酶法改善卵白蛋白起泡性

黄 群1，杨万根1，金永国2，陈宏杰2，赵惠云1

（1.吉首大学食品科学研究所，湖南 吉首 416000；2.华中农业大学食品科学技术学院，湖北 武汉 430070）

摘 要：采用碱性蛋白酶对卵白蛋白进行酶法改性处理以改善其起泡性。探讨酶解时间、底物质量分数、酶用量因素对卵白蛋白起泡性和泡沫稳定性的影响，在单因素试验基础上采用Box-Behnken中心组合试验设计优化酶法改性条件。结果表明，碱性蛋白酶酶法改性卵白蛋白改善其起泡性的最佳条件为：酶用量144 000 U/g、底物质量分数1.90%、酶解时间34 min。在此条件下酶法改性后卵白蛋白起泡性达202.0%，为未改性（120%）的1.683 倍。

关键词：卵白蛋白；碱性蛋白酶；酶法改性；起泡性

Enhancing Foaming Properties of Ovalbumin by Enzymatic Modification

HUANG Qun1, YANG Wan-gen1, JIN Yong-guo2, CHEN Hong-jie2, ZHAO Hui-yun1

(1. Institute of Food Science, Jishou University, Jishou 416000, China;

2. College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China)

Abstract: The foaming properties of ovalbumin were enhanced by enzymatic modification with alkaline proteinase. The effects of some reaction conditions such as enzymatic treatment time, substrate concentration and alkaline proteinase concentration on foaming capability and foaming stability of ovalbumin were investigated. Based on single factor experiments, the enzymatic modification conditions were optimized with Box-Behnken experimental design and response surface methodology. The results revealed that the optimal modification conditions were determined as follows: alkaline proteinase concentration 144 000 U/g, substrate concentration 1.90%, and enzymatic treatment time 34 min. Under these conditions, the foaming capability of ovalbumin modified with alkaline proteinase could reach up to 202.0%, which was 1.683 times as higher as that observed for unmodified ovalbumin.

Key words: ovalbumin; alkaline proteinase; enzymatic modification; foaming properties

中图分类号：TS253.4 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）23-0171-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201423034

卵白蛋白（ovalbumin），又称卵清蛋白，为球蛋白水溶液体系——鸡蛋清中含量最多的主要蛋白质，占蛋清蛋白质总量的54%～63%。卵白蛋白为单体、球状磷酸糖蛋白，分子质量为43.0 kD，等电点为4.5，由385 个氨基酸残基组成，其中50%以上为疏水性氨基酸，是蛋清唯一含有埋藏于疏水核心内部的自由巯基的蛋白质，自然卵白蛋白贮存期间转变为热稳定形式：S-卵白蛋白[1]。卵白蛋白具有良好的功能特性，如起泡性、胶凝性、持水性、成膜性和乳化性等，为食品加工中重要的原辅料，通过改性以改善卵白蛋白功能特性可扩大其应用领域[2]。蛋白改性通常采用物理改性如热处理、超高压、微波、超声波、紫外辐照等，化学改性如磷酸化、酰胺化等，酶法和生物工程改性等[3-12]。化学改性因具有副产物和安全性等问题而难以被实际应用，酶法改性具有条件温和、效果显著等优点而备受关注。有研究采用复合酶法改善大豆分离蛋白起泡性，赵欣等采用碱性蛋白酶改性大豆浓缩蛋白，均有较为理想的效果[13-16]，目前尚未见卵白蛋白起泡性酶法改善的相关报道。本实验采用碱性蛋白酶酶法改性以改善提高卵白蛋白起泡性能，在碱性蛋白酶最适作用温度和pH值条件下，在单因素试验基础上通过响应面优化酶法改性提高卵白蛋白起泡性的工艺条件，为扩展卵白蛋白在食品行业中的应用提供理论依据，促进我国蛋制品工业的多元化发展。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜鸡蛋，购于吉首市步步高超市。

碱性蛋白酶（酶活力200万 U/g） 北京奥博星生物技术有限责任公司；硫酸铵、氢氧化钠、浓盐酸等（均为分析纯） 北京鹏彩精细化工有限公司。

1.2 仪器与设备

FJ200-SH型数显高速分散均质器 上海标本模型厂；HJ-3型数显恒温磁力搅拌器 常州振华仪器有限公司；FD5-2.5型冻干机 美国西盟生命技术有限公司；HH-S2型恒温水浴锅 金坛市成辉仪器厂；PHSJ-4A型实验室pH计 上海精密科学仪器有限责任公司；DM2000型显微镜及DFC280型摄像系统 德国徕卡公司。

