近红外光谱技术快速无损评价罗非鱼片新鲜度

陈伟华，许长华，樊玉霞，胡 伟，吴 浩，吴 娜，王锡昌，刘 源*

（上海海洋大学食品学院，上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心，上海 201306）

摘 要：利用傅里叶变换近红外光谱仪采集绞碎前后罗非鱼片背肉及腹肉的近红外光谱，并将其与总挥发性盐基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）含量进行拟合，构建定量预测模型。在建模过程中，比较三点平滑、九点平滑（smoothing average 9 points，sa9）、九点卷积平滑（smoothing savitzky-golay 9 points，sg9）、一阶导数（1st derivative，Db1）、趋近归一化、单位长度归一化、标准正态变换、多元散射校正以及它们与Db1结合对光谱进行预处理的模型效果。结果表明，sg9和Db1相比于其他预处理方法可以较好地消除光谱噪音，提高模型预测能力，且各方法在与Db1联合使用后，模型的预测准确性以及建模效率普遍得到了提升。继续对光谱的波数范围进行筛选，剔除无关信息后，模型效果得到进一步提升，绞碎前背肉模型的校正集和验证集决定系数由0.870、0.821上升到了0.973、0.925，校正集和验证集标准偏差由2.152、2.991 mg/100 g减小到了1.032、1.581 mg/100 g。比较各模型效果可知，利用绞碎后的鱼肉光谱进行建模时效果要好于绞碎前的鱼肉。其中，以绞碎后腹肉模型的效果为最优，其验证集决定系数以及标准偏差分别为0.984、0.879 mg/100 g。但在综合考虑实际应用中快速、无损等需求后，绞碎前的鱼肉所建模型仍具有明显优势。最终，本研究选用绞碎前腹肉建立模型，校正集与验证集决定系数分别为0.982、0.976，校正集与验证集标准偏差分别为0.962、1.006 mg/100 g，在预测罗非鱼片TVB-N含量，快速、无损评价其新鲜度方面显示出了巨大潜力。

关键词：近红外光谱技术；罗非鱼片；新鲜度；挥发性盐基氮；光谱预处理

Non-Destructive Freshness Evaluation of Tilapia (Oreochromis) Fillets Using Near Infrared Spectroscopy

CHEN Wei-hua, XU Chang-hua, FAN Yu-xia, HU Wei, WU Hao, WU Na, WANG Xi-chang, LIU Yuan*

(Shanghai Engineering Research Center of Aquatic-Product Processing and Preservation, College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)

Abstract: Fourier transform near infrared spectrometer was used in this experiment to collect the spectra of tilapia dorsal and belly muscle before and after being minced. By fitting the total volatile basic nitrogen (TVB-N) content to the spectra, quantitative prediction models were established. For modeling, Smoothing Average 3 Points (sa3), Smoothing Average 9 Points (sa9), Smoothing Savitzky-Golay 9 Points (sg9), 1st Derivative (Db1), Normalization by Closure (Ncl), Normalization to Unit Length (Nle), Standard Normal Variate (SNV), and Multiplicative Scatter Correction (MSC) were applied to pretreat the spectra. According to the results, sg9 and Db1 compared with other pretreatment methods could remove the noise, improve the prediction ability of models and the models showed better prediction accuracy and modeling efficiency by using other methods combined with Db1. The best wavenumber region was chosen to get rid of the irrelevant information and the models were further optimized. The determination coefficient of calibration set and validation set for dorsal muscle before being minced was increased from 0.870 and 0.821 to 0.973 and 0.925, respectively. While the standard errors were reduced to 1.032 and 1.581 mg/100 g from 2.152 and 2.991 mg/100 g, respectively. By comparison of model performance, the process of mincing was beneficial to modeling. And the model of minced belly muscle showed the best performance,which showed a determination coefficient of 0.984 with a standard error of 0.879 mg/100 g for validation set. But when the actual requirements for rapid and non-destructive freshness evaluation are under consideration, the model established for flesh before being minced still has obvious advantages. At last, the belly muscle before being minced was used to establish the model. The calibration set gave a determination coefficient of 0.982 with a standard error of 0.962 mg/100 g and the validation set presented a determination coefficient of 0.976 with a standard error of 1.006 mg/100 g. This method showed enormous potential for TVB-N content prediction and non-destructive freshness evaluation of tilapia fillets.

