HS-SPME-GC-MS技术对冷藏鲢鱼片
挥发性成分变化的分析

张慧芳1，李婷婷2，晋高伟1，陈 思1，励建荣1,*，陈 颖3，李敏镇4

（1.渤海大学食品科学研究院，辽宁省食品安全重点实验室，辽宁 锦州 121013；

2.大连民族学院生命科学学院，辽宁 大连 116600；3.中国检验检疫科学研究院，北京 100123；

4.鞍山嘉鲜农业发展有限公司，辽宁 鞍山 114100）

摘 要：以白鲢鱼片为研究对象，测定其菌落总数和挥发性盐基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）值在4 ℃冷藏过程中的变化，并采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术，研究白鲢鱼片在4 ℃冷藏的过程中挥发性成分的变化。结果表明，菌落总数和TVB-N值随着贮藏时间的延长呈现不同趋势的增长，贮藏12 d时超过一级鲜度限值。顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用法共检测出82 种挥发性成分，主要为醛类、酮类、醇类和烃类（烷烃、烯烃、芳香烃）物质。冷藏期间鲢鱼片挥发性成分中的醛酮类物质含量逐渐增加，烃类物质含量不断减少，醇类物质含量则呈先降低后增加的趋势，第6天时含量最低。杂环类物质在第9天被检出且有增高的趋势。第9、12天的冷藏鲢鱼鱼片挥发性成分变化较大，是其新鲜度变化的拐点。

关键词：固相微萃取；气相色谱-质谱联用；鲢鱼片；挥发性成分

Volatile Component Change in Sliver Carp Slices during Cold Storage Analyzed by Headspace Solid-Phase Microextraction Gas Chromatography-Mass Spectrometry

ZHANG Hui-fang1, LI Ting-ting2, JIN Gao-wei1, CHEN Si1, LI Jian-rong1,*, CHEN Ying3, LI Min-zhen4

(1. Food Safety Key Laboratory of Liaoning Province, Food Science Research Institute, Bohai University, Jinzhou 121013, China;

2. College of Life Science, Dalian Nationalities University, Dalian 116600, China;

3. Chinese Academy of Inspection and Quarantine, Beijing 100123, China;

4. Anshan Jiaxian Agricultural Development Co. Ltd., Anshan 114100, China)

Abstract: Changes in the total viable count (TVC) and total volatile base nitrogen (TVB-N) of sliver carp slices during storage at 4 ℃ were measured, and changes in the volatile compound profile were also investigated by headspace solid-phase microextraction coupled to gas chromatography-mass spectrometry (HS-SPME-GC-MS). Both TVC and TVB-N increased significantly with the extension of storage time, reaching a level exceeding the threshold representing the first grade of freshness after 12 days. Totally 82 volatile components were detected in sliver carp slices, mainly including aldehydes, ketones, alcohols and hydrocarbons. The contents of volatile aldehydes and ketones in sliver carp slices increased during cold storage, while hydrocarbons decreased gradually. Alcohols decreased to their minimum values on the 6th day and then increased, while heterocyclic compounds were detectable on the 9th day and later revealed a gradual increase. Obvious changes in the volatile components were observed on the 9th and 12th day, representing the inflection points for the freshness of sliver carp slices during cold storage.

Key words: solid phase micro-extraction; gas chromatography-mass spectrometry; sliver carp slices; volatile components

中图分类号：TS254.9 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）24-0130-06

doi:10.7506/spkx1002-6630-201424025

我国的淡水鱼产量呈逐年上升的趋势，到目前为止，淡水鱼总产量已达到2 000多万吨，占渔业总产量的50%左右。淡水鱼制品由于营养丰富、风味独特而成为人们喜爱的食品。然而，其中挥发性成分产生的气味是影响淡水鱼风味的主要因素之一。鲢鱼属鲤形目鲤科鲢亚科鲢属，因其生长快、疾病少、产量高，多与草鱼、鲤鱼混养，为中国主要的淡水养殖鱼类之一。新鲜的鲢鱼特征风味贡献最大的是一些烯醛类及烯醇类等不饱和挥发性物质[1]。在贮藏过程中，鲢鱼因含有丰富的不饱和脂肪酸，极易氧化导致酸败的发生。同时其具有含水量高，营养物质丰富等特点导致其因微生物的作用在储存后期有不愉快气味产生，发生腐败，品质急剧下降。因此在贮藏过程中气味的变化也是评价鱼类新鲜度的重要特征之一。

