自然发酵苹果渣中的微生物区系分析

孙文静1，陈义伦1，吴茂玉2，王凤忠3，黄坤勇4，朱宇竹1，周 波1,*

（1.山东农业大学食品科学与工程学院，山东 泰安 271018；2.中华全国供销合作总社济南果品研究院，山东 济南 250014；3.中国农业科学院农产品加工研究所，北京 100193；4.中宁牧光生物科技有限公司，宁夏 中卫 755100）

摘 要：以自然发酵的苹果渣为对象，采用选择平板分离技术，对其不同层次的微生物区系组成进行分析。通过形态学观察、生理生化测定，结合ITS区、26S rRNA和16S rRNA基因序列分析等多相分类法对分离获得的微生物进行鉴定，研究苹果渣不同温度层中的微生物区系组成。结果表明：自然发酵苹果渣中主要微生物组成为酵母菌和乳酸菌，从28、37、45、50 ℃这4 个温度层中分离得到10 株菌，4 个温度层的优势菌分别鉴定为黑曲霉、乳酸链球菌、马克斯克鲁维酵母和东方伊萨酵母。

关键词：自然发酵；苹果渣；微生物区系；多相分类法

Analysis of Microflora Profile in Naturally Fermented Apple Pomace

SUN Wen-jing1, CHEN Yi-lun1, WU Mao-yu2, WANG Feng-zhong3, HUANG Kun-yong4, ZHU Yu-zhu1, ZHOU Bo1,*

(1. College of Food Science and Engineering, Shandong Agricultural University, Taian 271018, China;

2. Jinan Fruit Research Institute, All China Federation of Supply and Marketing Cooperatives, Jinan 250014, China;

3. Institute of Agro-products Processing Sciences and Technology, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China;

4. Biotechnology Corporation of Zhongning Mu-guang, Zhongwei 755100, China)

Abstract: In order to investigate the microflora in different temperature layers of naturally fermented apple pomace, the microorganisms were obtained by selective plate method and identified by morphology observation, physiological and biochemical characteristics and molecular biological techniques (ITS region, 26S rRNA and 16S rRNA gene sequence analysis). The results indicated that the major microorganisms of spontaneously fermented apple pomace included yeast and Lactobacillus, and ten strains were isolated from four temperature layers. The dominant bacteria from four temperature layers were identified as Aspergillus niger, Lactococcus lactis, Kluyveromyces marxianus and Issatchenkia orientalis, respectively.

Key words: natural fermentation; apple pomace; microflora; polyphasic taxonomy

中图分类号：Q939.9 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）23-0193-06

doi:10.7506/spkx1002-6630-201423038

苹果渣是苹果加工业的副产物，主要由果皮、果核和残余果肉组成，约占鲜果质量的25%[1]。我国是世界上苹果生产第一大国，苹果种植规模和总产量占世界苹果总生产水平的1/3左右。据统计，2009年我国的年产量约达3 300万 t，2012年产量达到3 800万 t，约占世界苹果总产量的63.3%[2]。近年来，随着我国苹果加工业的飞速发展，每年约有100多万吨苹果渣产生[3]。苹果渣含有可溶性糖、氨基酸、维生素、矿物质和果酸等多种营养物质，果胶、不可溶性膳食纤维等物质含量非常丰富[4-5]。作为果汁业的主要副产品，经深加工后可提高苹果渣的附加产值，减轻环境污染，提高企业经济效益，是一种可以资源化利用的加工副产物。

目前，苹果渣主要为直接干燥或发酵作饲料[6]，也用于提取果胶[7]、膳食纤维[8]及作为微生物的生长基质来生产酒精[9]、柠檬酸[10]、低聚糖[11]等，还可经微生物发酵作为生物有机肥使用。苹果渣含有较高水分，易被微生物浸染，发霉、腐烂变质，加工利用前大量的苹果渣在贮存备用期间会发生自然发酵现象，给其加工产品带来安全性影响。2002年李志西等[6]曾分析过发酵苹果渣中的微生物组成，但目前国内外对自然发酵苹果渣的微生物区系分析的研究较少；本实验主要以自然发酵状态下苹果渣为研究对象，对其进行微生物组成分析，以期阐明自然发酵苹果渣微生物组成特征，为深入研究自然发酵苹果渣应用的安全性，提升产业价值提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