Key words: near infrared spectroscopy; tilapia fillets; freshness; total volatile basic nitrogen; spectral pretreatment

中图分类号：TS254.7 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）24-0164-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201424031

罗非鱼（Oreochromis），又名非洲鲫鱼、越南鱼、吴郭鱼等，属硬骨鱼纲、鲈形目、鲡鱼科、罗非鱼属，共有600余种。因其具有食性广、生长快、抗病力与繁殖力强等优点，已于1976年被联合国粮农组织列为向世界各国推广养殖的鱼类，并有望成为未来动物性蛋白质的主要来源之一[1]。近年来，我国罗非鱼养殖业发展迅猛，养殖总产量由2002年的70.7万 t上升到2012年的155.3万 t，其中2012年的出口总量为36.2万 t，出口总额为11.6亿 美元，养殖量和出口量均位居世界第一[2-4]。

水产品在贮运过程中极易腐败变质，失去食用性以及加工性，并且危害到消费者的身体健康。总挥发性盐基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）是鱼贝类在酶和细菌的作用下，蛋白质分解生成具有挥发性的氨、伯胺、仲胺及叔胺等低级碱性含氮化合物的统称，可以作为评价鱼类新鲜度的重要指标[5]。GB 2733—2005《鲜、冻动物性水产品卫生标准》[6]规定了各类水产品相对应的TVB-N含量上限。然而在实际操作过程中，传统的TVB-N检测方法费时、费力，且必须破坏样品，造成损失，无法满足在生产及流通过程中快速无损评价鱼肉新鲜度的需求。

近红外光谱技术以其可以快速、无损、批量分析复杂样品而被广泛应用于对农业、食品、石化与药物等产品的分析[7-8]。近年来，应用近红外光谱技术检测鱼肉新鲜度的研究时有报道，然而由于鱼肉水分含量高、样品均一性差，如何达到无损检测的目标仍然是研究的热点[9-13]。

目前，我国罗非鱼出口总量的6 成以上是冻罗非鱼片，其在运输和贮藏过程中极易因环境温度上升而导致新鲜度下降。因此，本研究通过冷藏获得新鲜度不同的罗非鱼片，采集其不同部位的近红外光谱以及TVB-N含量，优化光谱预处理及建模方法，从而获得最优罗非鱼片TVB-N含量的近红外定量预测模型，以期建立罗非鱼片新鲜度的近红外光谱快速、无损评价方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲜活罗非鱼（0.4～0.6 kg），购自上海市铜川路水产市场，采用泡沫塑料箱充氧保活运至实验室。击晕、宰杀并去除鱼鳞、内脏后清洗、剖片（沿脊骨剖切）、去皮，用保鲜膜将鱼片包裹于聚丙烯托盘中，放置在4 ℃冰箱保存。在贮藏时间0、2、4、6、8、10 d时取样，每次取8 片用于后续实验。

轻质氧化镁、硼酸、溴甲酚绿、甲基红（均为分析纯） 国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

NIR Flex N500型傅里叶变换近红外光谱仪（光源为钨灯，检测器为珀耳帖温控InGaAs，波数精度为±0.2 cm－1，带固体测量池和XL附件（光谱采集窗口为直径20 mm的圆）） 瑞士Büchi公司；KEJET 8400型自动定氮仪 丹麦Foss公司；A11 basic分析用研磨机 德国IKA公司；HYC-326A药品保存箱 海尔公司。

1.3 方法

1.3.1 光谱采集方法

鱼片在擦干表面水分后直接置于XL附件上（靠近鱼皮的一面紧贴XL附件），以漫反射的方式采集光谱。背部与腹部分别扫描3次，每次采集的区域不重叠。将鱼片沿侧线剪开，背部与腹部分别绞碎后置于XL附件上仍以漫反射的方式采集光谱，每个样品扫描3 次。将每个样品得到的3 条光谱求平均后待分析。

NIR Flex N500光谱采集参数：扫描谱区波数范围4 000～10 000 cm－1（1 000～2 500 nm），扫描次数
32次，分辨率4 cm－1，以Spectralon为参照背景。

1.3.2 TVB-N含量的测定

根据GB/T 5009.44—2003《肉与肉制品卫生标准的分析方法》[14]及略加修改的邓辉萍等[15]的方法，利用凯式定氮仪对绞碎的背肉及腹肉分别进行测定。准确称取绞碎罗非鱼肉（2.000 0±0.100 0）g于750 mL消化管中，加入0.5 g轻质氧化镁，设置参数如下：吸收液30 mL，蒸馏水50 mL，加碱量0 mL，模式delay。每个样品做3个平行，结果取平均值作为TVB-N的含量。

2 结果与分析

2.1 TVB-N含量测定结果

罗非鱼背肉及腹肉的TVB-N含量测定结果见表1。GB 2733—2005《鲜、冻动物性水产品卫生标准》[6]规定当淡水鱼、虾的TVB-N含量超过20 mg/100g时即为不新鲜。本实验所采集罗非鱼肉的TVB-N含量范围为8.7～31.92 mg/100g，具有比较好的代表性。

