γ-氨基丁酸产生菌的筛选及培养基优化

徐林敏,张 充,陆兆新,别小妹,赵海珍,吕凤霞*

(南京农业大学食品科技学院,江苏 南京 210095)

 

摘 要:采用纸层析法对南京地区多个不同场所采集的土样进行了菌种分离纯化,筛选到一株产γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)的菌株X-1,经形态特征与16S rDNA序列分析鉴定为巨大芽孢杆菌。通过单因素和正交试验对其发酵培养基进行优化,得到最佳培养基成分为葡萄糖30.0 g/L、蛋白胨30.0 g/L、K2HPO4 0.6 g/L、磷酸吡哆醇0.3 g/L、L-谷氨酸钠10.0 g/L、NaNO3 3.0 g/L、MgSO4•7H2O 0.5 g/L、FeSO4•7H2O 0.01 g/L。在此条件下,GABA浓度可达21.57 mmol/L,比优化前GABA浓度提高了3.83 倍。

关键词:γ-氨基丁酸;筛选;培养基优化

 

Screening of Gamma-Aminobutyric Acid-Producing Bacterium and Medium Optimization

 

XU Lin-min, ZHANG Chong, LU Zhao-xin, BIE Xiao-mei, ZHAO Hai-zhen, LÜ Feng-xia*

(College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

 

Abstract: A γ-aminobutyric acid (GABA)-producing strain X-1 was isolated from soil samples by paper chromatography. Based on morphological characteristics, and 16S rDNA sequence and phylogenic analyses, X-1 was identified as Bacillus megaterium. The culture medium of Bacillus megaterium X-1 was studied by single factor and orthogonal array designs. The optimal medium components were 30.0 g/L glucose, 30.0 g/L peptone, 0.6 g/L K2HPO4, 0.3 g/L pyrodoxal-5-phosphate,
10.0 g/L monosodium glutamate, 3.0 g/L NaNO3, 0.5 g/L MgSO4•7H2O, and 0.01 g/L FeSO4•7H2O. Using the optimized medium, the highest GABA yield of 21.57 mmol/L was obtained, representing a 4.83-fold increase over that before optimization.

Key words: γ-aminobutyric acid; screening; culture medium optimization

中图分类号:Q939.9 文献标志码:A 文章编号:1002-6630(2014)23-0238-07

doi:10.7506/spkx1002-6630-201423046

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA,也称氨酪酸)广泛分布于动植物中,是人和动植物体中一种非常重要的非蛋白质氨基酸。GABA不仅是动物中枢神经系统中有效的抑制性神经递质,有镇静、降血压、抗惊厥、癫痫、增进脑活力、营养神经细胞、促进生长激素分泌、保肝利肾等生理作用[1-6],还在非神经的组织中发挥激素或营养因子的功能,对动物机体正常的生理功能起着重要的调节作用[7-8],因而其在功能性食品及医药领域具有良好的应用前景。2009年,GABA被批准为新资源食品,目前GABA在食品工业中已广泛地应用于饮料、乳制品、烘焙食品等制品中[9-10]。

生物合成GABA的关键酶是谷氨酸脱羧酶(glutamate decarboxylase,GAD),其催化L-谷氨酸的α-脱羧反应,生成GABA。该酶在低等生物和高等生物中都可发现。微生物因其生长速度快、生长条件简单、发酵成本低等特点。因此,利用微生物中的GAD催化谷氨酸生产GABA,不受资源、环境和空间的限制,相对于复杂的植物富集和存在安全性问题的化学合成,具有显著的优点[11]。

