仿刺参肠道组织酶解工艺优化及肽段分析

王 颖1,2,张 健2,3,王茂剑2,3,*,王共明4,李 倩1,2,刘 昕2,侯志刚1,2

(1.上海海洋大学食品学院,上海 200000;2.山东省海洋资源与环境研究院,山东 烟台 264006;

3.山东省海洋生态修复重点实验室,山东 烟台 264006;4.山水海产有限公司,山东 烟台 264006)

 

摘 要:以仿刺参肠道组织为原料,优化酶解工艺条件,研究梯级肽对小鼠原代巨噬细胞过氧化氢损伤的保护作用。采用单因素试验及响应面试验分析法对酶解工艺条件进行优化,利用超滤法获取不同截留分子质量的肽段,采用噻唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)比色法检测细胞活力。结果表明:通过响应面优化得最佳条件为:酶解温度50.10 ℃、酶解时间2.84 h、加酶量2.639万 U时水解度可达41.82%。通过超滤制备,分别得到分子质量小于650、650~1 000 u与1 000~10 000 u肽段,各肽段均能显著提高过氧化氢损伤细胞的细胞活力值,所获肽段对过氧化氢损伤巨噬细胞具有显著保护作用,其中小于650 u肽段更佳。

关键词:仿刺参肠道组织;酶解;响应面;超滤;过氧化氢损伤

 

Optimal Preparation and Characterization of Peptides from Enzymatic Hydrolysis of
Apostichopus japonicus Intestinal Tissue

 

WANG Ying1,2, ZHANG Jian2,3, WANG Mao-jian2,3,*, WANG Gong-ming4, LI Qian1,2, LIU Xin2, HOU Zhi-gang1,2

(1. College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 200000, China;

2. Shandong Marine Resource and Environment Research Institute, Yantai 264006, China;

3. Shandong Provincial Key Laboratory of Restoration for Marine Ecology, Yantai 264006, China;

4. Shan Shui Co. Ltd. Shandong Province, Yantai 264006, China)

 

Abstract: This work reports the application of single factor experimental design and response surface methodology to optimize conditions for enzymatic hydrolysis of the intestinal tissue of Apostichopus japonicas and the protective effect of the resulting peptides on primary macrophages of mice from injury caused by hydrogen peroxide. Hydrolysates were fractionated by ultrafiltration membranes with different cut-off molecular weights (MWCO). The cell viability was detected by MTT (3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide) assay. Results showed that the highest degree of hydrolysis of 41.82% was attained after 2.84 h of hydrolysis at 50.10 ℃ with 26 390 U of papain. Peptides with molecular mass less than 650, 650–1 000 and 1 000–10 000 u were separated by ultrafiltration, and they all could significantly increase the viability of primary cells and show a protective effect against hydrogen peroxide-induced injury. Furthermore, the peptide with molecular mass less than 650 u showed better protective capacity.

Key words: Apostichopus japonicus intestinal tissue; enzymolysis; response surface analysis; ultrafiltration; hydrogen peroxide-induced injury

中图分类号:Q814.9 文献标志码:A 文章编号:1002-6630(2014)23-0182-06

doi:10.7506/spkx1002-6630-201423036

海参性味甘、咸、温,具有很高的滋补和药用价值,能够滋阴补肾和益精养血[1]。随着世界各地越来越关注对活性多肽的开发利用,目前海洋活性多肽的研究主要是集中在海绵、芋螺、海葵、海藻等少数几种海洋生物中[2],海参多肽的研究[3]也日益提上议程。但由于多肽研究的整体水平仍然处于初级阶段,研究技术都有待进一步的提高。

有报道研究盐渍海参肠的加工工艺[4],但这种粗加工方式损失了大量的活性物质。侯英雪等[5]采用酶解工艺,制备成风味独特海参肠口服液。海参肠道组织是海参加工过程的副产物,对这些高蛋白资源的利用仅仅限于粗制饲料甚至成为废弃物,是对资源的浪费及环境的污染。对海参肠道组织多肽的有效利用,不仅可以为人体的生长发育提供所需的营养物质,提高机体的功能调节作用,还能提高海参肠综合加工利用率、满足市场的需求以及保护环境复合可持续发展的战略要求。因此,肠多肽在各个领域如保健、营养、生物、医药及化妆品行业均有重要意义[6-7]。