为了对校正集所建模型的优劣进行评价，事先将所有48 个样本按3∶1的比例随机划分成校正集和验证集。同时应注意校正集样本的TVB-N含量范围要大于验证集，以保证所建模型在进行验证时具有良好的适用性[7]。

表 1 背肉及腹肉模型校正集与验证集TVB-N含量范围

Table 1 TVB-N contents of calibration set and validation set of back and abdomen meat models

2.2 光谱预处理

绞碎前后不同部位罗非鱼肉的近红外原始光谱见图1、2。比较鱼肉绞碎前后的原始光谱可以明显地看出，绞碎过程使鱼肉的均匀性得到了大幅提升。绞碎前的鱼肉因样本间光谱采集部位的不同导致其光谱形状上存在差异，而绞碎后鱼肉光谱的形状则基本一致。另外，绞碎前鱼肉的光谱在8 000～10 000 cm－1范围内的反射率值要低于绞碎后的鱼肉。这可能是由于水分在此波数范围内有特征吸收，而绞碎前的鱼肉表面有较多水分残留且绞碎过程使肌肉中不易流动水产生损失所造成的[16]。

图 1 绞碎前（a）、绞碎后（b）罗非鱼背肉的原始近红外光谱图

Fig.1 Original NIR spectra of tilapia dorsal muscle before (a) and
after (b) being minced

图 2 绞碎前（a）、绞碎后（b）罗非鱼腹肉的原始近红外光谱图

Fig.2 Original NIR spectra of tilapia belly muscle before (a) and
after (b) being minced

近红外光谱不仅可以反映样品的化学组成及含量等信息，还会受到其密度、粒度、纹理等物理因素的干扰，甚至还包含有一部分的无关信息，如背景噪音、杂散光等。为了尽可能多地从光谱中提取与待测化学组成相关的信息，以便建立稳定、可靠的定性、定量预测模型，就必须对光谱进行适当地预处理，消除其他无关信息的干扰[17]。

由于本实验是直接采集鱼肉的近红外光谱，故鱼肉均一性不佳且表面平整性较差等因素将会直接影响光谱信息的挖掘，更需要选用合适的光谱预处理方法。González-Martin等[18]在研究应用近红外光谱技术无损检测猪肉脂肪酸的含量时，将多种光谱预处理方法结合使用，得到了较好的结果。

因此，本实验采用三点平滑（smoothing average 3 points，sa3）、九点平滑（smoothing average 9 points，sa9）、九点卷积平滑（smoothing savitzky-golay 9 points，sg9）、一阶导数（1st derivative，Db1）、趋近归一化（normalization by closure，Ncl）、单位长度归一化（normalization to unit length，Nle）、标准正态变换（standard normal variate，SNV）、多元散射校正（multiplicative scatter correction，MSC）对所得的原始光谱进行预处理后，利用偏最小二乘法对全波段进行回归分析，以绞碎前的背肉为例，通过比较所建模型的优劣选择合适的光谱预处理方法，结果如表2所示。

通过比较模型间决定系数及标准偏差的大小可以看出，单一使用某一预处理方法时，仅有sg9和Db1效果尚可。它们的校正集和验证集决定系数均在0.87以上，标准偏差均接近甚至小于2 mg/100 g。这主要是因为导数可以用于消除光谱的基线漂移及背景干扰，分辨重叠峰，提高分辨率和灵敏度。而Savitzky-Golay卷积平滑相对于移动平均平滑可以避免光谱信号的失真，获得更好地去噪效果[19]。当其他预处理方法结合一阶导数再对光谱进行预处理时，模型的各评价指标均得到了优化，决定系数多数增大到0.9以上，标准偏差则普遍接近并小于2mg/100g。模型建立所用主因子数也普遍小于单一预处理方法，说明建模效率得到了提升。经比较，SNV＋Db1具有最佳的预处理效果，其所得模型具有最大校正集与验证集的决定系数，分别为0.964和0.931，标准偏差也都要小于其他方法，分别为1.144 mg/100 g和1.612 mg/100 g。这可能与SNV能够消除固体颗粒大小、表面散射以及光程变化对光谱的影响有关[17]，处理后的光谱见图3。

表 2 不同预处理方法的绞碎前背肉TVB-N模型结果

Table 2 TVB-N models of dorsal muscle before being minced by using various preprocessing methods

图 3 经SNV＋Db1处理后的绞碎前罗非鱼背肉近红外光谱图

Fig.3 NIR spectra of tilapia dorsal muscle before being minced pretreated by SNV＋Db1

