海参和海星皂苷对乳清酸诱导大鼠脂肪肝
影响的比较研究

韩秀清，付雪媛，徐 杰，董 平，王静凤，薛长湖，王玉明*

（中国海洋大学食品科学与工程学院，山东 青岛 266003）

摘 要：目的：研究并比较海参皂苷和海星皂苷对乳清酸诱导的长期大鼠非酒精性脂肪肝（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）的干预作用。方法：将雄性Wistar大鼠喂食1%乳清酸建立NAFLD模型，连续喂养6 周后，将大鼠分为乳清酸模型组（orotic acid group，OA）、海参皂苷组（sea cucumber saponins group，Scs）和海星皂苷组（starfish saponins group，Sfs），以未喂食OA的大鼠为正常对照组（control group，Con）继续喂养8周后，分别测定大鼠肝脏甘油三酯（triglyceride，TG）、总胆固醇（total cholesterol，TC）、磷脂（phospholipid，PL）水平和血清TG、TC水平以及肝脏脂质合成、分解相关酶的酶活性和基因表达量。结果：海参皂苷和海星皂苷组肝脂及血脂水平均有明显下降，此外，二者均能抑制脂肪酸合成酶活性，下调脂肪酸合成基因表达水平，增强脂肪酸β-氧化相关酶活性。结论：海参皂苷和海星皂苷均能明显改善乳清酸长期诱导大鼠NAFLD，并具有类似的调控机制，其中海参皂苷和海星皂苷的改善效果相当。

关键词：非酒精性脂肪肝；海参皂苷；海星皂苷；乳清酸

Effects of Sea Cucumber Saponins versus Starfish Saponins on Orotic Acid-Induced Fatty Liver in Rats

HAN Xiu-qing, FU Xue-yuan, XU Jie, DONG Ping, WANG Jing-feng, XUE Chang-hu, WANG Yu-ming*

(College of Food Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266003, China)

Abstract: Objective: In this research, the effects of sea cucumber saponins and starfish saponins on nonalcoholic fatty liver induced by orotic acid (OA) in rats were comparatively investigated. Methods: Modified AIN-93G diet containing 1% orotic acid (OA diet) was used to establish NAFLD rat model. After 6-week feeding of OA diet, 24 male Wistar rats were randomly divided into three groups (eight rats in each group) and then fed with the corresponding diets for 8 weeks: OA group; OA diet; Scs group: OA diet containing 0.04% sea cucumber saponins; Sfs group: OA diet containing 0.04% starfish saponins. The rats fed the modified AIN-93M diet were used as a control group (Con). After 14 weeks of feeding, body weights, liver weights, visceral adipose weights, serum triglyceride (TG), serum total cholesterol (TC), liver functional indexes, hepatic TG, hepatic TC and hepatic phospholipids (PL) were measured. The enzyme activities and gene expressions involved in hepatic lipid metabolism were also determined. Results: Compared with the OA group, sea cucumber saponins and starfish saponins significantly reduced hepatic TG and TC levels (P < 0.05). These two saponins alleviated the fatty liver through inhibiting the enzymes activities and gene expressions involved in hepatic lipogenesis and enhancing the activities of peroxisomal β-oxidation enzymes in liver. Conclusion: In summary, sea cucumber saponins and starfish saponins could efficiently alleviate NAFLD induced by orotic acid in rats with similar regulatory mechanisms. Meanwhile, sea cucumber saponins revealed similar lipid-lowering effects as sea starfish saponins.

Key words: nonalcoholic fatty liver disease; sea cucumber saponins; starfish saponins; orotic acid

中图分类号：TS218 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）23-0268-06

doi:10.7506/spkx1002-6630-201423052

近年来，非酒精性脂肪肝（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）发病率明显升高，并呈现低龄化趋势[1-3]。
目前，寻找能够改善NAFLD的天然活性物质和食品功效成分是海洋食品研究的重要内容之一。前期研究发现，海洋棘皮动物海参由来的皂苷类化合物可有效抑制大鼠非酒精性脂肪肝的形成过程[4]。我国部分沿海具有食用海星习惯，海星同属于海洋棘皮动物，是海洋动物皂苷的另一主要来源[5]。海参皂苷和海星皂苷虽同属于海洋棘皮动物皂苷，但前者主要为三萜类皂苷，后者主要为甾体类皂苷，结构上的差异提示二者可能具有不同的生理活性[6-9]。本实验采用乳清酸建立大鼠长期NAFLD模型，比较研究了海参皂苷和海星皂苷对长期NAFLD的治疗和干预作用，并对其机制进行初步探讨，为海星皂苷和海参皂苷的开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物