苹果渣样品由中宁牧光生物科技有限公司提供。浓缩果汁厂加工产生的新鲜果渣（9月1日）经过约一个月（10月5日）的自然堆积发酵（厚度约1.5 m，pH 3.0～3.5），形成明显分层。自然发酵苹果渣的基本性质见表1。

表 1 自然发酵苹果渣的基本性质

Table 1 Basic properties of naturally fermented apple pomace

葡萄糖、蔗糖、无水乙酸钠、柠檬酸铵、KNO3、NaCl、MgSO4、FeSO4（均为分析纯） 天津市凯通化学试剂有限公司；OMEGA Fungal DNA Mini Kit D3390-01
试剂盒 美国Omega Bio-Tek公司；TIANamp Yeast DNA Kit DP307试剂盒、TIANamp Bacteria DNA Kit DP302试剂盒 天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 培养基

真菌分离培养基（PDA）：马铃薯200 g、蔗糖20 g、琼脂20 g，蒸馏水1 000 mL，pH 3.5。

细菌分离培养基（LB）：蛋白胨10.0 g、酵母膏5.0 g、NaCl 10.0 g、琼脂20 g，蒸馏水1 000 mL，pH 3.5。

放线菌分离培养基（高氏Ⅰ号）：可溶性淀粉20.0 g、KNO3 1.0 g、NaCl 0.5 g、K2HPO4 0.5 g、MgSO4 0.5 g、FeSO4 0.01 g、琼脂20 g，蒸馏水1 000 mL，pH 3.5。

真菌鉴定及保藏培养基（CA）：NaNO3 3.0 g、K2HPO4 1.0 g、KCl 0.5 g、MgSO4•7H2O 0.5 g、FeSO4 0.01 g、蔗糖30 g、琼脂15 g，蒸馏水1 000 mL，121 ℃灭菌20 min。

乳酸菌保藏培养基（MRS）：蛋白胨10.0 g、牛肉膏5.0 g、酵母粉4.0 g、葡萄糖20.0 g、吐温-80 1.0 mL、K2HPO4 2.0 g、乙酸钠5.0 g、柠檬酸铵2.0 g、MgSO4•7H2O 0.2 g、MnSO4•4H2O 0.05 g、琼脂20 g、碳酸钙20 g，蒸馏水1 000 mL，pH 6.2。

1.3 仪器与设备

Nikon YS2电子显微镜 日本尼康光学仪器有限公司；TGL-16B离心机 上海安亭科学仪器厂；PHS-3C型数字式酸度计 上海理达仪器厂；HH-I数显恒温水浴锅 国华电器有限公司；DYY-8C电泳仪 北京市六一仪器厂；T-Gradient PCR仪 德国Biometra公司；GelDoc-It凝胶成像系统 美国UVP公司。

1.4 方法

1.4.1 苹果渣中微生物组成分析[12-13]

称取自然发酵的苹果渣10 g于90 mL无菌水中，振荡摇匀后进行系列稀释，取适宜浓度分别涂布于PDA、LB和高氏Ⅰ号培养基上，按分层的温度要求倒置培养后进行菌落计数。

1.4.2 不同层次中微生物的分离与纯化

不同层次微生物分离：分别称取10 g各层次的苹果渣于90 mL无菌水中，振荡混匀后进行系列稀释，取适宜浓度涂布于PDA、LB和高氏Ⅰ号培养基上，按自然发酵苹果渣的层次温度倒置培养。