目前已在多种微生物中发现了GAD的存在,如大肠杆菌、乳酸菌、酵母菌、霉菌等[12],但这些微生物的GAD活力普遍不高,且为胞内酶,GAD的提取纯化困难,不利于工业化生产。尤其,大肠杆菌发酵后会产生内毒素,存在安全性问题[13]。芽孢杆菌作为一种新的有潜在药用价值化合物的产生菌[14],自1971年首次报道产GABA以来,研究甚少。本实验从土壤中筛选高产GABA的芽孢杆菌,对其进行菌种鉴定,并采用单因素和正交试验对其发酵培养基进行优化,旨在探讨影响芽孢杆菌产γ-氨基丁酸的诸因素,以提高GABA的浓度,为今后工业化生产GABA提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌种

样品采集于土壤,采样于江苏省南京市紫金山、南京郊区奶厂和南京生态果园。

1.1.2 培养基

种子培养基:马铃薯200 g/L(切片水煮30 min,过滤取汁),葡萄糖20 g/L,pH值自然,115 ℃、30 min灭菌备用,固体培养基另加15.0~20.0 g/L的琼脂。

基础发酵培养基:葡萄糖30.0 g/L、酵母浸膏1.0 g/L、NaNO3 3.0 g/L、K2HPO4 1.0 g/L、KCl 0.5 g/L、MgSO4•7H2O 0.5 g/L、FeSO4•7H2O 0.01 g/L、L-谷氨酸钠5.0 g/L,调节pH值至6.0,于115 ℃、30 min灭菌备用。

1.1.3 试剂

γ-氨基丁酸(含量≥99%)、磷酸吡哆醛(pyrodoxal-5-phosphate,PLP) 美国Sigma公司;L-谷氨酸钠(L-monosodium glutamate,L-MSG,含量≥
99%) 江苏菊花味精集团有限公司;甲醇、四氢呋喃、丙酮(均为色谱纯) 美国Tedia公司;丹磺酰氯(dansyl chloride,DNS-Cl) Flukahcemei公司;细菌总DNA提取试剂盒 生工生物工程(上海)股份有限公司;其他试剂均为国产分析纯级试剂,水为自制超纯水。

1.2 仪器与设备

Agilent 1100 Series高效液相色谱(VWD检
测器) 美国Agilent公司;EUTECH pH510酸度计 美国Eutech公司;Centrifuge 5804R冷冻高速离心机 德国Eppendorf公司;HT6029超净工作台 苏州进化设备有限公司;BL-220H电子精密天平 日本岛津公司;PTC-100TM PCR仪 美国MJ Research公司。

1.3 方法

1.3.1 菌种筛选

称取10 g采集的样品,放入盛有100 mL生理盐水和玻璃珠的250 mL三角瓶中,于30 ℃、180 r/min培养30 min。将样品用灭菌生理盐水进行递度稀释涂布于PDA固体培养基中,30 ℃培养箱倒置培养72 h。挑取单菌落接入含5.0 g/L L-谷氨酸钠的发酵液中按30 ℃、
180 r/min进行摇瓶发酵72 h。

1.3.2 分析方法

1.3.2.1 定性检测

采用纸层析法。展开剂:V(正丁醇)∶V(冰醋酸)∶V(水)=4∶1∶3,内含质量浓度为4 mg/mL的水合茚三酮。以γ-氨基丁酸标准品作为对照,取发酵液上清液5 μL进行点样,层析3.5 h后将滤纸放于85 ℃烘箱中显色5 min,观察是否有GABA斑点。

1.3.2.2 定量分析

采用高效液相色谱法。将离心后的发酵上清液用0.2 mol/L(pH 9.8)的NaHCO3缓冲液稀100 倍,然后取20 μL,加入等量的(4 g/L)DNS-Cl丙酮溶液,置37 ℃条件下避光衍生化反应,用Agilent 5 HC-C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),流速0.6 mL/min,254 nm检测。流动相A为甲醇、B为乙酸钠缓冲液,梯度洗脱。洗脱时,流动相B的比例为:0~8 min,20%;8~25 min,20%~50%;26~34 min维持100%;35~50 min,返回20%[15]。