采用同样的步骤对绞碎后背肉及绞碎前后腹肉进行光谱预处理方法的优化。优化后的模型效果见表3。

表 3 光谱预处理方法的优化结果

Table 3 The best pretreatment methods for NIR spectra

2.3 模型的建立及优化

由于多元校正模型效果的优劣不仅取决于样本的质量，更与样本各变量所含有的信息息息相关，因此模型的建立应保证所用变量具有较好的代表性并且包含有尽可能多的相关信息而非无关信息。然而近红外光谱在进行模型的建立时基本都需要对大量的样本和变量进行分析，剔除那些不提供信息的变量就成为了提高模型预测能力的必要手段[20-21]。本研究利用光谱仪自带的NIR Cal 5.2数据处理软件对各模型进行波数范围的筛选，结果见表4。

表 4 模型的波数筛选结果

Table 4 The best wavenumber region for modeling

从表4可以看出，与未经绞碎的鱼肉相比，绞碎后的鱼肉均是在使用全波段建模时具有最佳模型效果。也就是说，绞碎前的鱼肉因样品均一性差、表面不平整等原因造成某些光谱区域噪声增大，无关信息增多，需要通过筛选变量才能获得效果较优的模型。其中，在接近InGaAs检测器检测极限4 000～5 000 cm－1波数范围内时，检测器的敏感性会降低，光谱吸收减少，反射光的信噪比也会随之下降。因此，在进行波长筛选的时候，常常需要考虑剔除这一波数范围内的变量信息[22]。

最后，经过光谱预处理方法以及波数范围的优选，绞碎前背肉TVB-N定量预测模型的校正集和验证集决定系数由0.870、0.821上升到了0.973、0.925，校正集和验证集标准偏差由2.152、2.991 mg/100 g减小到1.032、1.581 mg/100 g，说明光谱预处理及波数范围筛选过程对提高模型预测能力具有比较明显的效果。从最终得到的模型来看，绞碎过程因其提高了样品的均一性，确实有利于样品的光谱采集以及预测模型的建立，绞碎后背肉及腹肉模型效果要优于各自绞碎前鱼肉所建的模型。Barbin[23]及Barlocco[24]等比较了绞碎及完整猪肉的水分、蛋白质、脂肪等近红外定量预测模型，均有类似结果。但是考虑到绞碎过程破坏了样品且增加了测定步骤，耗费了更多的时间，无法应用于实际生产和批量检测。因此，不经绞碎、直接进行光谱采集的方式在能够保证模型的预测效果的同时，将具有明显的优势。本研究结果表明，绞碎前腹肉TVB-N定量预测模型的校正集和验证集决定系数分别为0.982、0.976，校正集和验证集标准偏差分别为0.962、1.006 mg/100 g，甚至略优于绞碎后的背肉所建立的模型。这可能是由于相对于背肉而言，腹肉更适合于建立TVB-N定量预测模型。程旎等[25]针对鳊鱼不同部位进行了光谱采集，最终建立的TVB-N预测模型效果是尾部最优，腹部其次，胸部最差。

本研究所建罗非鱼片绞碎前背肉及腹肉TVB-N定量预测模型的实测值与预测值散点图如图4所示。

a.绞碎前背肉；b.绞碎前腹肉。

图 4 TVB-N实测值与模型预测值散点图

Fig.4 Scatter plots of NIR predicted vs. actual values for TVB-N content

3 结 论

采集罗非鱼片近红外光谱后利用化学计量学方法将其与鱼肉TVB-N含量进行拟合，可以构建TVB-N近红外定量预测模型以评价其新鲜度。然而，由于原始光谱带有一些噪音，会使得预测模型受到无关信息的干扰。通过采用sa3、sa9、sg9、Db1、Ncl、Nle、SNV、MSC对光谱进行预处理，可以实现消除光谱的背景干扰，提高分辨率以及去噪等效果。且在将其他预处理方法与Db1结合的时候不仅可以提高模型预测能力还能够提升建模效率。在对波数范围进行筛选，剔除无关信息之后，各预测模型效果达到最优。

通过比较绞碎前后不同部位鱼肉所建立的TVB-N定量预测模型可知，绞碎过程提高了鱼肉的均一性，有利于预测模型的建立，但无法实现快速无损的检测。而绞碎前腹肉TVB-N定量预测模型的校正集和验证集决定系数分别为0.982、0.976，校正集和验证集标准偏差分别为0.962、1.006 mg/100 g，模型效果良好，预测准确度较好，为快速、无损、批量评价罗非鱼片新鲜度提供了一种可行的办法。

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