随机扩增多态性法分析西藏牦牛奶酪中
乳酸菌的遗传多样性

蒋厚阳1，赵国华1,2，杨吉霞1,2,*

（1.西南大学食品科学学院，重庆 400715；2.重庆市农产品加工技术重点实验室，重庆 400715）

摘 要：目的：利用随机扩增多态性（randomly amplified polymorphic DNA，RAPD）法对西藏地区牦牛奶酪中27 株乳酸菌基因型进行同源性分析。方法：利用5 个随机引物对Mg2+浓度、dNTP用量、退火温度、模版用量/引物用量（ng/pmol）4 个条件做单因素梯度试验，建立最佳反应条件，筛选最佳引物，然后对27 株乳酸菌和4 株乳酸菌标准菌株进行随机扩增，用NTsys 2.10e软件对扩增条带进行聚类和遗传相似性系数分析，分析结果与16S rRNA测序得到的菌种鉴定结果进行对比。结果：31 株菌遗传相似系数在0.72～1.00之间，当相似性系数在0.82时，菌株被分成了8 组，菌株按照不同种属聚类，聚类结果同16S rRNA测序结果基本一致，同时成功将Lactobacillus casei和Lactobacillus paracasei两个亚种区分开。结论：RAPD技术可以较好地应用于西藏地区牦牛奶酪中乳酸菌亲缘性关系分析。

关键词：西藏；牦牛奶酪；乳酸菌；随机扩增多态性；聚类分析

Randomly Amplified Polymorphic DNA Analysis of Lactic Acid Bacteria from Yak Milk from Tibet Area

JIANG Hou-yang1, ZHAO Guo-hua1,2, YANG Ji-xia1,2,*

(1. College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China;

2. Chongqing Key Laboratory of Agricultural Product Processing, Chongqing 400715, China)

Abstract: Objective: This study analyzed the homology of 27 strains of lactic acid bacterial genotype from Tibetan yak cheese by randomly amplified polymorphic DNA (RAPD) method. Methods: To establish a reliable RAPD protocol with 5 primers, the optimal primers and PCR conditions for the quality and reproducibility of RAPD profiles were investigated, including Mg2+ concentration, dNTP amount, annealing temperature, and DNA template/primer ratio. The optimal PCR procedure and reaction reagent concentration were employed for RAPD amplification of 27 isolates from yak milk cheeses and 4 standard strains of lactic acid bacteria. Electrophoretic profiles were analyzed by NTsys 2.10e software, genetic similarity coefficients were calculated and a cluster dendrogram was plotted. Results: Genetic similarity coefficients of 31 strains ranged from 0.72 to 1.00. The cluster dendrogram showed that 31 isolates were classified into 8 groups using the similarity coefficient of 0.82 as a cut-off point. The group discrimination corresponded well with the species assignment by 16S rRNA sequence analysis, and Lactobacillus casei and Lactobacillus paracasei were separated successfully. Conclusion: The RAPD technique was useful for relationship analysis of lactic acid bacteria isolated from Tibetan yak milk cheeses.

Key words: Tibet; yak milk cheese; lactic acid bacteria; randomly amplified polymorphic DNA (RAPD); cluster analysis

中图分类号：TS252.54 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）23-0215-06

doi:10.7506/spkx1002-6630-201423042

西藏牦牛素有“高原之舟”的美称，是我国的重要畜种。在高原地区牦牛乳及其制品是当地居民的重要食品。目前对于牦牛乳及其成分的报道日渐增多，但是对于牦牛奶酪中乳酸菌的报道却很少。

乳酸菌作为奶酪发酵过程中的关键菌种，对其进行分类鉴定有着极其重要的意义。

随机扩增多态性（randomly amplified polymorphic DNA，RAPD）技术最初是由美国科学家Williams[1]和Welsh[2]等运用于基因多态性分析中。它应用短的随机引物，通过聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）随机扩增后产生特异性的DNA图谱，具有多态性高、操作简单，引物没有严格限制，可以实现高通量测定等优点。扩增图谱重现性不高是RAPD面临的一个问题，但是通过PCR反应程序和体系的优化，引物的筛选可以解决图谱重现性这个问题[3-4]。目前很多国外学者将RAPD技术应用于乳酸菌基因型的研究中，如乳酸球菌属[5]（Lactococcus）、明串珠菌属[6]（Leuconostoc）、乳杆菌属[7]（Lactobacillus）、肠球菌属[8]（Enterococcus），很好地区别开亲缘性较近的菌种。但是国内只有很少文献报道了RAPD在乳酸菌基因分型中的应用。如高大威等[9]利用RAPD技术对鲜牛奶、西红柿和酸菜中分离出的乳酸菌进行聚类分析，确定了乳酸菌间亲缘性关系。秦丹[10]利用RAPD方法对四川腊肉和香肠在加工和贮藏过程中的乳酸菌进行分析，并将结果与传统微生物培养法进行比较，两种方法得到的结果不完全相同。

