葡萄籽原花青素提取物对衰老模型小鼠
抗氧化作用

高 璐1，王 滢2，饶胜其1，杨振泉1，黄阿根1，胡博然1,*

（1.扬州大学食品科学与工程学院，江苏 扬州 225127；2.常州市武进工商局，江苏 常州 213159）

摘 要：目的：研究葡萄籽原花青素提取物对衰老小鼠心脏、肝、脑和血清抗氧化功能的影响。方法：采用纤维素酶辅助浸提葡萄籽原花青素，经大孔树脂吸附纯化后灌胃由D-半乳糖连续皮下注射诱导的亚急性衰老模型小鼠，以各组小鼠心脏、肝、脑和血清中的总抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）活力和丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量为指标，全面评价葡萄籽原花青素提取物在小鼠体内的抗氧化能力。结果：与空白对照组相比，模型对照组小鼠心脏、肝、脑和血清中T-AOC、SOD、GSH-Px活力均有不同程度的降低，MDA含量有不同程度的升高，其大多变化差异显著，说明小鼠衰老模型构建成功。与模型对照组相比，葡萄籽原花青素提取物各剂量组能增强模型小鼠心脏、肝、脑和血清中T-AOC、SOD、GSH-Px活力，同时降低MDA值，其中大多变化差异显著，而血清中各值变化差异极显著。结论：葡萄籽原花青素提取物能够显著增强亚急性衰老小鼠的抗氧化能力，具有延缓衰老的作用。

关键词：葡萄籽原花青素提取物；D-半乳糖；衰老模型小鼠；抗氧化

Antioxidant Activity of Grape Seed Proanthocyanidin Extract in Aging Mouse Model

GAO Lu1, WANG Ying2, RAO Sheng-qi1, YANG Zhen-quan1, HUANG A-gen1, HU Bo-ran1,*

(1. College of Food Science and Engineering, Yangzhou University, Yangzhou 225127, China;

2. Changzhou Wujin Industrial and Commercial Bureau, Changzhou 213159, China)

Abstract: Objective: To study the antioxidant activity of grape seed proanthocyanidin extract (GSPE) in aging mice induced by D-galactose. Methods: GSPE was extracted with cellulase and purified by macroporous resin adsorption. The aging ICR mouse model induced by subcutaneous injection of D-galactose was orally administered with GSPE. The content of malondialdehyde (MDA), the activities of superoxide dismutase (SOD) and glutathione peroxidase (GSH-Px) and total antioxidant capacity (T-AOC) in cerebrum, heart, liver and serum of the mice were assessed. Results: D-galactose could obviously reduce T-AOC as well as SOD and GSH-Px activities, and enhance MDA contents in mouse cerebrum, heart, liver and serum. In contrast, GSPE could significantly enhance T-AOC, and SOD and GSH-Px activities, and reduce MDA contents in serum, and cerebrum, heart and liver tissues of the aging mice, especially in serum. Conclusion: GSPE could improve the activities of endogenous antioxidant enzymes in aging mice. Therefore, it has good antioxidant and anti-aging effects.

Key words: grape seed proanthocyanidin extract; D-galactose; aged mice; antioxidation

中图分类号：TS201.4 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）23-0253-04

doi:10.7506/spkx1002-6630-201423049

我国葡萄资源较为丰富，年产量约有近600万 t，这些葡萄中约有80%用于酿酒，13%作为鲜果食用，7%用于加工果汁及其他葡萄产品。工业酒的生产伴随着大量的垃圾，全世界每年生产出数以万吨计酿酒葡萄废弃物，其中主要包括葡萄皮、葡萄籽等[1]。随着葡萄酒市场的不断壮大，随之产生的酿酒副产物逐渐变成了一个不可忽视的环境问题。大多数企业一般是将皮籽丢弃、用作饲料、烧材或发酵后作为肥料，利用率很低，造成了极大的资源浪费[2]。

近年来的研究发现，葡萄籽具有很高的营养价值和药用价值，其中所含的原花青素为葡萄籽生物活性的重要成分之一[3-4]。葡萄籽原花青素（grape seed proanthocyanidin extract，GSPE）是由儿茶素、表儿茶素及其没食子酸酯通过C4-C6或C4-C8键共价相连组成的多聚体[5]。由于这类物质的分子中具有多电子的羟基部分，使它拥有较强的抗氧化、清除自由基和抑制脂质过氧化的能力，是目前发现的最强效的氧自由基消除剂和脂质过氧化抑制剂之一[6]。