1.3.3 菌株鉴定

1.3.3.1 形态特征鉴定

按照参考文献[16]进行。

1.3.3.2 16S rDNA的扩增与测序

采用细菌总DNA提取试剂盒提取基因组DNA,采用细菌的16S rDNA通用引物进行PCR扩增。正向引物F1:5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’;反向引物R1:5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。PCR反应体系(总体积50 μL):10×PCR缓冲液5 μL;正、反向引物F1、R1 均为10 mmol/L各2.5 μL;dNTP(10 mmol/L)4 μL;基因组DNA1.0 μLTaqDNA聚合酶0.5 μL;双蒸水34.5 μL。PCR反应条件为:94 ℃预变性3 min;94 ℃变性50 s,55 ℃退火50 s,72 ℃延伸3 min,共进行30 个循环;再72 ℃延伸10 min。PCR产物测序由南京金思瑞生物技术公司完成。

1.3.3.3 序列比对及系统发育分析

将16S rDNA序列与GenBank+EMBL+DDBJ+PDB数据库中的核苷酸序列进行同源性分析。选择同源性较高及已报道产GAD的细菌16S rDNA核苷酸序列,利用Clustalx2.0进行多重联配,然后再利用MEGA5.0软件采用邻接(Neighbour-Joining)方法以E.coli O157∶H7为外群(out-group)构建系统发育树,并进行Bootstrap分析。

1.3.4 培养基成分优化

1.3.4.1 不同碳源对GABA发酵的影响

分别以30.0 g/L的葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉作为碳源作进行发酵实验,测定发酵液中GABA浓度,从而筛选出最佳的碳源。

1.3.4.2 碳源质量浓度对GABA发酵的影响

分别向基础发酵培养基中添加10.0、20.0、30.0、40.0、50.0 g/L的葡萄糖,30 ℃、180 r/min摇瓶发酵72 h,测发酵液中GABA浓度,确定合适的葡萄糖质量浓度。

1.3.4.3 不同氮源对GABA发酵的影响

分别向基础培养基中添加10.0 g/L的牛肉膏、蛋白胨、玉米浸膏、黄豆粉和酵母浸膏,筛选有机氮源。再以筛出的有机氮源与3.0 g/L NaNO3、尿素、磷酸氢二铵、硫酸铵分别组成复合氮源,测定发酵液中GABA浓度,确定最佳的氮源组成。

1.3.4.4 氮源质量浓度对GABA发酵的影响

分别向基础发酵培养基中添加10.0、20.0、30.0、40.0、50.0 g/L的蛋白胨,30 ℃、180 r/min摇瓶发酵72 h,测发酵液中GABA浓度,确定合适的蛋白胨质量浓度。再以最佳蛋白胨质量浓度为基础,别向发酵培养基中添加1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 g/L的NaNO3,30 ℃、180 r/min摇瓶发酵72 h,测发酵液中GABA浓度,确定合适的NaNO3质量浓度。

1.3.4.5 L-谷氨酸钠质量浓度对GABA发酵的影响

在基础发酵培养基中分别加入5.0、10.0、15.0、20.0、25.0 g/L的L-谷氨酸钠,确定最适的底物质量浓度。

1.3.4.6 无机盐及生长因子对GABA发酵的影响

选取K2HPO4、MgSO4、CaCl2、生物素和PLP,分别在基础发酵培养基中按不同质量浓度添加,确定最佳无机盐和生长因子。

1.3.4.7 正交试验优化

经单因素试验,筛选出发酵培养基中添加葡萄糖、蛋白胨、K2HPO4、PLP和L-MSG 5 种物质,设定五因素三水平试验,确定最佳培养基成分。

2 结果与分析

2.1 GAD产生菌的筛选

2.1.1 初筛

从南京市紫金山、南京郊区奶厂和南京生态果园的土壤中分离出487 株菌,对这些菌株进行摇瓶发酵,筛选出3 株有茚三酮显色斑点,菌株编号为X-1、X-2、X-3,结果见图1。

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1. GABA;2. L-MSG;3. 菌株X-1发酵液;4. 菌株X-2发酵液;5. 菌株X-3发酵液。