本研究通过筛选出随机引物M13，单因素试验获得较好的图谱重现性后对27 株分离纯化后的乳酸菌和4 株乳酸菌标准菌株进行RAPD扩增，用NTsys 2.10e软件对扩增后图谱进行聚类分析，将聚类结果与各个菌株产地进行归类对比，同时与16S rRNA序列分析后的菌种鉴定结果结果进行对比，从而探讨RAPD技术在天然乳酸菌菌种分类鉴定方面的应用价值。

1 材料与方法

1.1 菌种、培养基与试剂

供试菌株分离自西藏牦牛奶酪，由西藏农牧学院提供（表1）。标准菌株：Lactobacillus casei ATCC 393，Lactobacillus paracasei ATCC BAA-52，Lactobacillus plantarum ATCC 8014，Lactobacillus rhamnosus ATCC 7469，购于青岛海博生物技术有限公司。

表 1 供试菌株

Table 1 Strains isolated from yak milk cheeses

MRS培养基的配制参照参考文献[11]。

Lambda DNA/Hind Ⅲ Marker 北京鼎国生物科技有限公司；Taq酶（5 U/µL）、dNTPs（10 mmol/L）、10×酶
缓冲液、MgCl2（25 mmol/L） 宝生物工程（大连）有限公司；1 kb DNA Ladder、溶菌酶、乙二胺四乙酸钠、Tris-base、异硫氰酸胍、焦碳酸二乙酯 加拿大BBI公司；琼脂糖 西班牙Agarose公司；蛋白酶K 美国Sigma公司；Gelred核酸染料 美国Biotium公司；细菌基因组提取试剂盒 天根生化科技（北京）有限公司；实验引物100 bp DNA Ladder 生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 仪器与设备

HB031金属恒温加热器 上海博彩生物技术有限公司；SIM-F140AY65型制冰机 三洋国际贸易有限公司；1-15PK小型台式离心机 德国Sigma实验室离心机公司；Biospec-mini型岛津DNA/RNA/蛋白质分析装置 日本岛津制作所；S1000高性能PCR仪、164-5050伯乐基础电源电泳仪、Syngene GeneGenius 凝胶成像系统
美国Syngene有限公司；GL-88B涡旋混合器 海门市其林贝尔仪器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌DNA基因组提取

用试剂盒提取乳酸菌基因组DNA，提取DNA保存于－20 ℃冰箱中。测定提取DNA的OD260 nm、OD280nm及OD260 nm/OD280 nm值，DNA质量浓度ρ/（µg/mL）按下式计算[12]。

ρ= OD260 nm×50×n

式中：50为比例系数；n为稀释倍数。

1.3.2 乳酸菌16S rRNA PCR

采用细菌16S rDNA基因的通用引物[13]：正向引物为27f（5’-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3’），反向引物为1 492r（5’- GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3’）
对27 株菌提取的DNA进行扩增，扩增产物用2.0%琼脂糖进行凝胶电泳。将扩增产物送上海生物工程有限公司测序。

1.3.3 16S rRNA序列同源性分析

登陆NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）数据库，用BLAST软件将16S rRNA测序结果与已知序列进行相似性分析[11]，同时对27 个菌株的测序结果采用Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean（UPGMA）法进行聚类分析，并构建各菌株的遗传距离聚类图。

1.3.4 RAPD随机引物的筛选及PCR反应体系和条件的优化

随机引物的筛选：通过对5 条不同随机扩增引物（表2）进行PCR反应，根据条带的多态性和亮度选择出最适引物，进行后续单因素试验。

表 2 随机引物编号及序列

Table 2 Primers of RAPD and their sequences

PCR反应体系优化：预设PCR反应体系[15]为5 U/µL Taq酶0.2 µL，10 µmol/L引物0.5 µL，模版DNA/引物用量=20，10×Taq酶缓冲液（无Mg2+）2.5 µL，25 mmol/L MgCl2 2.5 µL，2.5 mmol/L dNTPs 0.6 µL。