1 材料与方法

1.1 材料、动物与试剂

新鲜仿刺参肠道组织由烟台山水海产有限公司提供。

6~8 周龄(KM)昆明小鼠,体质量18~20 g,购于山东大学动物实验中心。

木瓜蛋白酶(酶活力100万 U/g) 南宁庞博生物工程有限公司;牛血清白蛋白 上海蓝季科技发展有限公司;细胞培养基RPMI 1640 美国Gibco公司;胎牛血清 杭州四季青生物材料有限公司;噻唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT) 美国Sigma公司;二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO) 生工生物工程(上海)股份有限公司;其余试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

TGL-16M台式高速冷冻离心机 湖南湘仪仪器有限公司;Pall Minimate切向流超滤系统及650、1 000、10 000 u切向流膜包 美国Pall公司;FP-528Dumas定氮仪 力可仪器香港有限公司;普通抽滤装置 德国Heidolph公司;TU-1810SPC紫外-可见分光光度计 北京普析通用仪器有限公司;NUAIR-NU-5510E二氧化碳培养箱 美国Nuaire公司。

1.3 方法

1.3.1 基本营养成分的测定[8]

水分:常压干燥法;灰分:灼烧称重法;粗蛋白:杜马斯燃烧法;粗脂肪:索氏抽提法。

1.3.2 酶解工艺流程

从新鲜的仿刺参中取出肠道组织,去泥清洗干净,沥干水分后经恒温水胶体磨研磨匀浆。称取仿刺参肠道组织匀浆液,按单因素及响应面优化后条件加入蛋白酶,混合均匀并在浴锅中进行酶解[6]。酶解完成后,将酶解液于100 ℃水浴中灭酶10 min。

1.3.3 指标测定

总蛋白含量的测定:采用杜马斯燃烧法[9]。

可溶性蛋白的测定:双缩脲法[11],配制不同质量浓度梯度的牛血清白蛋白标准溶液,于540 nm波长处测定吸光度,绘制标准曲线。取待测各样品1 mL与4 mL双缩脲试剂充分摇匀混合后,静置30 min,在540 nm波长处测吸光度,由标准曲线所得回归方程得到对应的标准蛋白质含量,从而可求得可溶性蛋白含量。

水解度的测定:双缩脲-三氯乙酸(trichloroacetic acid,TCA)法[12-13],取1 mL酶解液加入1mL TCA中(质量分数20%),振荡混匀,静置10 min后,10 000 r/min离心10 min,取上清液用双缩脲法测可溶性蛋白含量。按照下式计算水解度(degree of hydrolysis,DH)。

851218.jpg (1)

式中:ρ1为反应后酶解液中可溶性蛋白含量/(mg/mL);ρ2为反应前仿刺参肠道组织中可溶性蛋白含量/(mg/mL);ρ0为仿刺参肠道组织中总蛋白质含量/(mg/mL)。

1.3.4 单因素试验

由于木瓜蛋白酶起活性范围在中性区间,调节pH值会影响酶解液的风味,所以不考虑pH值的影响,对酶解时间、酶解温度、加酶量为单因素试验。样品匀浆液取1 g时,酶解温度55 ℃、加酶量1万 U,酶解时间分别为2、3、4、5、6 h;酶解时间3 h,加酶量1万 U,酶解温度分别为30、40、50、60、70 ℃;酶解温度55 ℃、酶解时间3 h,加酶量分别为0.5万、1万、2万、3万、4万 U。以水解度为衡量指标,选出最优单因素条件。

1.3.5 响应面试验优化

以单因素试验结果为基础,以水解度为衡量指标,选取时间、温度和加酶量3 个因素,设计三因素三水平的响应面分析试验,样品为1 g时,酶解温度为40、50、60℃,酶解时间为2、3、4 h,加酶量为1万、2万、
3万 U,对所木瓜蛋白酶进行酶解条件的优化。