顶空固相微萃取（headspace solid phase micro-extraction，HS-SPME）技术是20世纪90年代新发展起来的一种用于食品风味物质分析检测的技术，是一种在气相色谱分析之前快速、灵敏、经济、无溶剂的样品前处理方法[2]。它集采样、萃取、浓缩、进样于一体，萃取食品中的挥发性物质[3]，具有灵敏度高、成本低、操作简单快捷、重现性好等优点[4]。采用该技术与气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）联用仪分析鉴定鲢鱼片冷藏过程中的挥发性成分，研究鲢鱼片在冷藏期间的挥发性成分的变化，为确定其品质质量与新鲜度评价提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料及预处理

冰鲜的鲢鱼 市购。

冰水浸没致死（冰水比例1∶2），将鲢鱼去皮，切成5 cm×5 cm×0.3 cm左右的鲢鱼鱼片，装入已经灭菌的保鲜袋中（约100 g/袋），放在4 ℃条件下贮藏，以备后续实验。

1.2 仪器与设备

AF-10制冰机 斯科茨曼制冰机系统（上海）有限公司；PL602-L电子天平 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；LRH系列生化培养箱 上海一恒科技有限公司；7890N/5975气质联用仪 美国Agilent公司；50/30 μm DVB/CAR/PDS SPME萃取头、样品瓶为20 mL顶空钳口样品瓶 美国Supelco公司；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器 郑州长城科工贸有限公司。

1.3 方法

1.3.1 细菌总数的测定

按GB 4789.2—2010《菌落总数测定》进行测定，采用平板倾注法计数测定。

1.3.2 挥发性盐基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）值测定

使用全自动定氮仪，参考“FOSS应用子报[5]”中《鲜鱼和冻鱼中挥发性盐基氮（TVB-N）的测定》测定鱼丸中的TVB-N值（mg/100 g）。

1.3.3 顶空挥发性成分的萃取

参照徐永霞等[6]的方法并稍加改进。准确称取3 g绞碎的鱼肉、6 mL饱和NaCl溶液混合后加入20 mL样品瓶中，放入微型磁力搅拌子并密封后将SPME针插入样品瓶中，在50 ℃恒温磁力搅拌器中平衡15 min，再吸附40 min后取出萃取头（萃取头老化温度270 ℃，老化时间1 h），并迅速插入GC进样口中，解吸5 min后，拔出。

1.3.4 GC-MS条件

采用HP-5MS毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；进样口温度250 ℃；升温程序：初温40 ℃，保持3 min，以3 ℃/min升到100 ℃，再以5 ℃/min升到230 ℃，保持5 min；载气（He）流量0.8 mL/min；不分流模式进样。

质谱条件：传输线温度280 ℃；离子源温度 230 ℃；四极杆温度150 ℃；扫描范围m/z
30～550；电子能量70 eV。

1.3.5 挥发性成分的鉴定及相对含量确定

样品中的挥发性组分经GC分离，用MS进行分析鉴定。实验数据经计算机检索与NIST和Willey MS库进行检索与鉴定。冷藏鲢鱼鱼片挥发性组分的化学组成通过各挥发性化合物的峰面积归一化进行定量分析。

1.4 数据分析

用Excel 2003软件和Origin 8.0软件进行数据处理和作图，以分析4 ℃冷藏的鲢鱼鱼片挥发性成分变化。

2 结果与分析

2.1 4℃冷藏的鲢鱼鱼片菌落总数和TVB-N值变化

图 1 4 ℃贮藏的白鲢鱼片菌落总数和TVB-N值变化趋势

Fig.1 Changes in TVC and TVB-N values in sliver carp fillets during storage at 4 ℃