1.3 卵白蛋白提取

参考文献[17]盐析法稍作修改。分离鸡蛋蛋清与蛋黄，蛋清与水按2∶1质量比例稀释；于25 ℃条件下边磁力搅拌边缓慢加入硫酸铵，加至用量为390 g/L后搅拌1.5～2.0 h，弃除白色杂质沉淀；混合液于4 500 r/min离心20 min，上清液置于透析袋中，4 ℃透析24 h，每隔2 h更换去离子水；透析液于－55～－60 ℃真空冷冻干燥24 h，收集粉末即为卵白蛋白产品。

1.4 酶法改性流程

卵白蛋白→蒸馏水稀释→调pH值至9.0→加入碱性蛋白酶→45 ℃恒温酶解→80 ℃灭酶10 min→起泡性测定→真空冷冻干燥→改性卵白蛋白

1.5 起泡性测定[2]

稀释改性后卵白蛋白溶液至1.0 g/100 mL，室温下于高速分散均质器中均质2 min（10 000 r/min），然后快速移至250 mL量筒，记下均质停止时泡沫体积，则起泡性按公式（1）计算。

（1）

均质停止30 mim后，记下此时泡沫体积，则30 mim的泡沫稳定性按公式（2）计算。

（2）

1.6 试验设计

在底物质量分数3.0%、酶用量60 000 U/g的条件下，酶解时间设置为10、20、30、40、50、60、70 min，考察不同酶解时间对起泡性的影响；在酶解时间30 min、酶用量60 000 U/g的条件下，底物质量分数设置为1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%、6.0%、7.0%，考察不同底物质量分数对起泡性的影响；在酶解时间30 min、底物质量分数2.0%的条件下，酶用量设置为20 000、60 000、100 000、140 000、180 000、220 000、260 000 U/g，考察不同酶用量对起泡性的影响。

1.7 泡沫微观结构观察

将泡沫样品平铺在表面皿上形成薄薄一层，在显微成像系统下放大100 倍后观察。

2 结果与分析

2.1 酶解时间对卵白蛋白起泡性的影响

图 1 酶解时间对卵白蛋白起泡性的影响

Fig.1 Effect of enzymatic treatment time on foaming property of ovalbumin

由图1可知，当酶解时间为30 min时，卵白蛋白起泡性达到最佳；此后酶解时间继续延长，起泡性逐渐下降。当酶解时间为20 min时，卵白蛋白泡沫稳定性最佳；此后随酶解时间延长而逐渐下降。这可能是因为酶解初期—NH2、—COOH之间形成的氢键数量增多，薄膜具有足够的黏度和机械强度在蛋白质分子中形成，使得卵白蛋白的起泡性增加；之后—NH2、—COOH的数目随着酶解过程的进行而不断增加，电荷数目也随之增加，到一定程度后由于气液薄膜强度降低而导致泡沫易破裂，起泡性也随之降低[12,16]。当酶解时间为30 min时卵白蛋白起泡性与泡沫稳定性均为较佳状态，故酶解时间以30 min为宜。

2.2 底物质量分数对卵白蛋白起泡性的影响

图 2 底物质量分数对卵白蛋白起泡性的影响

Fig.2 Effect of substrate concentration on foaming properties of ovalbumin

由图2可知，随着底物质量分数的增加，卵白蛋白起泡性呈先上升而后下降的趋势；但泡沫稳定性一直随底物质量分数的增加而持续上升。这可能是因为在不断受热的情况下，底物质量分数较大时可溶性聚合多肽由小分子进一步聚合而成，使得界面张力增加，起泡性随底物质量分数的持续增加而减小[13-14]。综合考虑起泡性与泡沫稳定性，底物质量分数以2.0%为宜。

2.3 酶用量对卵白蛋白起泡性的影响

由图3可知，随着碱性蛋白酶用量的增加，在一定范围内卵白蛋白起泡性和泡沫稳定性均随酶用量的增加而上升，但达一定极限值后均呈下降趋势。这可能是由于有限酶解使得蛋白质分子柔性增加，疏水基团充分暴露，因而使蛋白质分子能迅速吸附至气水界面，并随即将界面张力下降至低水平，提升了起泡性；然而由于在界面低分子质量肽不能形成具有黏附性质的膜，从而导致起泡能力因过度水解而降低[15-16]。综合考虑起泡性及泡沫稳定性与生产成本，酶用量以140 000 U/g为宜。

图 3 酶用量对卵白蛋白起泡性的影响

Fig.3 Effect of alkaline proteinase concentration on foaming properties of ovalbumin

2.4 响应面优化试验

2.4.1 试验设计与结果

响应面试验设计根据单因素试验确定各因素的取值水平范围，采用SAS RSREG程序，结合Box-Behnken中心组合试验设计原理，选取酶解时间、底物质量分数、酶用量为自变量，以卵白蛋白起泡性为响应值进行响应面试验，设计方案及结果见表1。