清洁级雄性Wistar大鼠，体质量（180±10）g，许可证号：SCXK（京）2007-0001，购自北京维通利华实验动物公司。

1.2 材料与试剂

甘油三酯（triglyceride，TG）测定试剂盒、总胆固醇（total cholesterol，TC）测定试剂盒、葡萄糖测定试剂盒 北京中生北控生物科技股份有限公司；谷丙转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）测定试剂盒、谷草转氨酶（aspartate transaminase，AST）测定试剂盒、谷氨酰转移酶（gamma-glutamyl transferase，GGT）测定试
剂盒 南京建成生物工程研究所；Trizol抽提试剂 美国Invitrogen公司；MMLV逆转录酶 美国Promega公司；HP型大孔树脂 安徽三星树脂科技有限公司；AB-8型大孔树脂 南开大学化工厂；其他试剂为国产分析纯。

1.3 仪器与设备

Aglient1100型高效液相色谱仪 美国Aglient 公司；iQ5型Realtime PCR仪、Model680型酶标仪 美国Bio Rad公司；UV-2550型分光光度计 日本岛津公司。

1.4 方法

1.4.1 海参皂苷和海星皂苷的制备

参照董平[10]的方法制备海参皂苷。革皮氏海参经干燥粉碎制成粉末，加60%乙醇热回流抽提6次，合并各次抽提所得上清液，减压回收乙醇，得水溶液，过HP-20型大孔树脂，依次用水和80%乙醇洗脱，收集80%乙醇洗脱液减压浓缩，经真空冷冻干燥后得海参皂苷。

参照张铮[11]的方法制备海星皂苷。新鲜海星8 kg，加95%乙醇12 L浸提过夜得上清液，再加入60%乙醇溶液反复浸提2 次，合并各次抽提所得上清液，减压回收乙醇，得水溶液，过AB-8型大孔树脂，依次用水和80%乙醇洗脱，收集80%乙醇洗脱液减压浓缩，经真空冷冻干燥后得海星皂苷。

1.4.2 动物分组与喂养

动物先适应性喂养1 周，之后将Wistar大鼠按体质量分为2 组：正常对照组（Con，n＝8）和乳清酸组
（n＝24），分别喂食标准饲料和1%乳清酸饲料6 周后，将乳清酸组随机分为模型组（OA组，n＝8）、海参皂苷组（Scs，n＝8）及海星皂苷组（Sfs，n＝8），分别喂食1%乳清酸饲料、分别含0.04%海参皂苷和0.04%海星皂苷的1%乳清酸饲料，饲养8 周。基于AIN93M基础饲料配方配制各组饲料，饲料配方见表1。大鼠自由摄食饲料和饮水，在室温（23±2）℃，明暗交替各12 h条件下喂养。饲料每日更新并测定摄食量，并记录每周体质量变化。喂食14 周后于前夜禁食不禁水5 h后，乙醚麻醉下腹主动脉取全血处死，取肝脏、肾周脂肪、附睾脂肪等脏器组织称质量后，液氮速冻后于－80 ℃保存，备用。

表 1 各组饲料配方

Table 1 Compositions of experimental diet

g/kg

1.4.3 肝脏脂质含量、血清指标测定

参照Folch等[12]的方法，准确称取0.25 g肝脏，制成肝脏脂质抽提液，参照试剂盒说明书分别测定肝脏TC、TG含量。血液室温静置30 min后，7 500 r/min离心获得血清，参照试剂盒说明书测定血清TG、TC、葡萄糖、AST、ALT、GGT水平等血清理化指标。