图 1 发酵液纸层析图

Fig.1 Paper chromatography of the fermented broth

2.1.2 复筛

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图 2 GABA标品(a)及发酵液(b)的高效液相色谱图

Fig.2 HPLC chromatograms of GABA standard (a) and the fermented broth (b)

采用高效液相色谱法对有显色斑点的菌株进行复筛,以确定待测菌株发酵液中GABA浓度。HPLC谱图如图2所示。以峰面积(y)对GABA质量浓度(x)作线性回归,制作GABA标准曲线,GABA质量浓度在0~5 g/L
内的标准曲线为y=871.55x+314.16(R2=0.998 6)。GABA的定量分析结果见表1。其中菌株X-2的发酵液中GABA浓度最高,达(17.19±0.09)mmol/L,
但经验证X-2为革兰氏阴性菌、无芽孢,故不再进行后续研究。而菌株X-1为芽孢杆菌,其发酵液中GABA的浓度为4.46 mmol/L,选取该菌株进行后续研究。

表 1 GABA产生菌筛选结果

Table 1 Screening of GABA-producing strains

菌株

纸层析

GABA浓度/(mmol/L)

X-1

4.46±0.14

X-2

17.19±0.09

X-3

1.15±0.19

 

 

2.2 菌种鉴定

2.2.1 菌株X-1形态特征

在PDA固体培养基中培养18 h,菌株X-1菌体短椭圆状,染色均匀、革兰氏染色阳性,芽孢近端生、圆形。初步判断菌株X-1属于芽孢杆菌属。

2.2.2 分子生物学鉴定

对菌株X-1的16S rDNA进行聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增,测序核苷酸序列为1 080 bp,GenBank登记号为NR074290。经与GenBank+EMBL+DDBJ+PDB数据库中报道的16S rDNA核苷酸序列比对,结果显示菌株X-1的16S rDNA核苷酸序列与巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)的16S rDNA核苷酸序列的同源性最高,达到99%。构建Neighbor-Joining系统进化树如3所示,菌株X-1的16S rDNA与已知的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)聚在一个分支上,相似性为100%。

结合X-1的形态特征和16S rDNA序列分析,菌株X-1鉴定为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)。

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分枝结点数值表示1 000次Bootstrap分析所支持次数;线段(0.02)表示0.02序列差异的分枝长度。

图 3 以16S rDNA序列为基础的系统发育树

Fig.3 Phylogenetic tree based on 16S rDNA

2.3 B. megaterium X-1生长曲线和产酶曲线

B. megaterium X-1进行摇瓶振荡培养,测定菌体OD600 nm和发酵液中GABA浓度随时间的变化情况,结果如4所示。B. megaterium X-1在2 h进入对数生长期,生长到12 h时菌体生长达到最高,12 h后进入稳定期,而GABA在发酵24 h后才开始产生,这可能是由于GABA的产生与巨大芽孢杆菌芽孢的形成有关[17]。

 

图 4 B. megaterium X-1的生长曲线及GABA浓度

Fig.4 Growth curve and GABA production of B. megaterium X-1

由图4可知,当菌体进入稳定期后,随着发酵时间的延长,GABA浓度逐渐提高,这种类型的合成方式在酶生物合成的模式中属于滞后合成型,该类酶所对应的mRNA稳定性较好,可以在细胞生长进入稳定期后相当长的一段时间内,继续进行酶的生物合成。考虑到随发酵时间延长,生产周期也延长,生产成本增加,所以确定72 h为B. megaterium X-1产GABA的发酵时间。

2.4 培养基组分优化

2.4.1 不同碳源对GABA发酵的影响

 

图 5 碳源对B. megaterium X-1产γ-氨基丁酸的影响

Fig.5 Effect of carbon sources on the production of GABA

不同碳源对B. megaterium X-1产GABA浓度影响,结果如图5所示,添加葡萄糖、麦芽糖、乳糖、果糖、蔗糖5 种碳源中,葡萄糖在提高发酵液中GABA浓度最显著,GABA浓度为4.46 mmol/L。因此,选择葡萄糖为培养基的碳源。

