黄浆水中高产γ-氨基丁酸乳酸菌的筛选及鉴定

刘佳荣，梁金钟*

（哈尔滨商业大学食品工程学院，黑龙江省高校食品科学与工程重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150076）

摘 要：经初筛、复筛，从黄浆水中筛得一株高产γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）的菌株，对其进行形态学及生理生化鉴定，并与GenBank上已提交的16S rDNA进行BLAST比对，结果表明，其归属于乳酸杆菌属（Lactobacillus）。由MEGA 6.0软件构建的系统发育树结果表明，该菌株与Lactobacillus plantarum 16S rDNA序列同源性达99%，且与生理生化实验结果一致，因此，确定该菌株为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum），编号为LP-Dfa301，测得其发酵液中GABA产量为5.833 g/L。

关键词：γ-氨基丁酸；乳酸菌；黄浆水；16S rDNA；系统发育树

Screening of Lactic Acid Bacteria with High Yield of Gamma-Aminobutyric Acid from Yellow Serofluid,
the Wastewater from Tofu Production

LIU Jia-rong, LIANG Jin-zhong*

(Key Laboratory of Food Science and Engineering, School of Food Engineering, Harbin University of Commerce,

Harbin 150076, China)

Abstract: After primary screening and rescreening, a high-yield strain producing γ-aminobutyric acid (GABA) was isolated from yellow serofluid, the wastewater from tofu production. Morphology analysis, physiological and biochemical properties and 16S rDNA sequences in GenBank indicated that the strain belonged to the Lactobacillus genus. Then, the phylogenic tree generated by MEGA 6.0 software revealed that it was closely related to Lactobacillus plantarum with a similarity of 99%, and numbered LP-Dfa301. In the fermentation broth, GABA production could reach 5.833 g/L.

Key words: γ-aminobutyric acid (GABA); Lactobacillus; yellow serofluid; 16S rDNA; phylogenic tree

中图分类号：Q939.97 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）23-0221-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201423043

γ-氨基丁酸（gamma-aminobutyric acid，GABA），又称氨酪酸、4-氨基丁酸，分子式为C4H9O2N，相对分子质量为103.12[1]。结构式及三维结构见图1。

图 1 GABA的结构式（a）及三维结构（b）

Fig.1 Formula (a) and three-dimensional structure (b) of GABA

GABA有多种生理功能，如：延缓大脑衰老、降低血压[2]、降低血氨、治疗神经疾病[3]、抗心律失常、健肝利肾、预防肥胖、醒酒、改善更年期综合征等[4]。已成为一种新型活性因子，广泛用于医药与食品领域并成为研究热点[5]。新型GABA抑制剂研究开发的成功，以及其分子生物学方面的研究成果使GABA这一靶标引起农药学家和昆虫毒理学家的重视[6]。而作为饲料添加剂可以显著提高畜禽的生产能力。因此，加强GABA相关产品的安全性能及其副产品的研制开发，将丰富饲料添加剂的种类，有益于畜牧业的可持续发展[7]。

目前，制备GABA的方法主要有[8]：化学合成法、植物富集法和微生物发酵法3 种。化学法速度快、得率高，但成本高、安全性差；植物富集法含量很低，造价高且浪费资源；与前两者比较，生物法则具有成本低、发酵周期短、产率较高、安全性高等优点。微生物发酵法原以大肠杆菌作为合成GABA的菌株，但其存在安全卫生方面的隐患[9]。利用大肠杆菌合成GABA是因为其拥有谷氨酸脱羧酶（glutamic acid decarboxylase，GAD）活性[10]。最新的一些研究报道[11-12]称，天然乳酸菌的耐酸生长机制可能与它们含有的GAD活力有关，启示可以利用乳酸菌生物合成GABA。其微生物发酵原理[13-14]见图2。

图 2 微生物发酵产GABA原理

Fig.2 Microbial fermentation for GABA production

GAD是生物体催化谷氨酸（Glu）脱羧生成GABA的关键酶。乳酸菌中的乳球菌和乳杆菌均具有GAD[15]。目前，已有从酒糟中分离出短乳杆菌（Lactobacillus brevis）[16]、从酸菜中分离出嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）[17]和植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum） [18]等的报道。