1.4.4 肝脏脂肪代谢相关酶活性测定

用含有0.25 mol/L蔗糖、1 mmol/L EDTA和10 mmol/L
Tris的缓冲液（pH 7.4）于4 ℃制备肝匀浆，以750×g离心10 min，去除沉淀。上清液先以12 000×g离心20 min，收集沉淀，按文献[13-14]方法用于肉碱棕榈酰转移酶-1（carnitin palmitoyl transferase-1，CPT-1）、过氧化物酶体β-氧化酶系活性测定。二次离心所得上清液再以125 000×g离心60 min，收集上清液用于测定脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，FAS）、苹果酸酶（malic enzyme，ME）、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PDH）活性，方法参照文献[15-16]。

1.4.5 基因mRNA表达检测

采用Trizol提取肝脏总RNA，逆转录按照试剂盒说明书进行，实时荧光PCR反应条件为：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s，共40 个循环。各基因的mRNA表达量均以18sRNA量比值表示，并将对照组定为100%。实验中所用到的引物序列如表2所示。

表 2 实验中所需引物序列

Table 2 Primers used in this study

1.5 数据分析

采用SPSS 18.0统计学软件进行数据分析，结果用

±s表示，对照组和乳清酸模型组采用独立样本t检验进行比较分析，模型组、海参皂苷组和海星皂苷组间采用Duncan’s multiple range test进行多重比较分析，以P＜0.05为具有统计学意义上的显著差异。

2 结果与分析

2.1 大鼠体质量、摄食量及脏器质量变化

图 1长期摄食海参皂苷和海星皂苷对NAFLD大鼠体质量影响（n＝8）

Fig.1 Effects of sea saponins and starfish saponins on body weight in rats (n = 8)

表 3 长期摄食海参皂苷和海星皂苷对大鼠生长指标和各组织器官
影响（n＝8）

Table 3 Chronic effects of sea saponins and starfish saponins on growth parameters and organs in rats (n = 8)

注： *.模型组与对照组相比，P＜0.001。下同。

由图1可知，各组大鼠体质量均无明显差异，实验测定了肾周脂肪和附睾脂肪等内脏脂肪组织含量，各组比较均无明显差异，但由于乳清酸诱导脂肪肝模型中，机体脂肪代谢紊乱，大量脂肪沉积在肝脏，即异位脂肪沉积作用[17]，模型组的内脏脂肪含量为各组中最低。与对照组相比，模型组大鼠肝脏质量显著增加了63.0%
（P＜0.001），海参皂苷和海星皂苷对大鼠肝脏质量无明显影响（表3）。

2.2 大鼠肝脏脂质含量变化

小写字母不同表示模型组、海参皂苷组和海星皂苷组之间比较有显著性差异（P＜0.05）。下同。

图 2 长期摄食海参皂苷和海星皂苷对NAFLD大鼠肝脂质水平影响（n＝8）

Fig.2 Chronic effects of sea saponins and starfish saponins on hepatic lipids in rats (n = 8)

如图2所示，喂食乳清酸14 周后，模型组大鼠肝脏TG、TC水平分别是对照组的12.4、2.82倍（P＜0.05），海参皂苷和海星皂苷干预后，与模型组相比，大鼠肝脏TG含量分别下降了38.3%和41.2%，肝脏TC含量分别下降了32.4%和18.4%。

2.3 血清中脂质和肝功能酶学指标变化

#.模型组与对照组相比差异极显著（P＜0.05）。下同。

图 3 长期摄食海参皂苷和海星皂苷对NAFLD大鼠血清指标影响（n＝8）

Fig.3 Chronic effects of sea saponins and starfish saponins on serum indexes in rats (n = 8)

如图3所示，与正常组相比，模型组血清TG水平下降了20.6%。与模型组相比，海参皂苷组和海星皂苷组血清TG水平分别降低了61.8%（P＜0.05）和51.4%
（P＜0.05），血清TC水平无显著性差异。血清中AST、ALT、GGT活性测定结果显示，模型组大鼠血清AST、ALT、GGT活性分别是对照组的5.2、2.9和1.2 倍
（P＜0.05）。海参皂苷和海星皂苷不同程度地下调了血清GGT活性，此外，海星皂苷明显下调了血清ALT活性（P＜0.05），而海参皂苷对血清ALT和AST活性无明显调控作用。