Mg2+浓度优化：预设PCR反应体系中Mg2+ 浓度分别设为1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mmol/L，其余试剂浓度保持不变，选择最佳Mg2+浓度。

模版DNA/引物用量比优化：预设PCR反应体系中模版DNA/引物用量的比例分别设为5、10、20、40、80，其余试剂浓度保持不变，选择最佳模版DNA/引物用量比例。

dNTP用量优化：预设PCR反应体系中dNTP用量分别设为30、60、90、120、150 µmol/L；其余试剂浓度保持不变，选择最佳dNTP用量。

PCR反应条件优化：预设PCR反应程序[15]为94 ℃预变性3 min，94 ℃变性1 min；50 ℃退火1 min；72 ℃延伸2 min；35 个循环，然后72 ℃延伸10 min。

退火温度的优化：预设PCR反应条件中退火温度分别设为46、47、48、49、50℃，其余条件保持不变，选择最佳退火温度。

PCR扩增产物通过1.0%琼脂糖凝胶电泳（70 V，1 h），Gelred染色后凝胶成像。通过电泳条带的数量、亮度、重复性和特异性条带来确定最佳反应条件。

1.3.5 RAPD扩增产物检测

扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分离。取10 µL扩增产物与2 µL Loading Buffer混匀，点样于凝胶孔，用1 kb DNA Ladder作为分子质量标尺，电泳缓冲液为1×TAE，70 V恒压电泳60 min，Gelred染色后通过凝胶成像系统拍照。

1.3.6 RAPD 谱带分析

各菌株的扩增图谱上特定位点无条带的赋值为0，有条带的赋值为1，用NTsys 2.10e制作为“0，1”文件，采用UPGMA法进行聚类分析，并构建各菌株的遗传距离聚类图。

2 结果与分析

2.1 DNA提取和PCR扩增电泳图及16S rRNA序列同源性分析结果

M. Lambda DNA/Hind Ⅲ；1～27. 11-2、122-1、12-2、21-1、23-3、21-2、24-3、15-1、13-3、02-1、12-1、14-3、26-1、123-4、16-4、20-1、17-1、16-1、16-2、19-1、17-5、20-2、28-1、123-2、19-2、14-1、125-2。

M. 100 bp DNA Ladder；1～27. 11-2、122-1、12-2、21-1、23-3、21-2、24-3、15-1、13-3、02-1、12-1、14-3、26-1、123-4、16-4、20-1、17-1、16-1、16-2、19-1、17-5、20-2、28-1、123-2、19-2、14-1、125-2。

图 1 DNA电泳图（a）和16S rRNA片段扩增图（b）

Fig.1 Electrophoresis of genomic DNA (a) and 16S rRNA
amplification products (b)

图1a显示了27 株菌的DNA提取结果，OD260 nm/OD280 nm的范围在1.8～2.2之间，在23 000 bp处有明显的单一条带。图1b显示了27 株菌16S rRNA的PCR扩增结果，在1 500 bp处有明显的单一条带。说明各菌株基因组DNA均被成功提取出，同时成功扩增出目标片段。

图 2 27株菌的16S rRNA系统发育树

Fig.2 Phylogenetic tree of 27 strains based on 16S rRNA

由图2可知，27 株菌分为6 个大的分支，其中21-1、16-4、17-1、26-1、15-1、21-2、123-4、12-2、122-1、20-1、13-3、23-3、11-2、24-3、12-1、02-1、14-3、19-2位于一个分支，属于Lactobacillus casei或者Lactobacillus paracasei。125-2处于一个分支，属于Lactobacillus parabuchneri。16-1、16-2、19-1位于一个分支，属于Lactobacillus diolivorans。17-5、28-1、20-2位于一个分支，属于Lactobacillus plantarum。14-1位于一个分支，属于Lactobacillus helveticus。123-2位于一个分支，属于Leuconostoc mesenteroides。图中未能将Lactobacillus casei和Lactobacillus paracasei分开。

