱导,发酵72 h后测定淀粉酶活力,以不加木糖的发酵培养液为空白,来检测重组枯草芽孢杆菌PaE菌株是否在一定程度上克服了代谢阻遏现象。

2 结果与分析

2.1 α-淀粉酶基因的克隆以及重组表达载体PaE的构建

以枯草芽孢杆菌168基因组DNA为模板,PCR扩增获得amyE基因,用1%琼脂糖凝胶电泳验证结果见图1。将PCR扩增获得的amyE基因和枯草芽孢杆菌整合质粒Paxo1经过相同的双酶切后连接转化构建重组质粒Paxo1-amyE,该质粒的酶切验证及电泳图谱见图2、3。将测序报告中提供的amyE基因序列与GenBank枯草芽孢杆菌α-淀粉酶基因序列对比,序列的同源性为98%,基本一致。

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1.淀粉酶的PCR产物;M. DNA Marker。

图 1 枯草芽孢杆菌α-淀粉酶(amyE)基因PCR产物凝胶电泳图

Fig.1 Agarose gel electrophoresis of PCR product of α-amylase gene amyE

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1. Paxo1酶切产物;2. amyE基因酶切产物;M. DNA Marker。

图 2 重组表达质粒Paxo1-amyE酶切产物凝胶电泳验证图谱

Fig.2 Agarose gel electrophoresis for digested products of plasmid Paxo1 and amyE gene

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1、3、5. 重组菌株PaE的PCR验证结果;M1. 1 500~12 000 bp Marker;M2. 2 000 bp Marker。

图 3 重组表达载体PaE利用PCR产物凝胶电泳验证图谱

Fig.3 Agarose gel electrophoresis of PCR product of plasmid PaE

2.2 重组枯草芽孢杆菌高效分泌表达α-淀粉酶基因工程菌筛选

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a

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b

 

a.重组枯草芽孢菌PaE菌株;b.野生型枯草芽孢杆菌168菌株。

图 4 含有2 g/100 mL可溶性淀粉固体发酵培养基水解圈筛选

Fig.4 Hydrolysis circle screening on solid fermentation medium containing 2 g/100 mL soluble starch

将重组表达质粒通过电转化的方法导入枯草芽孢杆菌模式菌株168感受态细胞中,由于重组质粒中含有红霉素抗性基因片段,经过红霉素抗性平板筛选后可以得到正确重组菌株。挑取正确的单克隆转接于含有2.0 g/100 mL淀粉的固体LB平板上进行后扩大培养,以野生型菌株作为对比,37 ℃培养48 h后,滴加I2-IK溶液,直到明显的淀粉水解圈出现(图4)。用水解圈面积与菌落面积之比进行菌株产酶高低的粗筛。

在蛋白分离胶中加入10 g/100 mL的可溶性淀粉,最终质量浓度为1 g/100 mL,经过α-淀粉酶的SDS-starch-PAGE活性电泳检测[17],即条带的明亮程度反映了淀粉的分解程度。重组菌株蛋白表达量明显高于野生型
(图5),这为筛选高效分泌表达α-淀粉酶菌株提供了进一步有力的依据。

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A.重组PaE菌株产α-淀粉酶;B.野生型菌株产α-淀粉酶。

图 5 枯草芽孢杆菌产α-淀粉酶活性PAGE凝胶电泳图

Fig.5 PAGE of α-amylase from recombinant and wild strains

2.3 重组枯草芽孢杆菌PaE菌株重组蛋白的SDS-PAGE分析

采用DEAE-52阴离子交换柱(2 cm×20 cm)对重组枯草芽孢杆菌PaE分泌的α-淀粉酶进行分离纯化。具体操作方法:采用10 mmol/L的Tris-HCl缓冲液(含2 mmol/L
CaCl2,pH 8.4)进行平衡,上样后使用含有0~1 mol/L
NaCl的同样缓冲液进行梯度洗脱。收集各组分并测定其在280 nm波长处的光密度值,将同一个峰组分合并透析脱盐后进行活性测定。电泳结果(图6)显示约在58 kD处有明显的目的蛋白质条带,和理论分子质量大小基本一致。木糖诱导72 h后α-淀粉酶的表达量较大。