2.4 肝脏脂肪酸合成酶活性变化

图 4 长期摄食海参皂苷和海星皂苷对肝脏脂肪酸合成相关酶活性的
影响（n＝8）

Fig.4 Chronic effects of sea saponins and starfish saponins on the hepatic enzyme activities involved in fatty acid biosynthesis in rats (n = 8)

如图4所示，长期喂食乳清酸后，大鼠肝脏ME酶活性显著上升，而G6PDH酶活性却有所下降。海参皂苷和海星皂苷干预后，大鼠肝脏ME酶活性分别下降了17.5%和40.5%（P＜0.05）；但是，海参皂苷对G6PDH酶活性无显著影响，海星皂苷却显著上调了G6PDH酶活性。FAS是内源性长链脂肪酸合成过程中的最后一步的限速酶，长期喂食乳清酸后大鼠肝脏FAS酶活性显著下降
（P＜0.05），两皂苷干预后虽无显著性变化，但表现出下降趋势。

2.5 肝脏脂肪酸β-氧化酶活性变化

图 5 长期摄食海参皂苷和海星皂苷对肝脏脂肪酸β-氧化相关酶活性的影响（n＝8）

Fig.5 Chronic effects of sea saponins and starfish saponins on the hepatic enzyme activities involved in fatty acid β-oxidation in rats (n = 8)

如图5所示，脂肪肝模型组大鼠肝脏CPT-1酶活性和过氧化物酶体β-氧化酶系活力均显著下降，说明模型组肝脏的脂肪β-氧化能力受到明显抑制。海参皂苷和海星皂苷干预后，大鼠肝脏CPT-1和过氧化物酶体β-氧化酶系能力均显著上升，表明海参皂苷和海星皂苷能显著促进肝脏脂肪酸的分解利用。

2.6 肝脏脂肪酸合成相关基因mRNA表达量的变化

固醇调节元件结合蛋白1（sterol regulatory element binding proteins1，SREBP1）可调控脂肪合成代谢酶，如FAS的基因表达[18-19]。如图6所示，海参皂苷组和海星皂苷组大鼠肝脏SREBP1-c、FAS和ME的mRNA表达水平均有显著下调（P＜0.05），其中海参皂苷组的FAS和ME基因表达下调尤为明显，分别下调了66.4%和38.5%，而海星皂苷组的SREBP1-c和G6PDH基因下调尤为明显，分别下调了33.6%和36.7%（P＜0.05），表明海参皂苷和海星皂苷可能通过下调相关基因的表达抑制肝脏的脂肪合成，且综合看来，二者的调节水平相当。

图 6 长期摄食海参皂苷和海星皂苷对大鼠肝脏脂质合成相关基因表达的影响（n＝8）

Fig.6 Chronic effects of sea saponins and starfish saponins on the mRNA expression levels related to fatty acid biosynthesis in rats (n = 8)

2.7 肝脏脂肪酸分解相关基因mRNA表达量的变化

图 7 长期摄食海参皂苷和海星皂苷对大鼠肝脏脂肪酸β-氧化相关基因表达的影响（n＝8）

Fig.7 Chronic effects of sea saponins and starfish saponins on the mRNA expression levels related to fatty acid β-oxidation in rats (n = 8)

过氧化物酶体增殖物激活受体-α（peroxisome proliferators activated receptor-α，PPAR-α）参与脂肪酸
β-氧化相关基因的转录调控，本实验检测了肝脏PPAR-α及其靶基因的mRNA表达量变化。结果表明，乳清酸饮食引起肝脏PPAR-α基因及其靶基因CPT-1和ACO不同程度上的表达下调，但各皂苷组和乳清酸模型组相比，3 种基因的表达水平都无明显变化。