衰老是生命过程中必然出现的极其复杂的生理现象，目前最具有代表性的衰老学说之一是1956年Harman提出的自由基学说[7-9]。Das等[10]的研究表明，人体内存在清除自由基的防御系统，包括超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）等抗氧化酶系。随着年龄的增长，抗氧化防御物质的合成和活性下降，大量代谢产物丙二醛（malondialdehyde，MDA）产生，机体产生和清除自由基的平衡被破坏，自由基堆积，加速机体衰老。D-半乳糖致衰老模型是我国学者基于衰老代谢学说而复制的衰老模型，近年来不少国内外学者纷纷使用此衰老模型来研究体内抗氧化作用[11]。

目前对葡萄籽原花青素提取物的抗衰老研究主要是通过体外法测定其对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基、超氧阴离子自由基（O2－•）、羟自由基（•OH）的清除活性，抗脂质过氧化能力以及对金属离子螯合能力等体外抗氧化指标来评价[12-14]，而用衰老模型进行系统的体内抗氧化研究的报道并不多。因此，本实验用葡萄籽原花青素提取物灌胃由D-半乳糖连续皮下注射诱导的亚急性衰老模型小鼠，测定其血清、脑、肝、心脏组织中MDA含量，SOD、GSH-Px及总抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）活性，较为系统地研究葡萄籽原花青素提取物对D-半乳糖衰老模型小鼠体内抗氧化的影响，为其进一步开发利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 动物

ICR小白鼠：雌性，7 周龄，购自扬州大学比较医学中心。

1.2 材料与试剂

赤霞珠酿酒葡萄籽由甘肃紫轩酒业有限公司提供。

纤维素酶（酶活力30 000 U/g） 上海蓝季科技发展有限公司；D-半乳糖 美国Sigma公司；MDA生成量测试试剂盒、SOD活性测试盒、GSH-PX活性测试盒、T-AOC活性测试盒 南京建成生物工程研究所；其他试剂均为国产分析纯。

1.3 仪器与设备

SZC-C索氏提取器 上海纤检仪器有限公司；FW100高速万能粉碎机 天津市太斯特仪器有限公司；ALPHA1-2LD冷冻干燥机 北京博行仪器有限公司；755S紫外分光光度计 上海棱光技术有限公司；PICO17离心机 美国Thermo公司。

1.4 方法

1.4.1 葡萄籽原花青素提取

参考文献[15]中酶解助提法进行GSPE提取。首先葡萄籽粉碎后经石油醚脱脂并干燥，准确称取1.0 g干燥脱脂葡萄籽粉置于100 mL三角瓶中，加入20 mL pH 4.0的缓冲液，调节纤维素酶液活力至100 U/mg，45 ℃酶解1.0 h后迅速升温至90 ℃充分灭活，1 500 r/min离心分离并保存上清液，加入70%的乙醇溶液于50 ℃水浴30 min后进行抽滤、70 ℃减压蒸馏浓缩至没有液滴滴出、浓缩物经冷冻干燥得GSPE粗提物。

1.4.2 葡萄籽原花青素纯化

参考文献[15-16]中最优纯化参数对GSPE进行纯化。在100 mL锥形瓶中加入5 g经前处理好的AB-8大孔树脂，再加入50 mL 3 mg/mL GSPE粗提物水溶液，放入25 ℃摇床中振荡吸附24 h（振荡速度为160 r/min），过滤除去未吸附的GSPE粗提物水溶液，蒸馏水冲洗过的树脂倒入50 mL 50%的乙醇中25 ℃、160 r/min解吸24 h，滤出解析液、70 ℃减压蒸馏浓缩至没有液滴滴出，冷冻干燥得到GSPE粗提物。

1.4.3 葡萄籽原花青素含量的测定

采用铁盐催化比色法[17]。配制不同含量的原花青素溶液，显色剂显色后，在500 nm波长处测吸光度A，以原花青素含量为横坐标，吸光度A500 nm为纵坐标，绘制标准曲线。得直线回归方程y＝－0.007 39＋2.411 5x，R2＝0.999 49。样品测定过程中通过测吸光度A500 nm反映原花青素含量。