1.3.6 超滤工艺制备梯级肽[14-16]

通过优化以最优条件制备的酶解液进行10 000 r/min离心取上清液,依次通过定性滤纸、0.45 µm和0.22 µm的微孔滤膜过滤。将滤后酶解液加乙醇至乙醇终体积分数为60%,4 ℃静置过夜,然后将醇沉酶解液进行
10 000 r/min离心取上清液,旋蒸后进行冷冻干燥,取1.7 g复溶至500 mL加入超滤杯中,选择截留分子质量为10 000、1 000、650 u的切向流膜包,流速为2 mL/min,压力为12 Pa的条件下,进行超滤,当超滤杯中酶解液体积剩余1/5时,停止超滤收集滤过液,用蒸馏水将截留液补充至原体积,再次超滤。重复多次,收集每次的滤过液及截留液,采用双缩脲法检测其中蛋白质或多肽的含量。

1.3.7 梯级肽对巨噬细胞氧化损伤的保护

1.3.7.1 原代巨噬细胞培养和预处理[17]

腹腔注射可溶性淀粉于昆明小鼠连续3 d后,颈椎脱位处死,75%酒精浸泡1 min沥干消毒处理,腹腔注射4 mL不含胎牛血清1642培养基,并用手指轻揉小鼠腹部5~10 min,小心缓慢吸出腹腔中培养基,收集吹匀离心去上清液,并用不含胎牛血清1640培养基冲洗死细胞3 次,用含有10%胎牛血清的1640培养基吹匀,在倒置显微镜下,将细胞悬液计数调整细胞浓度至
2×105 个/mL,每孔100 µL,接种于96 孔细胞培养板,培养条件:37 ℃、5% CO2、4 h,待细胞贴壁,再用不含胎牛血清1640培养基洗去上清及未贴壁细胞,待用。

1.3.7.2 MTT法检测细胞活力[18]

96 孔板周围一圈加满磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,PBS),其余每孔100 µL培养基,重复3 个孔,终止培养前每孔加入20 µL MTT溶液至终质量浓度为5 mg/mL,培养箱中继续培养4 h,扣板去除上清,每孔加入150 µL DMSO,避光振荡10 min,使紫色甲臜结晶彻底溶解。波长492 nm,参比波长630 nm酶标仪检测各孔的光密度(OD492 nm)值。

856930.jpg (2)

式中:空白组OD492 nm值为无细胞培养基的OD492 nm值;对照组为含细胞培养基的OD492 nm值;样品组OD492 nm值为含细胞及样品培养基的OD492 nm值。

1.3.7.3 过氧化氢损伤细胞模型的建立

将96 孔板中细胞浓度为2×105 个/mL已贴壁细胞更换全部培养基,随机分为对照组及实验组,对照组加含胎牛血清1640培养基;实验组参考文献[19-21],加含过氧化氢不同终浓度(100、120、160、180、240 µmol/L)的含胎牛血清1640培养基诱导4 h,以MTT法检测细胞存活率,选出细胞损伤达到60%~70%的过氧化氢浓度。

1.3.7.4 梯级肽对细胞的保护作用

将96 孔板中细胞浓度为2×105 个/mL已贴壁细胞更换全部培养基,随机分为对照组、实验组及损伤组,对照组加入100 µL含胎牛血清1640培养基;实验组加入100 µL终质量浓度为25、50、100、200、400 µg/mL的梯级肽样品含胎牛血清1640培养基继续培养24 h,再以同样方法加入过氧化氢诱导4 h;损伤组加入100 µL含胎牛血清1640培养基培养24 h,同样,加入过氧化氢诱导4 h。以MTT法检测细胞存活率。

1.4 数据处理与统计分析

采用Design-Expert8.0.6和SPSS 19.0统计软件进行数据处理与分析,组间采用配对样本t检验,双侧Sig值比较,P<0.05差异显著,P<0.01差异极显著。