2.2 单因素试验结果

2.2.1 退火温度

M. 1 kb DNA Ladder；1～5. 46、47、48、49、50 ℃。

图 3 不同退火温度下菌株23-3的RAPD扩增图谱

Fig.3 Influence of PCR annealing temperature on RAPD profiles of strains 23-3

由图3可知，退火温度由46 ℃升到48 ℃过程中，条带的亮度逐渐增加，温度由48 ℃升到50 ℃的过程中，条带的亮度和数量保持不变，同时条带整体重现性较好，考虑到退火温度较低时引物与模版结合更好，所以PCR反应中退火温度选用48 ℃。

2.2.2 模版DNA/引物用量比

M. 1 kb DNA Ladder；1～5. 模版DNA/引物用量比为5、10、20、40、80。

图 4 不同模版DNA/引物用量对菌株23-3 RAPD扩增图谱的影响

Fig.4 Influence of DNA template/primer ratio on RAPD profiles of strains 23-3

由图4可知，电泳条带的整体重现性很好，在模板DNA/引物用量比为5和10的情况下出现5 个条带，同时考虑到在用量比为10情况下条带亮度更佳，所以25 μL PCR反应体系模版DNA/引物用量比选用10。

2.2.3 Mg2+浓度

M. 1 kb DNA Ladder；1～5. Mg2+浓度为1.0、1.5、2.0、2.5 、3.0 mmol/L。

图 5 不同Mg2+浓度对菌株23-3 RAPD扩增图谱的影响

Fig.5 Influence of Mg2+ concentration on RAPD profiles of strains 23-3

由图5可知，电泳条带整体重现性很好，随着Mg2+浓度的升高，条带的亮度逐渐增加，在Mg2+浓度为3.0 mmol/L时效果最佳，所以25 µL PCR反应体系中Mg2+的浓度选用3.0 mmol/L。

2.2.4 dNTP用量

M. 1 kb DNA Ladder；1～5. dNTP浓度为30、60、90、120、150 μmol/L。

图 6 不同dNTP用量对菌株23-3 RAPD扩增图谱的影响

Fig.6 Influence of dNTP amount on RAPD profiles of strains 23-3

由图6可知，随着dNTP用量的增加条带的亮度显著增加，在150 μmol/L时达到最亮，同时条带整体重现性较好，在150 µmol/L条件下达到了7 条，所以25 µL PCR反应体系中dNTP用量选用150 µmol/L。

经过单因素试验，得到优化的RAPD扩增程序为：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性1min；48 ℃退火1 min；72 ℃延伸2 min；35 个循环，然后72 ℃延伸10 min。优化的PCR反应体系为：25 µL总反应体积，模版DNA/引物用量=10，10×Taq酶缓冲液（无Mg2+）2.5 µL，25 mmol/L
MgCl2 3.0 µL，2.5 mmol/L dNTPs 1.5 µL，10 µmol/L引物0.5 µL，5 U/µL Taq酶0.2 µL，灭菌纯水补至25 µL。对4 株乳酸菌标准菌株和27 株分离乳酸菌进行RAPD扩增。

2.3 整体乳酸菌RAPD图谱

由图7可知，27 株西藏牦牛奶酪分离乳酸菌和4 株乳酸菌标准菌株用M13引物扩增并电泳后，所有菌株均扩增出明显的条带，同时16S rRNA鉴定出相同属的菌株之间可以看出明显的相似性，各个菌株之间也存在特异性，扩增出的条带数目在3～10 条之间，所获得的片段分子质量大小在250～3 000 bp之间。

M. 1 kb DNA Ladder；1～31. Lactobacillus casei ATCC 393、02-1、11-2、12-1、16-4、19-2、20-1、21-1、21-2、23-3、24-3、26-1、123-4、Lactobacillus paracasei ATCC BAA-52、13-3、14-3、122-1、12-2、15-1、17-1、Lactobacillus plantarum ATCC 8014、17-5、20-2、28-1、16-1、16-2、19-1、Lactobacillus rhamnosus ATCC 7469、14-1、123-2、125-2。

图 7 牦牛奶酪中31株乳酸菌的RAPD扩增图谱

Fig.7 RAPD profiles of 31 strains isolated from yak milk cheeses

2.4 聚类分析结果

图 8 31 株乳酸菌亲缘关系聚类树状图

Fig.8 Cluster dendrogram generated from similarity coefficient matrix of 31 lactic acid bacteria

