食品中维吉尼霉素残留检测方法研究进展

兰 洋，董 全*

（西南大学食品科学学院，重庆 400715）

摘 要：维吉尼霉素是一种环状多肽类抗生素，常用于猪、鸡等畜禽疾病的预防和治疗，并能有效提高饲料利用率和动物生长速率。但食品中抗生素的残留会引起细菌、动物与人之间产生交叉耐药性，欧盟从1999年开始禁止将包括维吉尼霉素在内的抗生素作为饲料添加剂，抗生素在动物性食品中的残留普遍受到各国的高度重视。本文主要综述样品前处理技术和维吉尼霉素检测方法，对比分析各检测方法的优缺点，同时也对检测方法的发展进行展望，以期为我国对维吉尼霉素残留的检测和监管研究提供参考。

关键词：抗生素；维吉尼霉素；耐药性；检测方法

Progress in Methods for Determination of Virginiamycin Residues in Foods

LAN Yang, DONG Quan*

(College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China)

Abstract: Virginiamycin, a cyclic peptide antibiotic, is commonly used in the disease prevention and treatment of swine, chicken and other poultry or livestocks. It can effectively increase the efficiency of feed utilization and the growth rate of animals, but antibiotic residues in foods will cause cross-resistance between bacteria, animals and humans. Certain antibiotics such as virginiamycin have been banned as growth promoters in the European Union since 1999. Special attention has been paid to the application of antibiotics in animals all over the world. In this article, sample pretreatment techniques and detection methods for virginiamycin residues in foods are summarized, the advantages and disadvantages of these techniques are compared and the future development directions are proposed. This paper will provide a reference for the detection and supervision of virginiamycin residues in foods.

Key words: antibiotic; virginiamycin; resistance; detection methods

中图分类号：TS201.6 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）23-0342-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201423066

维吉尼霉素（virginiamycin，VGM）又叫维吉霉素、维吉尼亚霉素、肥大霉素、威里霉素、抗金葡霉素，是维吉尼链霉菌产生的一种环状多肽类抗生素。它由M组分[1]（M1～M2）和S组分[2]（S1～S5）组成（图1），
其中M1和S1为主要成分，市售VGM通常是70%大环内酯M1和30%环状多肽S1的混合物。VGM为浅黄色粉末，在甲醇、氯仿、乙醇等有机溶剂中可溶解，在水、乙醚中极微溶解，在石油醚中不溶解[3]，在pH值大于9.5时其生物活性易丧失。VGM溶液对紫外光有较强的吸收性，但紫外光照射会引起其降解[4]。VGM主要作用于革兰氏阳性细菌的核糖体，从而抑制其蛋白质合成[3]，因此VGM常用于猪[5-6]、鸡[7-8]等畜禽疾病的预防和治疗，并能有效提高饲料的利用率和动物的生长速率[9]。由于VGM存在引起细菌、动物与人之间产生交叉耐药性的风险，欧盟从1999年开始禁止将包括VGM在内的抗生素作为饲料添加剂[10]。日本规定牛奶和鸡蛋中VGM的最高残留限量均为
100 µg/kg[11]。我国农业部第168号公告[12]中允许将VGM作为饲料添加剂并规定：猪饲料中的添加量为20～50 g/t；鸡饲料中的添加量为10～40 g/t，休药期均为1 d。农业部第235号公告[13]中又规定：VGM在猪组织中的最高残留限量为肌肉100 µg/kg、肝脏300 µg/kg、肾脏400 µg/kg，这与美国联邦法规（Code of Federal Regulations，CFR）的规定一致[14]；在家禽组织中的最高残留限量为：肌肉100 µg/kg、肝脏300 µg/kg、肾脏500 µg/kg。