微生物的繁殖和代谢是引起鱼类腐败的主要原因，腐败菌生长情况可以反映鱼类的腐败程度[7]。按GB 2741—1994《海虾卫生标准》规定，细菌总数不大于105 CFU/g为一级鲜度，不大于5×105 CFU/g为二级鲜度，达到106～107 CFU/g时，通常表明已极其腐败，不能食用，此时判定为货架期终点。由图1可知，菌落总数初始值较范文教等[8]初始值偏高，为3.79 lg（CFU/g），可能与白鲢鱼的养殖环境、运输方式有关。在贮藏至第12天时菌落总数值达到5.69 lg（CFU/g），在贮藏至15 d时达到6.67 lg（CFU/g）。与卢涵等[9]的研究结果相似，白鲢鱼片在12 d的贮藏过程中，可以保持较好的品质。

TVB-N是动物性食品由于自身酶或腐败微生物所分解的胞外酶的作用，蛋白质被分解而产生氨以及胺类等碱性含氮物质，此类物质具有挥发性，已经被世界上绝大多数国家认定为水产品腐败程度的指标[10]。冷藏鲢鱼片的TVB-N值如图1所示，贮藏前9 d属于一级新鲜度范畴，随贮藏时间的延长，TVB-N值呈现增加趋势，12 d时TVB-N值为15.33 mg/100 g，超过淡水产品一级新鲜度TVB-N限值（≤13 mg/100 g[11]）。15 d时达到23.65 mg/100 g，超过国标《鲜、冻动物性水产品卫生标准》规定的淡水鱼TVB-N限量值（≤20 mg/100 g），不可食用；18 d时为27.33 mg/100g，处于冷藏鱼类的感官接受限值（30～35 mg/100 g）[12]。这与菌落总数结果一致。

2.2 4 ℃冷藏的鲢鱼鱼片挥发性成分变化

新鲜鱼肉的风味成分多是由挥发性羰基化合物和醇类物质造成的，特别是挥发性羰基化合物能够产生原生的、浓郁的香味，而挥发性醇则产生品质较为柔和的气味[13-14]，采用HS-SPME-GC-MS联用技术检测到的挥发性成分如表1所示。由表1可以看出，冷藏鲢鱼片经GC-MS分析后共检出82 种物质。其中醛类、醇类、酮类物质含量较高，种类也较多。被检出醛类、醇类、酮类物质的个数分别为11、16、10 种。醛类物质在第0、3、6、9、12、15、18天的相对含量为21.81%、21.04%、15.01%、31.82%、17.02%、23.89%和24.81%。醇类物质含量也较高，在第0、3、6、9、12、15、18天分别占挥发性物质总量的1.34%、20.43%、1.59%、18.45%、5.30%、19.96%和14.12%。酮类物质在第0、3、6、9、12、15、18天分别占总量的0.21%、4.95%、73.19%、43.69%、68.50%、26.65%和50.96%。第0天芳香族类物质占总量的65.13%，而第3、6、9、12、15、18天时芳香族类物质仅占总量的0.44%、1.00%、0.63%、1.04%、0.39%和0.43%。杂环类物质于第9天产生，相对含量较少。贮藏前期以芳香族类和醛类为主，贮藏后期主要成分为醛、酮类。

醛类物质阈值相对较低，对食品的风味贡献较大。低级醛具有刺激性气味，C8以上高级醛呈水果香味，而C13以上的长链醛类物质阈值较高，对食品的气味贡献较低[15]。在醛类物质中，己醛、庚醛、癸醛、丁醛在醛类总量中所占比重较大。尤其是己醛所占比重最大，且己醛阈值极低，为4.5 μg/kg，已被确认为是鱼体腥味的主要物质[16]。此外，苯甲醛、（E,E）-2,4-庚二烯醛、（E,E）-2,4-壬二烯醛在贮藏初期也有出现，且上述物质也都被证实具有鱼腥味。而辛醛具有的脂肪和水果香气，壬醛具有的脂肪和柑橘样的风味，苯甲醛的苦杏仁香气等这些物质可能是导致新鲜鲢鱼散发柔和、浅淡和令人愉快气味的主要原因。辛醛、壬醛是油酸氧化的产物，2,4-癸二烯醛是聚不饱和脂肪酸氧化的产物。苯乙醛在贮藏第9天后被检出，且在贮藏后期呈增加趋势。因此通过某些醛类的变化可以反映冷藏鲢鱼片中脂肪的氧化程度进而为判断其新鲜度提供依据。