用NTsys2.10e软件，按照UPMGA法，对供试菌株之间的遗传相似系数矩阵进行聚类分析，得到聚类分析图。由图8可知，当相似性系数为0.82时，分离自牦牛奶酪的27 株乳酸菌和4 株乳酸菌标准菌株被分成了8 个组。第一组包括11-2、122-1、12-2、21-1、23-3、21-2、24-3、15-1、13-3、02-1、12-1、19-2、14-3、17-1和casei标准菌株，它们都是Lactobacillus casei。第二组只有一支菌123-2，为Leuconostoc mesenteroides。第三组中16-1、16-2、19-1聚为第一分支，它们是Lactobacillus diolivorans。另一分支为125-2，是Lactobacillus parabuchneri，Lactobacillus rhamnosus单独成为一个分支。第四组只有一支菌14-1，为Lactobacillus helveticus。第五组中paracasei标准菌株单独成为一分支，26-1和123-4聚为另一分支，为Lactobacillus paracasei。第六组只有一支菌16-4，为Lactobacillus casei。第七组只有一支菌20-1，为Lactobacillus casei。第八组包括17-5、28-1、20-2和plantarum标准菌株，它们都是Lactobacillus plantarum。通过聚类分析图和16S rRNA测序结果之间的相互比较可以发现RAPD聚类分析结果同16S rRNA测序结果基本一致，但是16S rRNA 进化树图并不能够将Lactobacillus paracasei和Lactobacillus casei两个亚种区分开，而利用RAPD聚类分析结果可以将其区分开。由此可以得出在乳酸菌基因型分类鉴定中，RAPD对于亲缘型很近菌株的鉴定效果要优于16S rRNA同源性分析，更适合于西藏牦牛奶酪中乳酸菌亲缘性关系分析。

3 讨 论

西藏地区居民主要采用传统手工方法制作奶酪，由于产地、乳酸菌种、制作工艺的不同，导致奶酪风味和质地的多样化。乳酸菌又是奶酪制作过程中的核心，是奶酪品质好坏的关键。建立系统的鉴定方法对奶酪中乳酸菌进行分析，会对当地奶酪制品质量的提高起到很大的借鉴作用。

目前对于细菌的鉴定主要有表型鉴定和基因型鉴定两种方法。表型鉴定不仅在操作上具有一定的复杂性，同时在鉴定的水平上只能达到属的水平，难以达到种水平的鉴定[16]。而RAPD技术运用随机引物对不同种群的基因组DNA进行扩增，不仅可以在分子水平上对菌株之间进行分类和鉴定，还可以整体基因组DNA进行多态性检测，同时操作简易，准确性高。许多国外学者已经成功地将RAPD技术应用于乳酸菌的分离鉴定。如Gevers等[17]
运用随机引物（GTG）5成功地完成对干香肠中乳杆菌亚种的分类和鉴定。Corroler等[18]运用RAPD技术对不同季节采集的牛奶中L. lactis subsp. lacti和L. lactis subsp. cremoris两个亚种进行分类和鉴定。Cocconcelli等[19]运用RAPD技术区分开嗜酸乳杆菌（L. acidophilus）、瑞士乳杆菌（L. helveticus）、干酪乳杆菌（L. casei）、植物乳杆菌（L. plantarum）、粪肠球菌（Ent. faecalis）、屎肠球菌（Ent. faecium）、嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）等菌株。Nigatu等[20]利用RAPD技术对
45株乳杆菌进行区分，所有菌株均扩增出了不同的多态性条带，并且相似度在72%以上，对乳杆菌属进行了最集中和广泛的研究。

本研究利用16S rRNA和RAPD技术对西藏牦牛奶酪中乳酸菌的基因型和遗传多样性进行了分析，用NTsys 2.10e软件计算出了31 株乳酸菌菌株之间的遗传相似系数矩阵，并用UPMGA法作聚类分析图，与16S rRNA序列分析结果相对比。在与16S rRNA序列分析结果的比较中，两种基因型方法得出的结果基本是一致的。同时在RAPD的聚类图中将L. casei和L. paracasei这两个亚种有效地区分开来，这是16S rRNA技术在进行同源性分析时做不到的，同时相关文献中也无类似报道。综合比较结果考虑，RAPD技术在乳酸菌分类鉴定中有一定的应用价值，同时它有操作简单快速、种间和种内区分效率高、费用低的优势，与其他表型和基因型方法相结合，可提高菌种鉴定效率和准确性。

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