2.4.2 葡萄糖质量浓度对GABA发酵的影响

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图 6 不同质量浓度葡萄糖对B. megaterium X-1产γ-氨基丁酸浓度的影响

Fig.6 Effect of glucose concentration on the production of GABA

由图6可知,当培养基中葡萄糖质量浓度为30.0 g/L时,发酵液中GABA浓度最高,为4.46 mmol/L。但随着葡萄糖添加量提高,GABA浓度逐渐降低。因此选择葡萄糖的添加量为30.0 g/L。

2.4.3 不同氮源对GABA发酵的影响

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图 7 不同氮源对B. megaterium X-1产γ-氨基丁酸浓度的影响

Fig.7 Effect of nitrogen sources on the production of GABA

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图 8 不同复合氮源对B. megaterium X-1产γ-氨基丁酸浓度的影响

Fig.8 Effect of mixed nitrogen sources on the the production of GABA

不同氮源对B. megaterium X-1产GABA浓度影响,结果如7所示。在单一氮源的实验中,蛋白胨作为唯一氮源时GABA浓度最高,为3.15 mmol/L。这也与Sun Baishen[18]研究相一致。而在培养基中加入3.0 g/L
NaNO3、尿素、磷酸氢二铵、硫酸铵组成复合氮源时,结果如图
8所示,NaNO3与蛋白胨组成复合氮源时,GABA浓度最高,为4.68 mmol/L。其他无机氮源效果不明显,故培养基选用蛋白胨与NaNO3组成复合氮源。

2.4.4 氮源质量浓度对GABA发酵的影响

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图 9 不同质量浓度蛋白胨对B. megaterium X-1产γ-氨基丁酸浓度的影响

Fig.9 Effect of peptone concentration on the production of GABA

9可知,当培养基中蛋白胨质量浓度为30.0 g/L时,发酵液中GABA浓度最高,为6.60 mmol/L。随着蛋白胨添加量增加,GABA浓度逐渐降低。因此选择蛋白胨添加量为30.0 g/L。

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图 10 不同质量浓度NaNO3对B. megaterium X-1产γ-氨基丁酸浓度的影响

Fig.10 Effect of NaNO3 concentration on the production of GABA

以30.0 g/L葡萄糖为碳源,30.0 g/L的蛋白胨为有机氮源,探讨不同质量浓度的NaNO3对B. megaterium X-1发酵产GABA的影响如10所示,NaNO3质量浓度为3.0 g/L效果最好,为7.53 mmol/L。当NaNO3质量浓度在1.0~2.0 g/L时,发酵液中GABA浓度逐渐增加,当NaNO3质量浓度在3.0~5.0 g/L时,GABA浓度逐渐下降。这可能是由于NaNO3作为速效氮源,在发酵过程中适量的NaNO3有利于菌体快速利用氮源,达到较高的生物量。但过多的NaNO3对于细菌的生长及GABA的产生有一定的抑制作用,且NaNO3在作用过程中对GABA浓度的影响不明显,故不将其考虑在正交试验中。

2.4.5 L-谷氨酸钠对GABA发酵的影响

L-谷氨酸钠在发酵过程中既是GABA生成的底物,又可为菌体生长提供氮源[19]。不同质量浓度L-谷氨酸钠的添加对发酵液中GABA浓度影响,如图11所示。当L-谷氨酸钠质量浓度在5.0~10.0 g/L时,发酵液中GABA浓度逐渐增加,当L-谷氨酸钠质量浓度为10.0 g/L时,发酵液中GABA浓度最高,为7.55 mmol/L。当L-谷氨酸钠质量浓度高于10.0 g/L时,GABA浓度有所下降,说明L-谷氨酸钠质量浓度对GABA浓度影响明显。