VGM M1（分子式：C28H35N3O7）

VGM S1（分子式：C43H49N7O10）

图 1 维吉尼霉素结构式

Fig.1 Structures of virginiamycins

VGM在动物组织中主要以原形药物状态存在，目前各国法规没有明确规定VGM的残留标识物，而商业VGM产品以M1组分为主，所以目前主要检测的是猪、鸡等畜禽组织[15-16]和牛奶[17]中的VGM M1残留。为保障人民的身体健康以及扩大食品的贸易往来，很有必要建立快速、经济、灵敏度更高、特异性更强的检测方法。目前VGM的检测方法主要有微生物效价法、薄层色谱法、酶联免疫分析法、高效液相色谱法和液相色谱-质谱联用法。本文对近年来国内外VGM检测方法进行综述，以期能为我国在这方面的进一步研究提供参考。

1 样品前处理

为了提高检测方法的灵敏度及准确度，并延长仪器的寿命，需要对样品进行必要的前处理，使得待测物质得以提取、净化和浓缩，从而降低或消除基质对检测结果的影响。

1.1 样品的提取

样品的提取方法通常有液液萃取（liquid-liquid extraction，LLE）、超声波辅助提取（ultrasonic-assisted extraction，UAE）、超临界流体萃取（supercritical fluid extraction，SFE）、固相萃取（solid-phase extraction，SPE）等。VGM的检测研究中多用LLE法和UAE法（见表1）。根据VGM不溶于非极性溶剂的特点，通常使用甲醇、乙腈、乙酸乙酯等极性有机溶剂萃取。大部分研究者都采用了两种有机溶剂进行VGM提取，但也有研究者仅采用一种有机溶剂提取。陈小霞等[11]在用液相色谱-串联质谱测定牛奶中VGM M1时仅采用乙腈进行提取，其不同水平加标回收率为72%～90%。魏云计等[18]用同样的方法测定鸡肝中的VGM M1时，对比了乙腈、乙酸乙酯、乙酸乙酯-0.2 mol/L NH4H2PO4 3 种提取溶剂的提取效果，发现采用混合溶剂提取的效果最好，方法回收率为81.5%～90.3%。林维宣等[19]对比了甲醇-0.1%甲酸溶液和甲醇-NH4H2PO4溶液的提取效果，发现磷酸盐会对VGM等多肽类抗生素的质谱检测产生干扰，而前一种提取液得到的回收率是92%～100%，提高了方法的准确度。UAE法是近年来发展较快的样品提取技术，具有萃取效率高、简便快速、重现性好等优点[20]。冯三令[21]采用该方法测定饲料中VGM的含量。得出配合饲料在3 个浓度的平均加标回收率为84.77%～95.75%，批内和批间RSD均小于5%。

1.2 样品净化

牛奶、动物组织中的脂类会随着VGM的提取同时被提取出来，故样品净化的主要目的是除去干扰较大的脂肪、蛋白质及其他杂质。通常采用的方法是：直接向离心或过滤得到的样品残渣中加入样品提取液，再用正己烷脱脂，最后过0.22 µm滤膜[11,22]。但是过滤困难，不利于实现自动化操作，而采用净化柱则可以提高净化速度、易于实现自动化。曹文卿等[23]在测定动物组织中VGM时，仅用甲醇和甲酸铵混合溶液进行液液萃取后过0.22 µm滤膜，方法的检测限为0.5 µg/kg，平均回收率为86%～118%。魏云计等[18]则研究了HLB、C18、PSA 3 种填充柱的净化效果，发现填充料为N-丙基乙二胺
的PSA柱的回收率高于C18柱和HLB柱。Gibson等[24]用甲醇水溶液提取鸡肉中的VGM，用Oasis HLB柱净化，甲醇洗脱后过0.22 µm滤膜，得到的检测限为0.36 µg/kg，平均回收率为90%～101%，日内和日间变异系数分别为5.2%～12.1%和7.9%～30.3%。VGM检测样品的具体净化方式见表1。