2 结果与分析

2.1 基本营养成分测定

由表1可知,海参肠道组织粗蛋白含量63.056%,粗脂肪含量8.777%。海参肠道组织蛋白质含量丰富,作为多肽的开发来源,不仅节约成本提高海参产品的附加值,更有利于环境保护。

表 1 海参肠道组织基本营养成分

Table 1 Basic nutrient composition of sea cucumber intestinal tissue

%

营养成分

水分

灰分

粗蛋白

粗脂肪

海参肠道组织

94.703

 

10.130

63.056

8.777

 

注:表中数据以干基计。

 

2.2 单因素试验结果

2.2.1 酶解时间对水解度的影响

851252.jpg 

图 1 酶解时间对蛋白酶水解度的影响

Fig.1 Effect of hydrolysis time on the degree of hydrolysis

由图1可知,随着酶解时间的延长,水解度先是上升,达到最大值后开始下降,最后趋于平缓。造成该现象可能的原因是:随着时间的增加,酶与底物逐渐充分反应,水解度逐渐增加,继续反应达到反应后期时,可能出现过度水解现象[22]。酶解产生的多肽进一步水解成小分子氨基酸,由于该检测方法仅对多肽及蛋白进行检测,从而使得水解度下降。因此,蛋白酶水解时间选定3 h左右。

2.2.2 酶解温度对水解度的影响

851271.jpg 

图 2 酶解温度对蛋白酶水解度的影响

Fig.2 Effect of hydrolysis temperature on the degree of hydrolysis

由图2可知,随着酶解温度的升高,酶解程度的趋势先是上升,达到最高后继续升高加热温度水解度开始下降。造成该现象的原因可能是:随着酶解温度的上升,酶活性中心逐渐被激活,酶解活力增强[23],水解度不断增加。达到最适温度后,随着温度的不断上升,酶逐渐受热变性开始失活[24],水解度下降。因此,蛋白酶最佳酶解温度在50 ℃左右。

2.2.3 加酶量对水解度的影响

851304.jpg 

图 3 加酶量对蛋白酶水解度的影响

Fig.3 Effect of enzyme dosage on the degree of hydrolysis

由图3可知,随着加酶量的增加,水解度逐渐增加然后下降并趋于平缓。可能原因是随着加酶量的增加,底物与酶的接触增加,加快了反应速率。而加酶量继续增加会出现过度水解现象,产生该检测方法不可检测的氨基酸。综合考虑,蛋白酶的加酶量选2万 U左右。

2.3 响应面优化试验结果

李冬燕等[25]以海参肠为原料,在单因素试验的基础上通过正交试验及方差分析确定海参肠的最佳酶解工艺条件。正交试验设计(orthogonal design)[26-27]和响应曲面试验设计(response surface methodology,RSM)[28],都是一种优化的数学模型,相比较而言响应曲面法可以通过所得方程计算出任一条件组合下的函数值,其优势更加显著[29],本实验即采用该方法。

在单因素试验所得结果基础上,运用Design-Expert软件中采用Box-Behnken原理设计试验,分析3 个因素对水解度的影响。试验设计及结果见表2。

表 2 酶解工艺条件的响应面分析试验设计及结果

Table 2 Design and results for RSM analysis

试验号

A酶解温度/℃

B酶解时间/h

C加酶量/(104 U)

Y水解度/%

1

0(50)

0(3)

0(2)

40.15±0.32

2

1(60)

1(4)

1(3)

30.51±1.29

3

-1(40)

1

0

30.68±1.08

4

0

-1(2)

-1(1)

24.14±0.43

5

0

0

-1

40.15±1.21

6

0

1

0

33.61±1.17

7

-1

0

0

24.58±0.61

8

0

1

1

23.02±1.41

9

1

0

-1

37.78±0.34

10

-1

0

0

38.68±1.54

11

0

0

1

40.15±1.22

12

1

0

0

20.75±1.69

13

1

-1

0

32.40±0.74

14

0

-1

1

38.17±1.54

15

-1

-1

0

31.08±0.48

16

0

0

-1

40.15±1.22

17

0

0

0

40.15±1.22

 

 