国内许多学者都对产GABA的乳酸菌有所研究及筛选，东北农业大学的姚子鹏等[19]对乳酸菌发酵黄浆水富集GABA有所研究，但未从黄浆水中筛选产GABA的菌株。随着我国豆腐行业的发展，黄浆水的产量越来越高，因此，黄浆水的处理问题日益受到关注。黄浆水中富含丰富的营养物质和无机盐[20]，适应微生物生长。从中筛选出产GABA的菌株，可以增加黄浆水的利用价值。而且国内生物法生产GABA大部分进行全细胞转化液固定化生产，产率虽高，但其运用的磷酸吡哆醛（pyridoxal phosphate，PLP）等辅酶造价却很高，且固定化步骤繁琐不适于大规模工业化生产。本实验旨在从黄浆水中筛选出一株高产GABA的菌株并对其进行生理生化鉴定及构建16S rDNA系统发育树。采用直接发酵法生产GABA，为今后大规模工业化生产GABA的实现提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黄浆水，取自农贸市场。

硅胶板（GF254） 浙江省台州市路桥四甲生化塑料厂；γ-氨基丁酸 上海阿拉丁公司；冰乙酸 沈阳市新西试剂厂；L-谷氨酸钠（L-monosodium glutamate，L-MSG） 黑龙江成褔食品有限公司；溶菌酶 北京索莱宝科技有限公司；蛋白酶K、十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）、Binding Buffer 科博赛尔科技发展有限公司；正丁醇 天津市永大化学试剂有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

Motic BA200显微镜 上海仪圆光学仪器厂；S-3400扫描电镜 天美日立公司；BS 224S电子天平 赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；LRH-生化培养箱 上海一恒科技有限公司；723N可见分光光度计 上海精密科学仪器有限公司；H1650-W台式高速离心机 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；T100-PCR扩增仪 杭州
博日科技有限公司；SIM凝胶透成像系统 百维信生物生物科技有限公司；JY5000电泳仪 北京市君意机电技术公司。

1.3 培养基

乳酸菌分离培养基（BCP培养基）[18]：乳糖5.0 g/L、酵母粉5.0 g/L，溴甲酚紫溶液（质量浓度5 g/100 mL水溶液）2.5 mL，pH 6.8～7.0。固体培养基：液体培养基中加入琼脂20.0 g/L（121 ℃，灭菌15 min）。

菌种活化、保藏及分离培养基（MRS培养基）：蛋白胨10.0 g/L、酵母粉5.0 g/L、牛肉粉10.0 g/L、无水乙酸钠5.0 g/L、柠檬酸氢二铵2.0 g/L、葡萄糖10.0 g/L、MgSO4•7H2O 0.5 g/L、MnSO4 0.25 g/L、K2HPO4 2.0 g/L，
吐温-80 1.0 mL，自然pH值。固体培养基：液体培养基中加入琼脂20.0 g/L（121 ℃，灭菌15 min）。

发酵培养基（TYG培养基）：胰蛋白胨5.0 g/L、葡萄糖10.0 g/L、酵母粉2.0 g/L、丁二酸钠5.0 g/L、L-MSG 10.0 g/L，自然pH值（105 ℃，灭菌20 min）。

1.4 方法

1.4.1 菌株的分离筛选

将购自农贸市场的黄浆水充分摇匀后按2%接种量接种于MRS液体培养基中，37 ℃富集培养48 h，取1 mL菌液加入9 mL无菌生理盐水制成菌悬液，进行梯度稀释。取0.1 mL适宜稀释倍数的菌悬液涂布于固体BCP平板上，37 ℃恒温培养48 h。用接种环挑取单个周围发黄菌落于固体MRS平板上，反复3～4 次划线，至菌落性状稳定后转接到MRS试管斜面中保存[21]。