菌种纯化和保藏：挑取不同形态的菌体作平板划线纯化，将纯化单一的菌体于斜面培养基上，4 ℃保藏备用。

1.4.3 菌种鉴定

对所获得的菌株通过形态学观察、生理生化测定，结合分子生物学基因序列分析等多相分类法进行鉴定。

1.4.3.1 形态学及显微形态观察

将分离所得微生物接种于对应的培养基上，进行菌落形态和显微镜观察并记录。

1.4.3.2 生理生化分析

真菌的生理生化鉴定：根据文献[14-16]进行生理生化鉴定。主要指标包括碳源利用实验、氮源利用实验、明胶水解实验和糖发酵实验。

细菌的生理生化鉴定：根据文献[17-18]进行生理生化鉴定。主要指标包括革兰氏染色、过氧化氢酶实验、葡萄糖产酸产气实验、淀粉水解实验、硝酸盐还原、明胶液化实验和碳源利用实验。

1.4.3.3 分子生物学鉴定

霉菌的分子鉴定：将分离纯化的霉菌接种于PDA固体培养基上，倒置培养3～5 d，收集菌体至研钵中，加液氮充分研磨后，用OMEGA Fungal DNA Mini Kit D3390-01
试剂盒进行DNA提取。以基因组DNA为模板，采用霉菌通用引物ITS1和ITS4进行ITS区的聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增[19]。

酵母菌的分子鉴定：将分离纯化的酵母菌接种于PDA液体培养基中，振荡培养18 h，用TIANamp Yeast DNA Kit DP307试剂盒进行DNA提取。以基因组DNA为模板，采用酵母菌通用引物NL1和NL4进行26S rRNA的PCR扩增[20]。

细菌的分子鉴定：将分离纯化的细菌接种于MRS液体培养基中，振荡培养18 h，用TIANamp Bacteria DNA Kit DP302试剂盒进行DNA提取。以基因组DNA为模板，采用细菌通用引物27F和1495R进行16S rRNA的PCR扩增[21]。

将上述PCR扩增产物送至华大测序公司进行测序，测序结果在软件DNAMAN上进行拼接，拼接结果在美国国立生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）中的GenBank进行BLAST比对，根据比对结果，采用MEGA5软件构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 自然发酵苹果渣中微生物组成分析

采用平板稀释涂布法，对样品进行培养，统计得到的菌数结果为：霉菌3.5×103 CFU/g、酵母菌2.5×107 CFU/g、细菌1.6×107 CFU/g，放线菌未检出；由此可知自然发酵的苹果渣中的主体微生物为酵母菌和乳酸菌，其次是霉菌，未分离到放线菌。

表 2 自然发酵苹果渣不同层次中的优势菌株

Table 2 Dominant strains of different layers in naturally fermented apple pomace

由表2可知，在第一层中分离得到3 株菌株，分别编号为2-1、2-2和2-3，由菌落数可知2-1为优势菌株，其菌落形态如图1a所示；在第二层中分离得到4 株菌株，分别编号为3-1、3-2、3-3和3-4，由菌落数可知3-2为优势菌株，其菌落形态如图1b所示；在第三层中分离得到2 株菌株，分别编号为4-1和4-2，由菌落数可知4-1为优势菌株，其菌落形态如图1c所示；在第四层中分离得到一株菌株，编号为5-1，其菌落形态如图1d所示。

a

b

c

d

a.第一层优势菌株2-1；b.第二层优势菌株3-2；c.第三层优势菌株4-1；d.第四层优势菌株5-1。

图 1 自然发酵苹果渣不同层次优势菌株的菌落形态

Fig.1 Colony morphology of the dominant stains from different layers in naturally fermented apple pomace