表 1 维吉尼霉素检测的样品前处理技术

Table 1 Sample pretreatment techniques for the detection of virginiamycin

2 VGM的检测方法

目前，国内外对VGM的检测方法有很多，但主要集中在微生物法、薄层色谱法、酶联免疫分析法、高效液相色谱法和液相色谱-质谱联用法。

2.1 微生物法

微生物法（又称为杯碟法）是我国在VGM检测中最早使用的一种方法，它是根据抗生素对微生物代谢和生理机能的抑制作用来对样品中的药物残留进行定性或定量分析[30]。这种方法相比液质联用及酶联免疫分析法，成本比较低、操作简便，但是方法的可重复性差、灵敏度比较低，由于要进行微生物培养和生物自显影的确证实验，所以检测用时更长，且只能检测具有生物活性的VGM残留。我国的行业标准SN/T 1134-2002《进出口肉及肉制品中维吉尼霉素残留量检验方法》[31]中规定了用杯碟法检测肉及肉制品中VGM残留量方法，标准规定：用乙醇提取试样中残留的VGM，均质并离心，取上清液与结膜干燥棒杆菌作用，根据产生抑菌圈直径大小，查阅标准曲线，从而计算样品中VGM的残留量。该方法的检测限是0.05 mg/kg，0.05～0.2 mg/kg添加范围内的平均回收率为80%～81.3%，方法准确度比较高。

2.2 薄层色谱法

应用在VGM残留检测中的薄层色谱法（thin-layer chromatography，TLC）是在1999年欧盟禁止使用VGM等抗生素后才建立起来的，该方法相比微生物法有更高的特异性，利用该方法对大量的检样进行初筛，再结合液相色谱等方法进行确证，可以从总体上降低检测成本。Vincent等[32]建立了TLC结合生物自显影技术定性检测饲料中VGM的方法。该方法可以达到的最低定性检出量是1 mg/kg，比欧盟规定的5 mg/kg更低，符合定性检测的要求。但是由于该方法独立定量检测VGM时灵敏度不高，不能满足越来越低的残留限量要求，所以国内外对该方法的研究相对较少。

2.3 高效液相色谱法

由于VGM沸点高，不适合用气相色谱法检测，而液相色谱不需要高温条件，所以适合VGM的检测。目前，检测VGM的主流方法是高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）和液相色谱-质谱联用法。样品经过提取、脱脂、脱蛋白质、层析净化等步骤进行分离后用HPLC进行检测，该方法检测灵敏度高、稳定性好。由于反相色谱法（reversed phase HPLC，RP-HPLC）采用甲醇、乙腈等水溶性有机溶剂做流动相，不干扰检测，采用的固定相（C8或C18）性质稳定，极性杂质先流出，分析速度快，目前被广泛采用。耿志明等[33]建立了猪组织中VGM M1残留的
RP-HPLC测定方法。用甲醇-NH4H2PO4溶液提取样品，正己烷脱脂，C18固相萃取柱净化，以乙腈-水为流动相，ODS-3 C18柱分离，用DAD检测器在245 nm波长处进行检测。结果表明：VGM M1在100～2000 µg/L范围内线性关系良好，最低检测限为10 µg/kg。肌肉、肝脏和肾脏组织的加标回收率均在72%～85%，批内和批间变异系数均在10%以内。

由于VGM在高于230 nm波长的光谱区无紫外吸收，因此限制了紫外检测器的使用，而二极管阵列检测器（diode array detector，DAD）可同时接收整个光谱区的信息，因此，DAD检测器是目前国内外采用HPLC法测定VGM的主流检测器。Hajee等[27]在检测家禽组织中VGM含量时对比研究了紫外检测器在230 nm波长处检测结果和质谱仪的检测结果，发现质谱仪的检测选择性和灵敏度比紫外检测器高许多。