表 3 响应面试验方差分析

Table 3 Results of ANOVA for the response surface regression model

方差来源

平方和

自由度

均方

F

P=Prob>F

显著性

模型

739.90

9

82.21

52.05

<0.000 1

**

A

7.94

1

7.94

5.03

0.059 9

 

B

1.60

1

1.60

1.01

0.347 4

 

C

388.51

1

388.51

245.98

<0.000 1

**

AB

0.56

1

0.56

0.35

0.572 0

 

AC

2.96

1

2.96

1.87

0.213 4

 

BC

2.15

1

2.15

1.36

0.281 9

 

A2

98.94

1

98.94

62.64

<0.000 1

**

B2

71.99

1

71.99

45.58

0.000 3

**

C2

130.51

1

130.51

82.63

<0.000 1

**

残差

11.06

7

1.58

 

 

 

失拟项

11.06

3

3.69

 

 

 

纯误差

0.000

4

0.000

 

 

 

总离差

750.95

16

 

 

 

 

 

注:**.P<0.01,表示差异极显著。

 

由表3可知,该模型的F值为52.05,P<0.000 1,拟合高度显著。所建立的模型可以很好地反应水解度与酶解温度、酶解时间和加酶量之间的关系。Prob>F的值小于0.05表示该因素影响显著[30],本实验中影响度:C
ABCA2、B2、C2对结果影响更为显著。各因素取最优值即酶解温度50.10 ℃、酶解时间2.84 h、加酶量
2.639万 U时,响应所能取得水解度最高为42.45%。验证该条件下实际水解度为41.82%。由图4可知,BCAC曲线变化均陡峭,说明在一定时间和温度条件下,加酶量对水解度的影响较大,结合方差分析可以看出AC因素交互作用较大,对水解度有较大影响。

851323.jpg 

851341.jpg 

851359.jpg 

图 4 各因素交互作用对水解度的影响

Fig.4 Effect of interaction of various factors on the degree of hydrolysis

2.4 超滤结果分析

851377.jpg 

851395.jpg 

851416.jpg 

图 5 10 000 (A)、1 000(B)和650 u(C)超滤次数与
多肽含量的关系

Fig.5 Effect of repeated ultrafiltrations on peptide content: MWCO
10 000 (A), 1 000 (B) and 650 u (C) between ultrafiltration times and peptide content

由图5A可知,复溶酶解液通过10 000 u膜包时,截留液和滤过液中蛋白质及多肽含量随着超滤次数的增加逐渐下降[31],在超滤达到3 次后,其含量基本趋于稳定,即分子质量大于10 000 u的大分子蛋白质及多糖等在截留液中,达到初步分离的目的;取通过10 000 u膜包的滤过液过1 000 u膜包,同样取通过1 000 u膜包的滤过液过650 u膜包,由图5B、5C可知,截留液中多肽含量随超滤次数增加逐渐降低,在超滤4 次后基本趋于稳定,初步分离出分子质量小于1 000 u及650 u的滤过液。最后得到分子质量分别是小于650、650~1 000、1 000~10 000 u及大于10 000 u这4 个肽段的多肽。

2.5 H2O2细胞损伤模型及梯级肽保护作用

2.5.1 H2O2损伤模型的建立

表 4 巨噬细胞的H2O2损伤模型

Table 4 Hydrogen peroxide-induced damage model of macrophages

H2O2浓度/(µmol/L)

OD492 nm

细胞存活率/%

空白组

0.411±0.012

 

对照组

1.787±0.042

100

100

1.596±0.039a

86

120

1.179±0.040a

56

160

0.836±0.022a

31

180

0.582±0.041a

12

240

0.534±0.036a

9

 

注:a.与对照组比较,差异极显著(P<0.01)。

 

由表4可知,在实验浓度范围内,细胞的存活率与H2O2浓度呈负相关,即与对照组相比各实验组细胞活力随H2O2浓度增大而下降,无完全存活和完全死亡现象,浓度范围合适。王世博等[32]在黄芪甲对H2O2作用PC12细胞活力实验中选取H2O2浓度300 µmol/L损伤度约65%,唐小卿等[33]在姜黄素对H2O2作用PC12细胞的保护实验中选取100、200 µmol/L细胞损伤率为56.8%和78.6%,本实验当H2O2浓度为160 µmol/L时细胞存活率为31%,即损伤度达到69%,适合做损伤保护实验。