1.4.4 葡萄籽原花青素提取物对衰老模型小鼠抗氧化作用

1.4.4.1 实验小鼠分组和处理

将60 只ICR小鼠分为6 组：空白对照组、模型对照组、VC阳性对照组、GSPE低剂量组、GSPE中剂量组、GSPE高剂量组，每组10 只。低剂量组50 mg/（kg•d）、中剂量组100 mg/（kg•d）、高剂量组200 mg/（kg•d）（均以体质量计，下同）灌胃GSPE；VC阳性对照组以200 mg/（kg•d）灌胃VC；模型对照组和空白对照组灌胃同体积生理盐水，连续灌胃40 d。各组小鼠同室分笼饲养，自由进食（基础饲料）和水，温度18～20 ℃，相对湿度50%～60%。

1.4.4.2 D-半乳糖衰老小鼠模型构建

各实验组小鼠（空白对照组除外）按300 mg/（kg•d）的剂量皮下注射灭菌D-半乳糖，空白对照组注射等体积灭菌生理盐水，连续注射55 d，构建小鼠衰老模型。模型小鼠构建成功后再对各剂量组小鼠进行灌胃受试物，连续30 d[15-17]。

1.4.4.3 小鼠处理和指标测定

末次灌胃后，各组小鼠禁食不禁水，24 h后将各组小鼠眼眶采血后处死，取心脏、肝、脑及血清，处理后测定T-AOC、GSH-Px、SOD活性及MDA生成量这4 个抗氧化指标，测定方法按试剂盒说明书操作。

1.5 数据处理

用SPSS 10.0统计软件对有关数据进行方差分析。表中参数用

±s表示，差异显著水平为P＜0.05，差异极显著水平为P＜0.01。

2 结果与分析

2.1 葡萄籽原花青素的提取与纯化结果

本实验中提取得GSPE粗提物含量为84.5 mg/g，其提取率达7.1%。葡萄籽原花青素粗提物经纯化后纯度为88.6%。

2.2 GSPE提取物对衰老模型小鼠组织及血清中T-AOC活性的影响

表 1 葡萄籽原花青素对衰老模型小鼠组织和血清中T-AOC
活性的影响（

x

±s）

Table 1 Effect of grape seed procyanidins on T-AOC in aging mice (

x

±s)

注：*. 与模型对照组相比差异显著（P＜0.05）；**. 与模型对照组相比差异极显著（P＜0.01）。下同。

由表1可知，模型对照组小鼠的脑、肝、心脏和血清中的T-AOC值均低于空白对照组，其中肝和血清中的T-AOC值差异显著（P＜0.05），说明从T-AOC值来看衰老小鼠模型构建基本成功。GSPE各剂量组和VC阳性对照组的T-AOC值均大于模型对照组，在小鼠脑、肝组织中几乎各剂量组的T-AOC值均与模型对照组差异显著（P＜0.05），而小鼠血清中的T-AOC值与模型对照组差异极显著（P＜0.01），说明GSPE能提高小鼠脑、肝、心脏组织和血清的总抗氧化能力，在血清中的影响最显著，作用强于VC。

2.3 葡萄籽原花青素对衰老模型小鼠组织及血清中SOD活力的影响

SOD对机体的氧化与抗氧化平衡起着至关重要的作用，此酶能清除O2－•保护细胞免受损伤，SOD活性的大小能间接反映机体清除氧自由基的能力。GSPE对小鼠组织和血清中SOD活性的影响见表2。与空白对照组相比，模型对照组小鼠的脑、肝、心脏和血清中的SOD活性均有所降低，其中脑和心脏中的SOD活性降低显著，血清中的SOD活性降低极显著，说明从SOD活性来看衰老小鼠模型构建基本成功。与模型组相比，GSPE各剂量组和VC阳性对照组的SOD活性均有所增强，其中心脏组织中的SOD活性增强显著（P＜0.05），脑组织和血清中的SOD活性增强极显著（P＜0.01），说明GSPE能显著地提高小鼠脑、心脏和血清中的SOD活性，且中、高剂量组作用强于VC阳性对照组。

表 2 葡萄籽原花青素对小鼠组织和血清SOD活性的影响（

x

±s）

Table 2 Effect of grape seed procyanidins on SOD activity in aging mice (

x

±s)