2.2 自然发酵苹果渣中分离菌株的形态学鉴定

自然发酵苹果渣分离所得菌株的形态学特征见表3。由菌落形态可知，菌株2-1、2-2、3-1和3-3在培养基上有大量菌丝，丛生，上有不同颜色的孢子；菌株2-3、3-4、4-1和5-1的菌落圆形，表面光滑湿润，颜色呈白色或乳白色，表面凸起，有淡香味，经染色观察为细胞圆形，出芽生殖；菌株3-2和4-2的菌落湿润，圆形，经染色观察为革兰氏阳性菌，菌体呈球形，成对或成链存在。参照《酵母菌的特征与鉴定手册》[15]、《真菌鉴定手册》[16]和《伯杰氏系统细菌学手册》[18]，初步认为菌株2-1、2-2、3-1和3-3为霉菌；菌株2-3、3-4、4-1和5-1为酵母菌；菌株3-2和4-2为细菌。对分离所得的10 株菌株进行生理生化鉴定，进一步确定其分类地位。

表 3 自然发酵苹果渣中分离所得菌株的形态学特征

Table 3 Morphological characteristics of the strains isolated from naturally fermented apple pomace

由形态学和显微观察可知，菌株2-1菌落初生白色菌丝，其上密生一层黑色粉粒，边缘不规则，菌丝顶囊球形，分生孢子灰黑色，大而呈球形，分生孢子梗光滑，小梗双层；菌株2-2菌落白色，扁平，菌丝匍匐，丛白粉状，分生孢子梗直立，较短，顶生长串状的分生孢子，为圆筒形或长筒形的节孢子状；菌株3-1菌落灰绿色，中心有少许絮状突起，反面黄绿色，有轻霉味，分生孢子穗圆筒形，分生孢子梗光滑，顶囊烧瓶状，分生孢子球形；菌株3-3菌落绿色，孢子丛常带绿色，分生孢子梗有横隔，光滑，顶端不对称扫帚状，分生孢子球形或椭圆形，参照《真菌鉴定手册》[16]初步认为菌株2-1和3-1为曲霉属，菌株2-2为地霉属，菌株3-3为青霉属。

2.3 生理生化鉴定

2.3.1 细菌的生理生化鉴定

表 4 细菌的生理生化鉴定结果

Table 4 Physiological and biochemical identification of bacteria

注：＋.阳性反应；－.阴性反应。下同。

由表4可知，菌株3-2和4-1革兰氏染色均为阳性，葡萄糖产酸为阳性，均发酵葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、纤维二糖和甘露醇，菌株4-1还发酵阿拉伯糖和山梨醇。参照《伯杰氏系统细菌学手册》[18]，初步认为菌株3-2为链球菌属和4-2为乳杆菌属。

2.3.2 酵母菌的生理生化鉴定

菌株2-3、3-3、4-1和5-1无菌丝和孢子，菌落形态不同于霉菌，经过显微观察，细胞形态为圆形或椭圆形，生殖方式为芽殖，有淡香味。参照《酵母菌的特征与鉴定手册》[15]和《真菌鉴定手册》[16]，初步认为菌株2-3、3-3、4-1和5-1为酵母菌，对其进行生理生化实验，结果见表5、6。

表 5 酵母菌糖发酵鉴定结果

Table 5 Results of carbohydrate fermentation tests for yeasts

表 6 酵母菌碳源同化实验及氮源同化结果

Table 6 Results of carbon and nitrogen assimilation tests for yeasts

由表5、6可知，菌株2-3和4-1全部发酵乳糖、蔗糖、棉子糖、葡萄糖、半乳糖和麦芽糖，不发酵蜜二糖和海藻糖；菌株3-4发酵葡萄糖、海藻糖和半乳糖，其余糖不发酵；菌株5-1只发酵葡萄糖。菌株全部同化乙醇，不同化麦芽糖和淀粉，在单一氮源培养基中全部不同化硝酸钠和亚硝酸铵；菌株3-4可同化D-木糖；菌株2-3和4-1可同化棉子糖和乳糖。参照《酵母菌的特征与鉴定手册》[15]和《真菌鉴定手册》[16]，初步认为菌株2-3和4-1为克鲁维酵母属，菌株3-4为假丝酵母属和菌株5-1为伊萨酵母属。对分离得到的10 株菌株进行分子生物学分类鉴定，进一步确定其分类地位。