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图 11 不同质量浓度L-谷氨酸钠对B. megaterium X-1产γ-氨基丁酸浓度的影响

Fig.11 Effect of monosodium glutamate concentration on the production of GABA

2.4.6 无机盐及生长因子对GABA发酵的影响

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图 12 无机盐(a)及生长因子(b)对B. megaterium X-1产γ-氨基丁酸浓度的影响

Fig.12 Effect of inorganic salts (a) and growth factors (b) on the the production of GABA

在基础培养基中分别加入0~1.2 g/L的K2HPO4、MgSO4、CaCl2与0.1~0.5 g/L的生物素和PLP,探讨无机盐对B. megaterium X-1发酵产γ-氨基丁酸的影响,结果如12所示,MgSO4、CaCl2和生物素对GABA浓度的提高效果不明显,而K2HPO4和PLP在一定质量浓度下能明显提高发酵液中GABA浓度,这与孟和毕力格[20]、Komatsuzaki[21]等的研究成果一致,故将K2HPO4和PLP作为正交试验的两个因素进行后续讨论。

2.4.7 正交试验优化

通过单因素试验,筛选葡萄糖、蛋白胨、K2HPO4、L-MSG和PLP 5 个主要影响因素,采用三水平五因素L16(35)正交试验对培养基组分进行优化,结果及分析如表2、3所示。

表 2 培养基组分的正交试验方案及结果

Table 2 Orthogonal array design with experimental results

试验号

A葡萄糖添

加量/(g/L)

B蛋白胨添

加量/(g/L)

C K2HPO4添

加量/(g/L)

D L-MSG添加

量/(g/L)

E PLP添加

量/(g/L)

Y GABA浓

度/(mmol/L)

1

2(30.0)

2(30.0)

2(0.6)

2(15.0)

1(0.1)

21.57

2

2

1(20.0)

3(0.9)

1(10.0)

3(0.3)

19.11

3

1(20.0)

2

3

1

2(0.2)

18.07

4

3(40.0)

3(40.0)

3

3(20.0)

1

15.52

5

1

1

1(0.3)

1

1

15.99

6

1

1

2

3

1

17.27

7

3

1

2

1

3

19.05

8

1

3

1

2

3

17.99

9

1

3

2

1

2

17.52

10

2

3

1

1

1

16.64

11

3

1

1

2

2

17.92

12

2

1

1

3

2

19.81

13

1

1

3

2

1

16.31

14

3

2

1

1

1

18.68

15

1

1

1

1

1

16.02

16

1

2

1

3

3

19.55

k1

17.793

18.253

18.440

18.999

17.673

 

k2

19.736

20.036

19.468

18.589

18.753

 

k3

18.246

17.486

17.868

18.187

19.348

 

R

2.550

1.943

1.600

0.812

1.675

 

 

表 3 正交试验结果方差分析

Table 3 Analysis of variance (ANOVA) of the experimental results from orthogonal array design

变异来源

Ⅲ型平方和

自由度

均方

F

显著性

校正模型

39.649

10

3.965

17.977

0.003**

A

10.176

2

5.088

23.069

0.003**

B

14.035

2

7.018

31.817

0.001**

C

5.327

2

2.664

12.076

0.012*

D

1.812

2

0.906

4.109

0.088

E

8.298

2

4.149

18.811

0.005**

误差

1.103

5

0.221

 

 

 

注:*.P<0.05,表示差异显著;**.P<0.01,表示差异极显著。

 

2、3可以反映出各因素对发酵液中GABA产量的影响主次顺序是BAECD,即培养基中蛋白胨对GABA浓度影响最显著,葡萄糖、PLP和KH2PO4次之,L-MSG添加量没有显著性影响。由表2可知,5 个因素的最佳组合为A2B2C2D1E3。确定B. megaterium X-1最佳发酵培养基成分为A2B2C2D1E3,即葡萄糖30.0 g/L、蛋白胨30.0 g/L、KH2PO4 0.6 g/L、L-MSG 10.0 g/L、PLP 0.3 g/L、NaNO3 3.0 g/L、MgSO4•7H2O 0.5 g/L、FeSO4•7H2O 0.01 g/L。在此条件下重复发酵3 次,GABA浓度可达(21.57±1.23) mmol/L,比优化前(4.46 mmol/L)提高3.83 倍。