表 1 响应面优化试验设计及结果

Table 1 Experimental design and results for response surface optimization

2.4.2 模型建立及显著性检验

表1中试验13、14、15为中心试验，其他为析因试验。15 个试验点分为零点和析因点，这其中零点为区域的中心点，零点试验重复3 次，用于估计试验误差，析因点为自变量取值在X1、X2、X3所组成的三维顶点。采用SAS RSREG程序对所得数据进行单因素方差（one-way variance，ANOVA）分析，分析结果如表2所示。

3 个因子经拟合后获得的回归模型方程为：Y＝203＋8.125X1－1.125X2＋1.75X3－0.75X1X2－2.5X1X3＋1.5X2X3－10.875X12－6.375X22－3.125X32。

表 2 回归方程各项方差分析

Table 2 Analysis of variance for the regression equation

注：*. P＜0.05，表示差异显著；**. P＜0.01，表示差异极显著。

由表2可知，优化响应面模型极显著（P=0.001 1＜
0.01），失拟项不显著，变量与所考察自变量之间的线性关系显著（R2=0.979 2）；模型调整相关系数R2Adj=0.941 7，说明方法可靠，使用该方程模拟与实际拟合程度理想。由表2中Prob＞F项可知，方程中X1、X12、X22、X32和X1X2对Y值影响非常显著，说明酶解时间和底物质量分数对起泡性有极显著影响；较好地反映了卵白蛋白起泡性与酶解时间、底物质量分数、酶用量的关系，因此所得的回归方程能较好地预测卵白蛋白起泡性随各参数的变化规律[18-19]。

由SAS RSREG分析得到最大响应值（Y）时，其最大起泡性的最佳工艺条件为：酶解时间33.6 min、底物质量分数1.90%、酶用量144 000 U/g，理论最大起泡性为205.0%。

2.4.3 响应面分析

Y=f（X1,X2）

图 4 酶解时间和底物质量分数交互作用对起泡性影响的响应面（a）和等高线图（b）

Fig.4 Response surface (a) and contour plots (b) for the interactive effects of enzymatic modification conditions on the foaming capability

酶解时间（X1）、底物质量分数（X2）交互作用的响应面及等高线图，如图4所示，直观地反映了各因素交互作用对响应值的影响。响应曲面的陡峭可以反映该因素对响应值影响的大小，曲面越陡，影响越大；反之，影响就小。等高线的形状可反映出交互效应的强弱，椭圆形表示两因素交互作用显著，而圆形则与之相反[20-21]。图4表明，随着酶解时间的延长和底物质量分数的增加，卵白蛋白起泡性先增大后减小，酶解时间的曲面比底物质量分数的曲面陡，故底物质量分数对响应值的影响小于酶解时间，再次验证了单因素影响的主次顺序。

2.4.4 验证实验

为了检验响应面法的可行性，采用得到的最佳工艺条件进行卵白蛋白起泡性改善的验证实验，同时考虑到实际操作和生产方便，将最佳工艺调整为：酶解时间34 min、底物质量分数1.90%、碱性蛋白酶用量144 000 U/g，得到实际起泡性为202.0%，与理论值相差不大。因此，响应面法对卵白蛋白酶法改性工艺条件的优化是可行的，得到的工艺条件具有实际应用价值。

2.5 卵白蛋白泡沫微观结构观察

a

b

图 5 酶法改性前（a）后（b）卵白蛋白泡沫显微图像（×100）

Fig.5 Microscopic images of foams before (a) and after (b) modification (× 100)

泡沫微观结构主要从色泽、大小、形状、强度厚薄等方面观察[22-23]。由图5可知，未改性卵白蛋白泡沫色泽较暗淡、体积较大、呈椭球形、强度厚度较差、泡沫较为分散；而酶法改性卵白蛋白泡沫色泽较明亮、体积较小、呈正球形、强度厚度较好，由此可推断酶法改性能有效改善卵白蛋白起泡性。

3 结 论

采用物理、化学或生物方法对卵白蛋白进行改性处理以改善其功能特性具有重要的应用意义。采用碱性蛋白酶改性卵白蛋白以提高其起泡性，单因素试验考察底物质量分数、酶用量和酶解时间对起泡性和泡沫稳定性的影响，并进行Box-Behnken中心组合试验优化改性条件。获得最佳改性条件为：酶用量144 000 U/g、底物质量分数1.90%、酶解时间34 min，在此条件下酶法改性后卵白蛋白起泡性达202.0%，为未改性（120.0%）的1.683 倍。本实验表明碱性蛋白酶酶法改性处理卵白蛋白能有效改善其起泡性，且酶法改性条件温和，无化学方法导致的环境污染，为工业化改性生产专用高起泡性卵白蛋白粉的可行途径。

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