3 讨 论

已有报道表明海参皂苷对NAFLD的形成和发展阶段具有预防作用。Hu Xiaoqian等[20]通过大鼠短期喂养模型，研究发现海参皂苷对乳清酸诱导的NAFLD有较好的预防作用，但其主要探讨海参皂苷对NAFLD形成期间机体脂肪代谢的影响。本实验通过长期喂食乳清酸建立大鼠NAFLD模型后再给予海参皂苷和海星皂苷的干预，探究其对乳清酸诱导NAFLD的影响。实验结果发现：海参皂苷明显降低了肝脏以及血清TG的含量，对乳清酸诱导大鼠NAFLD有较好的干预和改善效果。

已有研究表明，乳清酸诱导脂肪肝模型中肝脏TG的蓄积以及血清TG含量的降低与其分泌脂蛋白能力降低有关[21]。为了明确海参皂苷降低肝脏脂质水平的机制，本实验测定了肝脏脂肪酸代谢相关酶活性和基因水平。脏脂质代谢过程中，ME 和G6PDH为脂肪酸合成提供NADPH。FAS可催化乙酰-CoA和丙二酰-CoA合成脂肪酸，是肝脏脂肪酸合成的关键限速酶[22-23]。动物体内进行脂肪酸β-氧化代谢的场所主要包括线粒体、过氧化物酶体，其中CPT是线粒体脂肪酸β-氧化的限速酶。实验结果表明，海参皂苷在不同程度上抑制了脂肪合成相关酶FAS和ME的酶活性，并明显提升了肝脏脂肪酸氧化相关酶CPT的酶活性和过氧化物酶体β-氧化能力，这与
Hu Xiaoqian等[20]的研究结果一致。但是，与已有研究不同的是，本实验长期喂食海参皂苷后大鼠肝脏G6PDH的酶活性并未降低，这可能与乳清酸喂养的时间较长有关。此外，海参皂苷下调了肝脏脂肪合成相关基因SREBP1-c、FAS、ME的mRNA表达水平，但对脂肪酸β-氧化相关基因的表达水平并无明显影响。也有研究表明，海参皂苷可以通过抑制消化道内胰脂肪酶的活性，抑制和减缓的脂质吸收，从而起到降低肝脏脂质的作用[24]。因此，海参皂苷对肝脏脂质过度蓄积的改善作用较为复杂，是多因素共同作用的结果。

海星中含有的海星皂苷与海参皂苷结构显著不同，研究结果证实，海星皂苷具有抗肿瘤、抗真菌、抗病毒、抗炎症、抗溃疡、麻醉和降血压等多种药理活性[25]。到目前为止，国内外有关海星皂苷对脂质代谢影响的报道较少，更未见海星皂苷对NAFLD影响的相关研究。本实验探究了海星皂苷对乳清酸长期诱导NAFLD的改善作用，并将其与同属于海洋皂苷的海参皂苷进行比较。结果发现，海星皂苷同样通过抑制肝脏脂肪合成氧化相关基因表达和酶活性改善乳清酸长期诱导的NAFLD。

综上所述，海参皂苷和海星皂苷均能在乳清酸诱导NAFLD形成以后，通过调节脂肪酸合成和β-氧化分解相关酶活性以及相关基因表达量改善机体的脂肪代谢异常现象，且海参皂苷和海星皂苷的改善效果相当。

参考文献：

[1] OSUMI T, HASHIMOTO T. Acyl-CoA oxidation of rat liver: a new enzyme for fatty acid oxidation[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications, 1978, 83(2): 479-485.

[2] VOCKLEY J, WHITEMAN A H. Defects of mitochondrial β-oxidation: a growing group of disorders[J]. Neuromuscular Disorders, 2002, 12(3): 235-240.

[3] KONDRUP J, LAZAROW P B. Flux of palmitate through the peroxisomal and mitochondrial β-oxidation systems in isolated rat hepatocytes[J]. Biochimica et Biophysica Acta, 1985, 835(1): 147-153.

[4] 胡晓倩. 海参皂苷对脂质代谢的影响及其机制研究[D]. 青岛: 中国海洋大学, 2010.

[5] 刘铁铮, 郭爱杰, 王桂春, 等. 海星化学成分的生物活性及其应用研究进展[J]. 广东农业科学, 2011, 38(13): 122-125.

[6] 黄日明, 王宾, 刘永宏. 海参的化学成分及其生物活性的研究概况[J]. 中成药, 2009, 31(8): 1263-1269.