3 结论与讨论

本实验从土壤中分离出一株产GABA的芽孢杆菌菌株X-1,经形态特征与16S rDNA鉴定为巨大芽孢杆菌(B. megaterium)。1976年Foerster等[22]研究发现在B. megaterium芽孢休眠过程中不存在GABA,当芽孢开始萌发后,GABA含量开始增加,表明GAD与芽孢的萌发有关,而本研究B. megaterium X-1在发酵12 h后进入稳定期,芽孢开始萌发,发酵液中GABA浓度开始增加,并随着发酵时间的延长,GABA浓度持续增加。这与Foerster等[22]的研究相一致,而与杨胜远等[23]研究的B. megaterium EJC-1培养6 h进入对数生长期,40 h后进入稳定期,50 h后进入衰亡期而有所不同,说明不同来源的菌种其生产周期和培养特性有所不同。

虽然早在1971年就已发现B. megaterium中存在GAD,但有关B. megaterium产GABA发酵工艺的研究也未见报道。本研究通过单因素试验和正交试验对B. megaterium X-1的培养基成分进行优化,确定了B. megaterium X-1最佳发酵培养基成分。在此条件下,发酵液中GABA浓度可达21.57 mmol/L,比优化前提高了3.83 倍,优化效果十分明显。同时,在B. megaterium X-1的培养基优化研究过程中也发现,PLP作为GAD的辅酶,对提高B. megaterium X-1发酵产GABA浓度效果显著,这与Coda等[24]的研究结果类似,究其原因可能PLP作为GAD的辅酶,与酶蛋白结合而增强GAD活性,从而提高发酵液中GABA浓度。但考虑其成本较高,且对光、O2较为敏感,有待进一步探讨PLP成分的替代品。

参考文献:

[1] XU Jing, LI Chong, YIN Xiaohui, et al. Additive neuroprotection of GABA A and GABA B receptor agonists in cerebral ischemic injury via PI-3K/Akt pathway inhibiting the ASK1-JNK cascade[J]. Neuropharmacology, 2008, 54(7): 1029-1040.

[2] LI Haixing, CAO Yusheng. Lactic acid bacterial cell factories for gamma-aminobutyric acid[J]. Amino Acids, 2010, 39(5): 1107-1116.

[3] CONNOR M, VAUGHAN C W, VANDENBERG R J. N-Acyl amino acids and N-acyl neurotransmitter conjugates: neuromodulators and probes for new drug targets[J]. British Journal of Pharmacology, 2010, 160(8): 1857-1871.

[4] GARCIA M D C, ADLER-GRASCHINSKY E, CELUCH S M. Role of CGRP and GABA in the hypotensive effect of intrathecally administered anandamide to anesthetized rats[J]. European Journal of Pharmacology, 2006, 532(1/2): 88-98.

[5] 张新定, 裘明德. γ-氨基丁酸系统与癫痫[J]. 兰州大学学报: 医学版, 2006(1): 93-96.

[6] 江波. GABA(γ-氨基丁酸): 一种新型的功能食品因子[J]. 中国食品学报, 2008, 8(2): 1-4.

[7] SANDMEIER E, HALE T I, CHRISTEN P. Multiple evolutionary origin of pyridoxal-5-phosphate-dependent amino-acid decarboxylases[J]. European Journal of Biochemistry, 1994, 221(3): 997-1002.

[8] 杨胜远, 陆兆新, 吕风霞, 等. γ-氨基丁酸的生理功能和研究开发进展[J]. 食品科学, 2005, 26(9): 528-533.