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图 6 重组枯草芽孢杆菌PaE菌株不同培养时间的α-淀粉酶
SDS-PAGE电泳

Fig.6 SDS-PAGE of α-amylase from PaE strain at different culture time points

2.4 发酵底物中不同碳源对重组枯草芽孢杆菌PaE菌株产α-淀粉酶的影响

摇瓶发酵培养12 h后添加2 g/100 mL木糖诱导,37℃、210 r/min培养72 h后取发酵上清液初纯化后进行酶活力测定。经过3 次平行测定后含有麦芽糊精、可溶性淀粉、糖原、葡萄糖和空白对照的发酵摇瓶中测定的平均酶活力依次为(749±23)、(326±18)、(710±12)、(332±13)U/mL和(104±8)U/mL。未经过木糖诱导的野生型菌株酶活力依次为(620±4)、(277±9)、(474±5)、(71±6)U/mL和(125±4) U/mL,利用SPSS Statistics 17.0软件对数据进行显著性方差分析,两者有显著性差异(P<0.05)。

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图 7 不同碳源和添加木糖诱后对重组菌株PaE产α-淀粉酶活力的影响

Fig.7 Effects of xylose combined with other carbon sourceson the α-amylase activity of the recombinant strain

由图7可知,在含有4 种不同碳源的发酵液中重组菌株经2 g/100 mL木糖诱导后淀粉酶的表达量均有所增加。麦芽糊精和糖原作为碳源发酵产酶量要优于其他2 种碳源,产酶量分别增加了129 U/mL和236 U/mL。在含有葡萄糖的发酵液中,PaE菌株的酶活力由71 U/mL增加到了332 U/mL。结果显示PaE菌株能够在一定程度上缓解碳代谢阻遏现象,这对工业发酵提供了一定的理论支持。实验中仅选取了4 种不同碳源,其他碳源的影响还需要进一步的研究。

3 讨 论

由于葡萄糖是很多原核微生物生长优先利用的碳源,其分解代谢产物会对许多基因的表达产物产生阻遏或激活作用,往往引起复杂的生理效应[17]。也会阻遏某些酶(特别是参与分解代谢的酶)生物合成的现象,称为分解代谢物阻遏作用(carbon catabolite repression,CCR)。葡萄糖等还原性糖所引起的阻遏效应在枯草芽孢杆菌中已经被广泛研究[18-19]。

应明等[20]利用基因敲除的方法构建ccpA(碳代谢阻遏调控基因)基因缺失的枯草芽孢突变体菌株,很大程度上缓解了此现象,并且使得在10 g/100 mL还原性糖存在的条件下发酵产物核黄素提高了95%。借鉴他人的研究,实验从另一个角度利用基因重组的方法构建了重组菌株PaE。经过摇瓶发酵实验,在4 g/100 mL葡萄糖存在的条件下,α-淀粉酶酶活力从71 U/mL增加到了
332 U/mL。很大程度上缓解了碳代谢阻遏现象,这为后续的进一步研究提供了理论依据。

本实验中发现枯草芽孢杆菌发酵利用麦芽糊精和糖原产生α-淀粉酶的酶活力要高于可溶性淀粉和葡萄糖。虽然在木糖诱导条件下,酶活力均有一定的提高,但是考虑实际生产成本和经济效益,还是选择麦芽糊精进行进一步的研究。实验中仅选取了4 种不同碳源,而对于其他碳源的影响还需要继续不断的探究。

去除掉启动子α-淀粉酶基因amyE在枯草芽孢杆菌中整合表达,与单纯的质粒所携带的基因表达相比较,整合表达具有相对的基因稳定性,不容易发生基因片段的丢失,菌种本身的退化等原因造成的表达水平降低等现象。这同时也为淀粉酶的工业生产提供了一定的研究基础。

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收稿日期:2013-11-26

基金项目:国家自然科学基金面上项目(311641/C200101);河南省科技计划项目(122102110037)

作者简介:李元召(1986—),男,硕士研究生,研究方向为食品生物技术。E-mail:751583202@163.com

*通信作者:孙俊良(1964—),男,教授,博士,研究方向为食品生物技术。E-mail:sjl338@163.com