酮类可能是由于不饱和脂肪酸的热氧化或降解而产生的，鱼肌肉组织中含有大量的不饱和脂肪酸和饱和脂肪酸，这些脂肪酸在氧气或酶的作用下生成各种小分子化合物。最初生成短链的饱和及不饱和醛，包括己醛和己烯醛，产生清香或类黄瓜香的气味[17]。脂肪酸进一步分解产生各种小分子化合物如酮、酸、醇等，形成一种强烈的油哈喇味。酮类物质阈值比醛类高，一些酮类在低阈值时，与醛类或其他物质相互作用，使腥味增强或改变。酮类物质在鲢鱼片冷藏后期检出量较多，且在冷藏期间不断增加，在第18天达到最大峰面积，其中2-丁酮和2-甲基-3-戊酮所占比重较大，2,3-辛二酮的含量在冷藏鲢鱼片贮藏期间逐渐增加，这3 种酮类可能对鲢鱼片气味产生影响。

在醇类中，饱和醇类阈值较高，对鱼体气味贡献率不大，而不饱和醇类阈值低，具有蘑菇香气和类金属味，对气味的贡献率较大。而一些饱和醇如本实验中检测到己醇、庚醇、辛醇、壬醇、癸醇等则多见于一些经蒸煮以后的甲壳类动物及鱼肉的挥发性物质中，这可能是在加热过程中脂肪经氧化分解生成的或是有羰基化合物还原而生成醇的缘故，因为它们的阈值比较高，除非它们以高浓度存在，否则对鱼肉风味贡献很小[14]。从表1可以看出，16 种醇类、11 种为饱和醇所占的浓度还是比较高，因此对鱼肉的特征风味有一定的贡献。另外，1-辛烯-3-醇来自亚油酸的氢过氧化物降解产物，具有蘑菇和土腥味[18]，在鲢鱼片的贮藏期间含量逐渐增加。Iglesias等[19]采用HS-SPME-GC-MS证明1-戊烯-3-醇和1-辛烯-3-醇含量与鱼肉脂肪氧化有关的过氧化值、硫代巴比妥酸值等化学指标高度相关，因此1-辛烯-3-醇含量变化也可以反映鲢鱼片的酸败程度。

鱼类死后，鱼体组织中的蛋白质、氨基酸以及其他一些含氮物被分解为氨、三甲胺、组胺等胺类物质，使鱼体产生具有腐败特征的臭味。如在微生物酶的作用下发生脱羧、脱氨反应。通过脱羧反应，Lys生成尸氨，鸟氨酸生成腐胺，His生成组胺。胺类尤其是低级脂肪胺（如三甲胺）有不愉快的气味，引起鱼发出腥臭味。鱼体产生丁二胺（腐胺）和戊二胺（尸胺），具有极臭气味，使鱼体达到感官不可接受状态。从表1也可以看出，在鲢鱼片冷藏期间没有检测到三甲胺。但到第18天时检测到1-甲基乙基-1-丁胺和1,3-二甲基戊胺。

烃类物质阈值较高，对鱼体风味贡献较小，主要由烷烃、烯烃和芳香烃组成。烃类物质主要来自脂肪酸烷基自由基的均裂，而芳香烃如苯、甲苯类化合物能造成不愉快气味，一般由脂类氧化或苯丙氨酸分解代谢产生，因此烃类物质的含量可以反映鱼体脂肪的氧化程度。