[9] 王辉, 项丽丽, 张锋华. γ-氨基丁酸(GABA)的功能性及在食品中的应用[J]. 食品工业, 2013, 34(6): 186-189.

[10] 金增辉. 富含GSH、GABA米胚芽功能性饮料制法[J]. 粮食与油脂, 2003(6): 37-40.

[11] PARK K B, OH S H. Cloning, sequencing and expression of a novel glutamate decarboxylase gene from a newly isolated lactic acid bacterium, Lactobacillus brevis OPK-3[J]. Bioresource Technology, 2007, 98(2): 312-319.

[12] 许建军, 江波, 许时婴. 谷氨酸脱羧酶(GAD)的研究进展[J]. 食品工业科技, 2004, 25(7): 132-133.

[13] PLOKHOV A Y, GUSYATINER M M, YAMPOLSKAYA T A, et al. Preparation of gamma-aminobutyric acid using E. coli cells with high activity of glutamate decarboxylase[J]. Applied Biochemistry and Biotechnology, 2000, 88(1/3): 257-265.

[14] STROBEL G A. Endophytes as sources of bioactive products[J]. Microbes and Infection, 2003, 5(6): 535-544.

[15] 夏江, 梅乐和, 黄俊, 等. 产γ-氨基丁酸的乳酸菌株筛选及诱变[J]. 核农学报, 2006, 20(5): 379-382.

[16] 东秀珠, 蔡妙英. 常见细菌系统鉴定手册[M]. 北京: 科学出版社, 2001: 260-264; 370-373.

[17] WU Y T, JANETOPOULOS C. Systematic analysis of gamma-aminobutyric acid (GABA) metabolism and function in the social amoeba Dictyostelium discoideum[J]. Journal of Biological Chemistry, 2013, 288(21): 15280-15290.

[18] SUN Baishen, ZHOU Liping, JIA Xiaoqin, et al. Response surface modeling for gamma-aminobutyric acid production by Monascus pilosus GM100 under solid-state fermentation[J]. African Journal of Biotechnology, 2008, 7(24): 4544-4550.

[19] JUNG D Y, JUNG S, YUN J S, et al. Influences of cultural medium component on the production of poly (gamma-glutamic acid) by Bacillus sp. RKY3[J]. Biotechnology and Bioprocess Engineering, 2005, 10(4): 289-295.

[20] 孟和毕力格, 冀林立, 罗斌, 等. 传统乳制品中产γ-氨基丁酸乳酸菌的培养基优化[J]. 食品工业科技, 2009, 30(7): 124-127.

[21] KOMATSUZAKI N, NAKAMURA T, KIMURA T, et al. Characterization of glutamate decarboxylase from a high gamma-aminobutyric acid (GABA)-producer, Lactobacillus paracasei[J]. Bioscience Biotechnology and Biochemistry, 2008, 72(2): 278-285.

[22] FOERSTER C W, FOERSTER H F. Glutamic acid decarboxylase in spores of Bacillus megaterium and its possible involvement in spore germination[J]. Journal of Bacteriology, 1973, 114(3): 1090-1098.

[23] 杨胜远, 陆兆新, 孙力军, 等. 爬山虎内生菌的鉴定及其谷氨酸脱羧酶酶学特性[J]. 南京农业大学学报, 2007, 30(2): 122-127.

[24] CODA R, RIZZELLO C G, GOBBETTI M. Use of sourdough fermentation and pseudo-cereals and leguminous flours for the making of a functional bread enriched of gamma-aminobutyric acid (GABA)[J]. International Journal of Food Microbiology, 2010, 137(2/3): 236-245.

 

收稿日期:2014-09-03

作者简介:徐林敏(1990—),女,硕士研究生,主要从事食品生物技术研究。E-mail:2012108004@njau.edu.cn

*通信作者:吕凤霞(1963—),女,教授,博士,主要从事酶工程研究。E-mail:lufengxia@njau.edu.cn

 

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