1.4.2 GABA的测定

1.4.2.1 GABA的定性测定

将斜面中的菌株接种到MRS中，37 ℃培养20 h，再按2%的接种量接种于TYG培养基中，37 ℃培养72 h。7 000 r/min离心10 min，取上清液点样，采用改良薄层层析法进行定性分析[22]。薄层层析展开剂为：V（正丁醇）∶V（冰醋酸）∶V（水）=4∶1∶3（含4 g/L水合茚三酮），以1 g/L GABA做对照，距离硅胶板底边缘1 cm点样2 μL（直径不超过4 mm），展开剂中层析2 h，层析完毕自然干燥后90 ℃显色10 min，比较Rf值。

1.4.2.2 GABA的定量测定

Berthelot改良比色法[23]标准曲线的绘制：配制质量浓度为0.00、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60 g/L
的GABA标准溶液。取0.4 mL不同质量浓度的GABA标准溶液，分别加入1 mol/L的Na2CO3溶液0.1 mL；0.2 mol/L pH 9.0的四硼酸钠缓冲溶液0.5 mL；质量浓度为6 g/100 mL的苯酚水溶液1 mL；含有10%有效氯的次氯酸钠溶液1 mL，振荡混匀，放置10 min。然后沸水浴10 min；最后冰浴20 min，待溶液出现蓝绿色后加入体积分数为60%乙醇水溶液2 mL，振荡混匀，放置30 min。在640 nm波长处测定其光密度值，并做平行样。最后以GABA的质量浓度为横坐标，OD640 nm为纵坐标绘制标准曲线。

将复筛后的菌株进行发酵实验，将液体MRS培养基的种子液按2%的接种量接种于TYG发酵培养基中，37 ℃培养72 h，7 000 r/min离心10 min，取上清液1 mL，稀释10～20 倍，取0.4 mL稀释后的发酵液，根据1.4.2.2节中测定GABA标准曲线的方法测定GABA含量。同时取适量发酵液，送至农业部谷物及制品质量监督检验测试中心（哈尔滨）进行氨基酸分析及GABA产量测定。对比Berthelot比色法确定GABA产量。

1.4.3 菌株的鉴定

1.4.3.1 菌株的形态学及生理生化鉴定

挑取单个菌落进行革兰氏染色，观察其形态并做电镜扫描。根据《伯杰氏细菌鉴定手册》对菌株进行生理生化实验鉴定[24]。

1.4.3.2 野生菌株基因组的提取

吸取37 ℃条件下活化48 h的菌液1 mL，12 000 r/min
离心2 min。弃上清液，加180 µL 2 mg/mL溶菌酶，再加20 µL 20 mg/mL蛋白酶K，55 ℃保温15 min。加10 µL 10% SDS，涡旋（反复倒置）5 s，再加200 µL Binding Buffer，涡旋5 s，70 ℃保温10 min。加入95%乙醇200 µL，涡旋5 s。沉淀与絮状沉淀加入吸附柱，12 000 r/min离心1 min，弃上清液。加漂洗液First Buffer 500 µL，12 000 r/min离心1 min，弃上清液，重复洗涤。加漂洗液Second Buffer 500 µL，
12 000 r/min离心1 min，弃上清液。将吸附柱放回收集管中，12 000 r/min离心2 min，倒废液，开盖，室温放置10 min。将吸附柱转入一个干净的离心管中，向吸附柱中间加100 µL 65 ℃ pH 8.5的TE Buffer洗脱液，室温放置2～5 min，13 000 r/min离心2 min。

1.4.3.3 菌株16S rDNA聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增

使用细菌16S rDNA的通用引物进行扩增。

反应体系：DNA模板10 μL，10×PCR缓冲液5 μL，正向引物2 μL，反向引物2 μL，dNTPmix 8 μL，Taq DNA聚合酶（Hifi）1 μL，ddH2O 67 μL，总反应体积为100 μL（混匀后快速离心15 s，50 μL分装）。

PCR循环参数：95 ℃变性5 min；95℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃ 155 s，32 个循环；72 ℃延伸7 min，取扩增产物10 μL，用1%琼脂糖凝胶电泳[25]。