2.5.2梯级肽对巨噬细胞的H2O2损伤保护

表 5 巨噬细胞H2O2损伤的保护作用

Table 5 Protective effect of peptides from Apostichopus japonicus intestinal tissue against H2O2-induced macrophage injury

组别

样品质量浓度/(µg/mL)

OD492 nm

细胞存活率/%

对照组

 

1.879±0.058

100

损伤组

 

1.020±0.072

41.508±0.049a

小于650 u

25

1.148±0.028

50.204±0.019d

50

1.397±0.087

67.166±0.059c

100

1.408±0.011

67.916±0.008c

200

1.591±0.046

80.381±0.032c

400

1.745±0.057

90.895±0.039c

 

 

 

 

650~1 000 u

25

1.148±0.027

49.773±0.012d

50

1.237±0.080

56.222±0.055b

100

1.287±0.018

59.764±0.020c

200

1.321±0.030

62.421±0.024c

400

1.362±0.027

64.782±0.018c

 

 

 

 

1 000~10 000 u

25

1.026±0.023

41.871±0.016d

50

1.110±0.079

47.593±0.054d

100

1.288±0.059

59.764±0.040c

200

1.329±0.198

62.511±0.085c

400

1.391±0.015

66.735±0.010c

 

注:a.与对照组比较,P<0.01;b.与损伤组比较,P<0.05;c.与损伤组比较,P<0.01;d.与损伤组比较,P>0.05。

 

由表5可知,损伤组细胞活力对照组相比差异极显著(P<0.01)[34];Kong Baohua等[35]从乳清蛋白水解产物中提取的抗氧化肽有显著保护MRC-5细胞抵抗过氧化氢的损伤,本实验组3 个肽段达到一定质量浓度与损伤组对比均有显著差异(P<0.05),即对细胞均有保护作用,其损伤保护效果随着样品质量浓度的增加而提高;其中当小于650 u肽段样品质量浓度为50 µg/mL时已达到650~1 000 u与1 000~10 000 u肽段实验范围内的最佳损伤保护效果,可知小于650 u肽段损伤保护效果最佳,其余2 种相对较弱。

3 结 论

本实验以提高海参加工副产物的利用率为目的,通过使用木瓜蛋白酶对海参肠道组织进行酶解,利用单因素试验及响应面试验分析确定酶解最佳工艺条件。最佳酶解条件是:酶解温度50.10 ℃、酶解时间2.84 h、加酶量2.639万 U,水解度为41.82%。选择不同截留分子质量的超滤膜包,采用梯度稀释法制备不同分子质量大小的肽段,利用MTT法检测各肽段对原代巨噬细胞的H2O2损伤保护作用,结果表明其具有明显的细胞损伤保护能力,其中分子质量小于650 u的肽段更佳。

通过优化酶解工艺处理海参肠道组织,降低了蛋白质分子质量,增加了活性多肽及氨基酸成分,酶解产物活性更强更易于吸收,该工艺操作简单,加工成本经济。针对本实验梯级肽制备和抗氧化细胞保护作用活性研究基础上,可进一步对小肽的纯化和的功能鉴定进行深入研究,为海参下脚料的高值化利用提供科学依据。

参考文献:

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收稿日期:2014-06-30

基金项目:国家海洋局海洋公益性行业科研专项(201205027;201105029);

山东省现代农业产业技术体系刺参产业创新团队建设项目(SDAIT-08);

海洋经济创新发展区域示范项目(20130125);水生动物营养与饲料泰山学者岗位经费资助项目(TS 200651036)

作者简介:王颖(1990—),女,硕士研究生,研究方向为食品科学与工程。E-mail:yugong_271156317@qq.com

*通信作者:王茂剑(1964—),男,研究员,本科,研究方向为食品科学与工程。E-mail:wangmaojian@126.com