腐败臭气是由于鱼表皮黏液和体内含有的各种蛋白质、脂质等在微生物的繁殖作用下，生成了硫化氢、氨、甲硫醇、腐胺、尸胺、吲哚、四氢吡咯、六氢吡啶等化合物而形成的。由表1可得，贮藏到第9天开始，一些如3-羟基哌啶、3,5-二甲基哌啶、1-（苯基磺酰基）吡咯、2,3,5,6-四甲基吡嗪杂环类化合物被检出。因此杂环类物质的含量可能可以反映鲢鱼片腐败程度。

图 2 冷藏鲢鱼片醛类、酮类、酯类、醇类、胺类、芳香族类、
烯烃类、烷烃类、杂环类化合物的变化

Fig.2 Changes in aldehydes, ketones, esters, alcohols, amines, aromatic species, alkenes, alkanes and heterocyclic compounds in sliver carp slices during cold storage

新鲜的鱼体通常散发柔和、浅淡和令人愉快的气味，这些香气由各种羰基化合物和醇产生的清香、类植物香和蜜瓜香及由溴苯酚作用产生的海鱼中的类碘酊香[20]。随着贮藏时间的延长，脂肪氧化和微生物代谢等因素，鲢鱼片逐渐产生一些不愉快气味。从图2可以看出，在鲢鱼片的冷藏过程中，醛、酮、醇类物质含量相对较高。醛类和酮类物质含量总体呈现增加的趋势；醇类物质含量先降低，第6天时含量达到最低，第9天后增高。烃类物质在第12天前变化不大，直到第12天后有增加趋势。这也表明第12天鲢鱼片新鲜度变化较大。而杂环类和胺类物质含量相对较少，但从表1可知，杂环类物质在贮藏第9天时才开始检出，随着贮藏时间延长，呈现增长趋势。胺类物质含量变化不规律，但在第18天时含量相对较高。由此可以推断，第9、12天可能是冷藏鲢鱼片新鲜度变化的拐点。

图 3 冷藏鲢鱼片贮藏期间挥发性物质种类变化

Fig.3 Changes in the chemical classes of volatile components in
sliver carp slices during cold storage

从图3可以看出，鲢鱼片冷藏期间挥发性物质种类先减少后增加。可能由于贮藏前期，新鲜鱼的气味由体内酶促氧化产生的C6、C8、C9的羰基化合物和醇类较多，而贮藏后期，鱼肉中蛋白质、脂质等在微生物的作用下生成一些具有腐臭味的物质。第12、15、18天挥发性物质相对较多，分别为26、29种和37种挥发性物质种类较多的是烃类物质（烯烃、烷烃和芳香族类），在第0、3、6、9、12、15、18天分别为11、3、5、4、11、8、14种。醛酮类检出数量有所增加。杂环类物质种类在第9天后被检出。第18天挥发性物质种类检出较多，可能是因为在贮藏后期，鲢鱼片中的微生物新陈代谢产物较多所致。从图3还可以看出，在冷藏鲢鱼片挥发性物质中，胺类物质种类相对贮藏前期第18天时较多，这可能是由于微生物分解鲢鱼片内蛋白质导致胺类含氮物质增加所致。

3 结 论

鲢鱼鱼片冷藏过程中，菌落总数和TVB-N值随着时间的延长呈现增长趋势，贮藏12 d时超过淡水产品新鲜度限值。HS-SPME-GC-MS方法共检测出82 种冷藏鲢鱼片的挥发性成分，主要为醛类、酮类、醇类和烃类物质。随贮藏时间的延长，冷藏鲢鱼片的挥发性醛、酮类物质含量逐渐增加，醇类物质含量则先呈现降低的趋势，在第6天达到最低，冷藏9 d后开始增加。烃类物质含量在12 d后有所增加，杂环类物质产生于第9天。第9、12天的冷藏鲢鱼鱼片挥发性成分变化较大。因此可以推测，挥发性物质含量可以作为鱼类新鲜度的一个评价指标。

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