2.4 分子生物学鉴定

2.4.1 序列比对结果与分析

利用3 种试剂盒提取10 株菌株的DNA，PCR扩增后，将PCR产物送至北京华大基因进行测序，利用DNAMAN将测序结果进行拼接，拼接结果在GenBank中进行BLAST比对，挑选同缘性超过99%的基因序列。综合形态学观察，生理生化特征和分子生物学基因序列分析，分离所得10 株菌株的鉴定结果见表7。该菌株已被山东农业微生物菌种保藏中心（Agricultural Microbiology Culture Collection，AMCC）收录。

表 7 自然发酵苹果渣分离所得菌株的鉴定结果

Table 7 Identification of the strains in naturally fermented apple pomace

2.4.2 系统发育树的构建

PCR产物经过测序，于GenBank中进行BLAST比对，挑选同缘性超过99%的基因序列构建系统发育树，如图2～4所示。

图 2 分离所得细菌的系统发育树

Fig.2 Phylogenetic tree of isolated bacteria

图 3 分离所得霉菌的系统发育树

Fig.3 Phylogenetic tree of isolated molds

图 4 分离所得酵母菌的系统发育树

Fig.4 Phylogenetic tree of isolated yeasts

由系统发育树可知，菌株2-1与Aspergillus niger，菌株2-2与Galactomyces geotrichum，菌株2-3与4-1与Kluyveromyces marxianus，菌株3-1与Aspergillus fumigatus，菌株3-2与Lactococus lactis，菌株3-3与Penicillium paneum，菌株3-4与Candida tartarivorans，菌株4-2与Lactobacillus plantarum，菌株5-1与Issatchenkia orientalis的同源性最高，与比对结果基本一致。综合形态学观察，生理生化特征和分子生物学基因序列分析，最终确定菌株2-1为Aspergillus niger，菌株2-2为Galactomyces geotrichum，菌株2-3与4-1为Kluyveromyces marxianus，菌株3-1为Aspergillus fumigatus，菌株3-2为Lactococus lactis，菌株3-3为Penicillium paneum，菌株3-4为Candida tartarivorans，菌株4-2为Lactobacillus plantarum，菌株5-1为Issatchenkia orientalis。该菌株已被山东农业微生物菌种资源保藏与利用中心（AMCC）收录。

3 结 论

本实验表明，自然发酵苹果渣中的主体微生物为酵母菌和乳酸菌，其次为霉菌，未分离到放线菌；除自然发酵苹果渣表层中存在少量霉菌，其余与李志西等[6]分析的结果基本一致。自然发酵苹果渣不同层次优势菌群不同，从第一层筛选出3 株菌，其优势菌群为黑曲霉（AMCC 300003）；第二层筛选出4 株菌，其优势菌群为乳酸链球菌（AMCC 100047）；第三层筛选出2 株菌，其优势菌群为马克斯克鲁维酵母（AMCC 200010）；第四层筛选出1 株菌，优势菌群为东方伊萨酵母（AMCC 200014）。

对分离所得的10 株菌株通过形态学观察、生理生化测定和分子生物学等多相分类法进行了鉴定，初步鉴定结果如下：5 株为酵母属，2 株为乳酸菌属，2 株为曲霉属，1 株为青霉属。这些菌株可能来源于果汁加工过程中果渣本身存在的，或是果渣运输过程中运输工具上的，也可能来自果渣贮藏环境的，这些菌株在生产中的应用价值还需进一步深入研究。

自然发酵状态下苹果渣的这种层次和菌群结构的形成可能由以下因素决定：氧分压、温度和pH值（3.0～3.5）。这种特殊的果渣菌群结构是特定环境条件和营养条件共同决定的。

本实验分离菌株中，酵母属和乳酸菌属为优势菌，以此为基础开发微生态产品，对动物的健康养殖具有良好的积极促进作用；苹果渣浅层中存在少量的曲霉属和青霉属菌株，作为动物饲用是否存在安全隐患，还需进一步深入研究；建议表层约10%的苹果渣去除之后再使用，以确保自然发酵果渣饲用的安全性。

参考文献：

[1] FRANCIELO V, PATRCIA M A, FERNANDA S, et al. Apple pomace: a versatile substrate for biotechnological applications[J]. Critical Reviews in Biotechnology, 2008, 28(1): 1-12.