1.4.3.4 菌株16S rDNA序列比对分析及系统发育树的构建

将菌株的16S rDNA PCR扩增产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序，测序结果在NCBI（网址：http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi.）中经BLAST后与GenBank库中已有序列比对分析并构建系统发育树[26]。

2 结果与分析

2.1 菌株的分离筛选及产GABA的性能鉴定

2.1.1 产GABA菌株的分离筛选（初筛）

通过溴甲酚紫（bromocresol purple，BCP）乳酸菌分离培养基选得1 400多株产乳酸的菌株，按1.4.2.2节所述方法检测上清液中GABA的含量，将其中GABA产量较高的菌株保存于MRS斜面中留作复筛用。

2.1.2 TYG发酵液中GABA的定性及定量测定（复筛）

2.1.2.1 TYG发酵液中GABA的定性测定

发酵液经离心后按1.4.2.1节所述的方法，进行薄层层析，与GABA标准品比较Rf值，确定其产GABA的能力，结果见图3。

图 3 薄层层析结果

Fig.3 Result of thin layer chromatography

由图3可知，编号为Dfa301、Dfa432、Dfa650具有与GABA标准品具有相同的Rf值，可以断定此3 株菌均具有产GABA能力，且层析斑点颜色较深、直径较大，可以确定其产GABA能力也较高。随后将这3 株菌株进行GABA定量测定。

2.1.2.2 TYG发酵液中GABA的定量测定

按1.4.2.2节所述的方法，以GABA标准溶液质量浓度为横坐标，OD640 nm为纵坐标绘制标准曲线。统计分析得回归方程y=1.342 9x－0.007 1，相关系数R2=0.995 6。证明GABA质量浓度在0～0.6 g/L的范围内与OD640 nm值相关性较好。随后按1.4.2.2节所述的方法进行复筛，复筛结果如表1所示。

表 1 各菌株GABA产量

Table 1 Production of GABA from four isolates

由于Berthelot比色法易受游离氨基的干扰而不适宜测定复杂培养基中GABA的含量[23]，所以将产量最高的编号为Dfa301的菌株送至农业部谷物及制品质量监督检验测试中心（哈尔滨）进行氨基酸分析及GABA产量测定（图4），与Berthelot比色法进行对比。

图 4 氨基酸自动分析仪图谱

Fig.4 Profile obtained with automatic amino acid analyzer

由图4可知，根据GB/T 5009.124—2003《食品中氨基酸的测定》[27]国标所列举的方法利用氨基酸自动分析仪测定TYG发酵液中游离氨基酸总量仅占0.172%；保留时间为8.72 min时出现一个特征峰为谷氨酸，其残留量为4.167 g/L；保留时间为21.75 min时出现一个特征峰为GABA，其产量为5.833 g/L。与Berthelot比色法比较误差较小，因此，将编号为Dfa301作为最终实验菌株对其进行鉴定，其TYG发酵液中GABA产量为5.833 g/L。

2.2 菌株的形态学及生理生化鉴定

2.2.1 菌株的菌落形态

图 5 菌落形态特征

Fig.5 Colonies of strain Dfa301

由图5可知，肉眼观察MRS平板上Dfa301的菌落形态呈不规则圆形，初期呈乳白色，直径在1 mm左右，边缘有透明状，表面微微隆起。菌落易于挑取，在液体培养基中呈混浊状态，为兼性厌氧型细菌。

2.2.2 菌株的细胞形态

利用光学显微镜观察菌株Dfa301为短杆状细菌单个或成对排列；不运动，无鞭毛；不产芽孢。经革兰氏染色确定其为革兰氏阳性菌（G＋），见图6a。再经扫描电镜，在放大倍数为7 000 倍条件下观察，可以清楚的看到Dfa301菌体形态呈短杆状，长6.4～15.5 μm，宽2.0～4.1 μm（图6b）。

a

b

图 6 Dfa301菌株革兰氏染色形态特征（a）及其电镜照片（b）

Fig.6 Morphology (a) and electron micrograph (b) of strain Dfa301 after Gram staining