[7] 周鹏, 顾谦群, 王长云. 海星皂甙及其他活性成分研究概况[J]. 海洋科学, 2000, 24(2): 35-37.

[8] 邹峥嵘, 易杨华, 张淑瑜, 等. 海参皂苷研究进展[J]. 中国海洋药物, 2004, 23(1): 46-53.

[9] 汤海峰, 易杨华, 张淑瑜, 等. 海星皂苷的研究进展[J]. 中国海洋药物, 2004, 23(6): 48-57.

[10] 董平. 革皮氏海参(Pearsonothria graeffei)皂苷化合物的分离鉴定、结构修饰及活性研究[D]. 青岛: 中国海洋大学, 2008.

[11] 张铮. 罗氏海盘车(Asterias Rollestori)水溶性海星皂苷的分离纯化及其部分生物学活性研究[D]. 青岛: 中国海洋大学, 2008.

[12] FOLCH J, LEES M, STARLEY G H. A Simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues[J]. Journal of Biological Chemistry, 1957, 226(1): 497-509.

[13] MARKWELL M A K, MCGROARTY E J, BIEBER L L, et al. The subcellular distribution of carnitine acyltransferases inmammalian liver and kidney[J]. Journal of Biological Chemistry, 1973, 248(10): 3426-3432.

[14] LAZAROW P B. Assay of peroxisomal β-peroxisomal of fatty acids[M]. New York: Academic Press, 1981: 315-319.

[15] GLOCK G E, MCLEAN P. Glucose 6-phosphate dehydrogenase activity of rat liver[J]. Nature, 1952, 170: 119-120.

[16] OCHOA S, MEHLER A H, KORNBERG A. Biosynthesis of dicarboxylic acids by carbon dioxide fixation. I. Isolation and properties of an enzyme from pigeon liver catalyzing the reversible oxidative decarboxylation of L-malic acid[J]. Journal of Biological Chemistry, 1948, 174(3): 979 -1000.

[17] 邱靖雅, 傅晓英, 赵红莉. 异位脂肪与胰岛素抵抗[J]. 新医学, 2013, 44(2): 79-81.

[18] GOLDSTEIN J L, RWSON R B, BROWN M S. Mutant mammalian cells as tools to delineate the sterol regulatory element-binding protein pathway for feedback regulation of lipid synthesis[J]. Archives Biochemistry and Biophysics, 2002, 397(2): 139-148.

[19] HORTON J D, GOLDSTEIN J L, BROWN M S. SREBPs: activators of the complete program of cholesterol and fatty acid synthesis in the liver[J]. Journal of Clinical Investigation, 2002, 109(9): 1125-1131.

[20] HU Xiaoqian, WANG Yuming, Wang Jingfeng, et al. Dietary saponins of sea cucumber alleviate orotic acid-induced fatty liver in rats via PPARα and SREBP-1c signaling[J]. Lipids in Health and Disease, 2010, 9: 25. doi: 10.1186/1476-511X-9-25.

[21] ZHANG Bei, XUE Changhu, HU Xiaoqian, et al. Dietary sea cucumber cerebroside alleviates orotic acid-induced excess hepatic adipopexis in rats[J]. Lipids in Health and Disease, 2012, 11: 48. doi: 10.1186/1476-511X-11-48.

[22] 王玉明, 任兵兴, 胡晓倩, 等. 摄食鱿鱼对乳清酸诱导大鼠脂肪肝的影响[J]. 食品科学, 2011, 32(3): 212-215.

[23] 郑恩霞, 程文娟, 王宗达, 等. 苹果酸酶的分子生物学研究进展[J]. 安徽农学通报, 2009, 15(10): 51-52.

[24] WANG Yuming, WANG Jiahui, YANAGITA R C, et al. Effects of two sulfated triterpene saponins echinoside A and holothurin A on the inhibition of dietary fat absorption and obesity reduction[J]. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 2014, 78(1): 139-146.

[25] 赵君, 赵晶, 樊廷俊, 等. 水溶性海星皂苷的分离纯化及其抗肿瘤活性研究[J]. 山东大学学报, 2013, 48(1): 30-42.