[2] 汪景彦, 张彦昌. 2013年我国苹果产量和售价预测[J]. 果树实用技术与信息, 2013(6): 4.

[3] 于滨, 吴茂玉, 朱凤涛, 等. 苹果渣综合利用研究进展[J]. 中国果蔬, 2012(12): 31-34.

[4] MASOODI F A, CHAUHAN G S. Use of apple pomace as a source of dietary fiber in wheat bread[J]. Journal of Food Processing and Preservation, 1998, 22(4): 255-263.

[5] FOOL Y, LU Y R. Isolation and identification of procyanidins in apple pomace[J]. Food Chemistry, 1999, 64(4): 511-518.

[6] 李志西, 李卫民, 薛泉宏, 等. 发酵苹果渣饲料有机酸及微生物组成分析[J]. 西北农林科技大学学报: 自然科学版, 2002, 30(增刊1): 33-35.

[7] 邓红, 宋纪蓉. 盐析法从苹果渣中提取果胶的工艺条件研究[J]. 食品科学, 2002, 23(3): 57-60.

[8] 杨福有, 祁周约, 李彩凤, 等. 苹果渣营养成分分析及饲用价值评估[J]. 甘肃农业大学学报, 2000, 35(3): 340-344.

[9] HANG Y D, LEEM C T, WOODA E E, et al. Production of alcohol from apple pomace[J]. Applied and Environmental Microbiology, 1981, 42(8): 1128-1129.

[10] SHOJAOSADATI S A, BABAEIPOUR V. Citric acid production from apple pomace in multi-layer packed bed solid-state bioreactor[J]. Process Biochemistry, 2002, 37(8): 909-914.

[11] RENARD C M G C, LEMEUNIER C, THIBAULT J F. Alkaline extration of xylogiucan from depectinised apple pomace: optimization and characterization[J]. Carbohydrate Polymers, 1996, 28(3): 209-216.

[12] 牛天贵. 食品微生物学实验技术[M]. 北京: 中国农业大学出版社, 2002: 20-28.

[13] GB/T 4789.2—2010 食品微生物学检验 菌落总数测定[S].

[14] 齐祖同. 中国真菌志第五卷[M]. 北京: 科学出版社, 1997: 28-103.

[15] 巴尼特 J A. 酵母菌的特征与鉴定手册[M]. 胡瑞卿, 译. 青岛: 青岛海洋大学出版社, 1991.

[16] 魏景超. 真菌鉴定手册[M]. 上海: 上海科学技术出版社, 1979: 107-499.

[17] 东秀珠, 蔡妙英. 常见细菌系统鉴定手册[M]. 北京: 科学出版社, 2001: 244-294.

[18] 布瑞德. 伯杰氏系统细菌学手册[M]. 北京: 科学出版社, 2004: 194-797.

[19] MANTER D K. Use of the ITS primers, ITS1F and ITS4, to characterize fungal abundance and diversity in mixed-template samples by qPCR and length heterogeneity analysis[J]. Journal of Microbiological Methods, 2007, 71(1): 7-14.

[20] de LIMA J R, GONÇALVES L R, BRANDÃO L R, et al. Isolation, identi?cation, and activity in vitro of killer yeasts against Colletotrichum gloeosporioides isolated from tropical fruits[J]. Journal of Basic Microboology, 2013, 53(7): 590-599.

[21] LIU Wenjun, BAO Qiuhua, JIRIMUTU, et al. Isolation and identi?cation of lactic acid bacteria from Tarag in Eastern Inner Mongolia of China by 16S rRNA sequences and DGGE analysis[J]. Microbiological Research, 2012, 167(2): 110-115.