2.2.3 菌株Dfa301的生理生化鉴定

表 2 菌株生理生化实验结果

Table 2 Physiological and biochemical properties of strain Dfa301

注：＋. 阳性反应；－. 阴性反应。表3同。

由表2可知，将菌株Dfa301于MRS液体培养基中37 ℃活化20 h后，分别接入相应培养基中观察实验现象：石蕊牛奶实验中初期（12～24 h）菌株可以使牛奶凝固，产酸后改变石蕊pH值，使其由蓝紫色变为红色，48 h后乳清析出，结果呈阳性；吲哚实验中乙醚与培养物之间未出现红色环状物，结果呈阴性；接触酶实验中在载玻片上的活菌中滴加体积分数为3% H2O2溶液未产生气泡，结果呈阴性；柠檬酸盐实验中培养基未发生颜色变化，因此不能利用柠檬酸盐产酸，结果呈阴性；明胶液化实验中不能使明胶液化，结果呈阴性；硫化氢实验中试管壁上的乙酸铅试纸未变黑，结果呈阴性。将菌株Dfa301划线于MRS平板上，37 ℃培养48 h，挑取单个菌落接入糖发酵管中，37 ℃恒温培养48 h，观察实验现象见表3。

表 3 糖发酵实验

Table 3 Sugar fermentation tests

由表3可知，菌株Dfa301不能利用棉子糖、松三糖、鼠李糖产酸，结果呈阴性；其他糖呈阳性。能利用葡萄糖酸盐产酸，但不能产气；能在25 ℃条件下生长，不能在45 ℃条件下生长；能在pH 4.5条件下生长，不能在pH 9.0条件下生长，由此对照《伯杰氏细菌鉴定手册》，可以初步确定菌株Dfa301为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）。

2.2.4 16S rDNA序列比对分析及分子生物学鉴定

2.2.4.1 菌株Dfa301基因组的提取及其16S rDNA的扩增

按1.4.3.2节的方法提取菌株Dfa301的基因组，并以此为模板，采用通用引物扩增16S rDNA，用1%的琼脂糖凝胶电泳，结果如图7所示。

1、2. Dfa301菌的16S rDNA PCR扩增产物。

图 7 菌株Dfa301的16S rDNA的扩增谱带

Fig.7 Amplified 16S rDNA bands from strain Dfa301

由图7可知，Dfa301菌的16S rDNA PCR扩增产物出现1条亮带，其大小为分子质量1 500 bp左右。

2.2.4.2 16S rDNA序列比对分析及系统发育树的构建

测序工作由生工生物工程（上海）股份有限公司完成，得到菌株Dfa301的16S rDNA序列，用BLAST软件与GenBank中已发表的16S rDNA序列进行同源性比较发现，与已公布序列同源性均达99%，随机选取其中20 株细菌用MEGA 6.0软件进行系统发育树的构建，如图8所示。

图 8 菌株Dfa301的系统发育树

Fig.8 Phylogenetic tree of Dfa301

由系统发育树（图8）可知，野生细菌Dfa301与已报道的Lactobacillus plantarum亲缘性一致，比对同源性均为99%，参照生理生化实验结果，将Dfa301菌株定名为Lactobacillus plantarum Dfa301，简写为LP-Dfa301。

3 结 论

本实验从黄浆水中筛选出1 400多株菌株，经过复筛筛选出3 株高产GABA的菌株。将其中一株产量最高（5.833 g/L，编号LP-Dfa301）的菌株进行形态学、生理生化鉴定并与GenBank上已提交的16S rDNA进行BLAST比对，表明其归属于乳酸杆菌（Lactobacillus）属。由MEGA 6.0软件构建的系统发育树结果表明,菌株与Lactobacillus plantarum 16S rDNA序列同源性达99%，且与生理生化实验结果一致，因此，确定该菌株为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）。从黄浆水中筛选出产GABA的乳酸菌株，为富含GABA食品级添加剂的开发及应用提供了基础，今后可在诱变育种、发酵工艺优化及基因技术等方面着手研究，提高菌株的GABA产量。还可以利用该菌株发酵黄浆水产GABA，以提高黄浆水的利用价值，避免资源浪费。

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