2.4 液相色谱-质谱联用法

液相色谱-质谱联用技术包括液相色谱-质谱法（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）、液相色谱-串联质谱法（liquid chromatography tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）和超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS）。无论是国家标准测定方法还是近几年国内外的研究，都采用了LC-MS/MS法。中华人民共和国国家标准GB/T 20765—2006《猪肝脏、肾脏、肌肉组织中维吉尼霉素M1残留量的测定 液相色谱-串联质谱法》[34]中规定了猪肝脏、肾脏、肌肉组织中VGM M1残留的LC-MS/MS检测方法。标准规定残留VGM的样品经甲醇-乙腈溶液匀浆提取、离心，取上清液用NH4H2PO4缓冲溶液稀释，C18固相萃取柱净化，将洗脱液中的VGM M1用三氯甲烷分离萃取，去除水层。氮气吹三氯甲烷至干，用甲酸氨缓冲溶液与甲醇混合液溶解并定容，用液相色谱-串联四极杆质谱仪测定，方法的检测限为
0.25 µg/kg。中华人民共和国国家标准GB/T 22991—2008《牛奶和奶粉中维吉尼霉素残留量的测定液相色谱-串联质谱法》 [35]规定了牛奶和奶粉中VGM M1残留的
LC-MS/MS检测方法。原理上相比第一个国标少了匀浆的步骤，多了将奶粉超声溶解得到复原乳的步骤。该方法的检测限为：原料乳0.25 µg/kg，纯奶粉2.0 µg/kg。Liu Jiajia等[28]采用LC-MS/MS法检测牛奶中VGM M1，在样品预处理时采用甲醇和0.1%甲酸提取，比国标多加入三氯乙酸乙腈除蛋白质，这一方法改进使得检测限降低至0.2 µg/kg。赵静等[36]也采用LC-MS/MS法检测牛奶中VGM M1，得出牛奶中VGM M1的检测限为0.25 µg/kg，奶粉中VGM M1检测限为2.0 µg/kg的结论，这一实验结果和国标方法一致。

通常，不同的样品基质对检测结果的影响比较大。陈小霞等[2]用乙腈提取鸡肉、鸡肝等样品中的VGM，并且仅用乙腈作为流动相从而改进国标，将检测时间缩短为10 min，在多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）模式下进行质谱扫描，得出定量限分别为：鸡肉25 µg/kg、鸡肝100 µg/kg、猪肾150 µg/kg，回收率分别为：鸡肉86.8%～108%、鸡肝81.8%～109%、猪肾82.7%～102%。实验室内相对标准偏差均小于10%。Sin等[37]将猪肌肉及内脏采用乙腈提取VGM，在MRM模式下进行质谱扫描，得出该方法检测限：肌肉1.9 µg/kg、肝脏3.4 µg/kg、肾脏4.3 µg/kg；线性范围为0～3 000 µg/kg，准确度分别为94%、102%和112%，变异系数分别为6.7%、5.1%、9.2%。de Alwis等[26]检测了酒糟中包括VGM M1在内的13 种抗生素含量。样品经过EDTA和三氯乙酸溶液提取，再经甲醇溶液提取，然后通过一个双轨道亲水性聚合物或弱阳离子交换固相萃取小柱净化，再进行液相色谱/离子阱串联质谱分析。该方法的检测限是0.1 µg/g，回收率是78%～104%，准确度是90%，变异系数是11%。

UPLC-MS/MS具有更快的分析速度、更高的分辨率和灵敏度。Huang Yonghui[22]建立了饲料中VGM M1的UPLC-MS/MS分析测定方法。方法的检测限和定量限分别为2、7 µg/kg，在0.3～226.6 µg/L范围内线性关系良好，平均回收率为82.6%～102.7%，相对标准偏差为0.9%～10.5%。Tang等[25]采用UPLC-MS/MS检测猪肉、鸡肉及鱼肉，方法的检测限和定量限分别为1、5 µg/kg，平均回收率为52.9%～77.7%。