2.4 葡萄籽原花青素对衰老模型小鼠的组织及血清中GSH-Px活性的影响

表 3 葡萄籽原花青素对小鼠组织和血清GSH-Px活性的影响（

x

±s）

Table 3 Effect of grape seed procyanidins on GSH-Px activity in aging mice (

x

±s)

GSH-Px活性反映小鼠体内组织和血清的还原力的大小，它的高低间接反映小鼠对自由基的消除能力的大小。由表3可知，模型对照组小鼠的脑、肝、心脏和血清中的GSH-Px活性均低于空白对照组，其中血清中GSH-Px活性差异极显著（P＜0.01），说明从GSH-Px活性来看衰老小鼠模型构建基本成功。GSPE各剂量组和VC阳性对照组的GSH-Px活性均大于模型对照组且差异显著（P＜0.05），肝和血清中GSPE各剂量组的GSH-Px活性与模型对照组相比，差异极显著（P＜0.01），说明GSPE显著提高小鼠脑、肝、心脏和血清的GSH-Px活性，显示了GSPE很好的抗氧化活性。

2.5 葡萄籽原花青素对衰老模型小鼠的组织及血清中MDA含量的影响

表 4 葡萄籽原花青素对小鼠组织和血清MDA含量的影响（

x

±s）

Table 4 Effect of grape seed procyanidins on MDA content in aging mice (

x

±s)

MDA含量的大小反映机体受自由基攻击的严重程度，当机体受到自由基的攻击以后，会引发脂质的过氧化作用，进而引发MDA的产生。GSPE对小鼠组织和血清中MDA含量的影响见表4。模型对照组小鼠的肝、心脏和血清中MDA含量明显高于空白对照组且差异显著
（P＜0.05），说明模型基本成功。GSPE各剂量组小鼠血清中MDA含量显著低于模型组，且中、高剂量组差异极显著（P＜0.01），GSPE各剂量组小鼠的肝和心脏组织中MDA含量也均低于模型对照组，且中、高剂量组差异显著（P＜0.05），说明GSPE能显著降低血清和心脏、肝中MDA的含量；而对小鼠脑中的MDA含量没有显著影响。

3 结 论

本实验中，ICR小鼠经皮下注射D-半乳糖55 d后，小鼠肝和血清中的T-AOC活性、小鼠脑、心脏和血清中SOD活性、小鼠脑和血清中GSH-Px活性均有显著降低；小鼠肝、心脏和血清中的MDA含量显著升高，这和Ho等[18]报道的结果基本一致，说明小鼠衰老模型构建成功。

Garcia-Ramirez[19]和Shoji[20]等的研究表明原花青素能很快被大鼠吸收，直接参与体内的生理功能。本研究首先采用纤维素酶辅助提取葡萄籽原花青素，纯化后再连续灌胃经D-半乳糖致衰老小鼠40 d，结果显示各剂量组的T-AOC、SOD、GSH-Px活性均有不同程度增加，MDA含量有不同程度的降低，其中小鼠血清中各指标变化差异极显著，这和解素花等[21]的研究结果基本一致。刘霞等[22]对冷榨葡萄籽饼粕和彭亮等[23]对葡萄籽粉的研究结果与本研究的结果也基本一致，表明原花青素具有较好的抗氧化防衰老的作用，也是葡萄籽饼粕和葡萄籽粉中可能的主要抗氧化成分。

葡萄籽原花青素分子中具有多电子的羟基部分，可在分子内和分子间形成缔合氢键，是一个大的供氢体。此外，其结构单元黄烷醇结构，其酚羟基对Fe3+具有较强的配位作用，8 个酚羟基（儿茶素）均与双键共轭，从而使原花青素能够有效清除羟基自由基，2 个脂肪族羟基又使其具有良好的水解性，保护脂质不被氧化，缓解细胞DNA的氧化损伤，阻断自由基链式反应，促使细胞抗氧化酶的诱导合成和丙二醛的下降。这些分子结构特点也许就是其具有良好的清除自由基和抗氧化活性的原因所在[24]。

研究结果表明，一定量的GSPE能显著增强体内抗氧化酶的活性和显著降低体内过氧化脂质含量，从而增强机体清除自由基的能力，即GSPE具有较强的体内抗氧化性和延缓衰老的作用，若将其应用到食品、保健品等领域，可以对葡萄酒工业最大的副产品——葡萄籽进行再利用，以实现经济和生态效益的最大化。

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