LC-MS/MS技术既具备高效分离的优点，又具备定性鉴定化合物结构的能力，可同时达到定性、定量分析的目的，而且选择性好、灵敏度高、检测限低、抗干扰能力强，对于兽药残留测定的确证性分析可靠度高，从而可以避免出现HPLC和ELISA法检测中的假阳性结果。然而，由于液相色谱-质谱联用仪器昂贵，又需要专业技术人员进行操作，限制了该技术的普及。

2.5 酶联免疫分析法

酶联免疫分析法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）是一种以抗原与抗体的结合反应为基础的检测方法，它结合了酶促反应的高效性和免疫反应的特异性特点，因此ELISA反应具有高度的专一性，非常低的检测限和非常高的灵敏度，同时检测速度快，从而适合于对VGM等兽药进行现场快速定性或定量检测。ELISA法的难点在于制备出量大、特异性强和成本较低的抗体，同时较高的试剂盒价格也限制了ELISA在兽药残留检测中的应用。Situ等[1]建立了动物饲料中VGM M1检测的ELISA法，采用70%甲醇溶液提取，用Oasis HLB柱净化，最低检测限和定量限分别是0.09、0.2 mg/kg，在1、1.5、2.0 mg/kg 3 个水平上的加标回收率是127%～145%，变异系数小于18%，符合欧盟饲料中VGM残留检测要求。McNamee等[29]建立了家禽组织中VGM M1检测的ELISA法。通过甲醇提取，固相净化，然后用ELISA测定。检测结果是：未烹饪小鸡的检测限是0.04 µg/kg，烹饪后的检测限是0.01 µg/kg，烹饪前的回收率是102%，烹饪后的回收率是36%。相比前者饲料中VGM的ELISA检测，检出能力则提高了1 000倍。

综上所述，维吉尼霉素的检测方法种类较多，各种检测方法的优缺点对比见表2。

表 2 维吉尼霉素检测方法

Table 2 Analytical methods for the detection of virginiamycin

注：－. 该文献中未报道。

3 结 语

虽然VGM在抑制革兰氏阳性菌生长方面有好的效果，长期被用作动物饲料添加剂，但是其引起的细菌的交叉耐药性对人类健康的影响却不可忽视，自从欧盟1999年禁止使用VGM作为饲料添加剂以来，各国都相继禁止使用并且设定最高残留限量。我国允许在限量范围内添加使用，但一些厂家在饲料中违规增加VGM的使用量，使得我国的动物肉制品中VGM超标的现象频发，这对食品的进出口贸易是一个巨大的挑战。为此，我国应该加大各类食品中VGM残留的检测方法研究。

就目前的前处理方法而言，过程比较复杂、不能大批量样品处理、自动化程度低；就检测方法而言，目前的研究焦点和大多数标准中指定的检测方法都是LC-MS/MS，该方法精密度和灵敏度都很高，但是不能满足现场快速检测的需求。针对上述问题，今后食品中VGM的检测方法可以从以下方面探索：1）进一步研究ELISA法，研究不同食品的预处理方法，制备出大量的VGM特异性抗体，开发出试剂盒。2）在仪器分析方面，提高样品预处理和样品检测两个步骤的自动化程度，进一步实现两个环节的在线衔接。3）探索VGM检测的新技术。如生物芯片技术是一项集生物学、化学、计算机等学科为一体的高度交叉的新技术，具有前处理简单、准确性高、效率非常高等优点。此外，生物传感技术也是具有研究潜力的新技术。4）二级检测方法的探索。即先用ELISA法进行现场的初筛，对于初筛中的阳性样品进行高度选择性的确证。该方法结合了酶联免疫检测的快速、便携、检测量大等特点和LC-MS/MS定性定量的高灵敏度、低检测限以及高度准确性等特点，可以降低ELISA试剂盒的开发难度，降低LC-MS/MS检测的盲目性，从而从总体上降低检测成本，极大地提高了实际应用性。

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