解冻猪肉品质和基于LF-NMR技术的检测方法

庞之列，殷 燕，李春保*

（南京农业大学食品科技学院，农业部畜产品加工重点实验室，食品安全与营养协同创新中心，江苏 南京 210095）

摘 要：研究解冻对猪肉营养品质的影响，并研究利用低场核磁共振技术检测解冻猪肉的可行性。选择10 条宰后5 h内的猪背最长肌，每条通脊沿垂直于肌纤维方向取质量为100 g的肉块5 块，1 块空白，其余在－20 ℃冷冻1、3、5、7 d后在0～4 ℃条件下解冻24 h后收集汁液，测定蛋白质含量、氨基酸含量和矿物元素含量。选择宰后5 h内的猪背最长肌10 条，分别沿垂直于肌纤维方向分切厚度为2.5 cm的肉块8 块，分成4 组，每组2 块肉样，分别在0～4 ℃中贮藏0、24、48、72 h后，各组各取1 块于－18 ℃中冻藏24 h后在0～4 ℃中解冻12 h，另一块不处理，然后测定肉色（L*、a*和b*）、低场核磁共振横向弛豫时间（T2）。结果表明，解冻会使猪肉蛋白质、矿物元素和氨基酸的流失量显著增大；解冻会导致猪肉低场核磁共振弛豫时间T2中第2个峰（T21）的峰时间（t21）、峰面积（A21）和峰面积比（P21）减小，色差中的红度值（a*）增大。可以利用t21、A21、P21、a*这4 项指标检测解冻猪肉。

关键词：解冻猪肉；营养；低场核磁共振；检测方法

Applicability of LF-NMR to Detect Quality of Thawed Pork

PANG Zhi-lie, YIN Yan, LI Chun-bao*

(Synergetic Innovation Center of Food Safety and Nutrition, Key Laboratory of Animal Products Processing, Ministry of Agriculture, College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

Abstract: This study was designed to investigate the influence of thawing on pork nutrition and the feasibility of detecting thawed pork by low-field nuclear magnetic resonance (LF-NMR) technology. Five pieces weighed at 100 g were removed from pork longissimus dorsi muscle along the direction of perpendicular to the muscle fibers, and four of these pieces were frozen at -20 ℃ for 1, 3, 5 and 7 d, respectively and then thawed at 0–4 ℃ for 24 h. Another piece was used as control. The exudate was collected to determine the contents of proteins, amino acids and mineral elements. Additional pork longissimus dorsi muscle was divided into 8 2.5 cm thick pieces along the direction of perpendicular to the muscle fibers at 5 h postmortem. These pieces were divided into four groups and stored at 0–4 ℃ for 0, 24, 48 and 72 h, respectively. One piece in each group was frozen for 24 h at -18 ℃ and then thawed for 12 h at 0–4 ℃ and the other one was used as control. The color parameters L*, a* and b* and NMR T2 were measured. The results showed that thawing could significantly increase the total loss of proteins, mineral elements and amino acids, reduce the peak time (t21), area (A21) and area ratio (P21) of the second peak (T21) of LF-NMR T2 relaxation time and increase the redness (a*). These four indexes of t21, A21, P21 and a* can be used to detect thawed pork.

Key words: thawed pork; nutrition; low field nuclear magnetic resonance (LF-NMR); detection

中图分类号：TS251.7 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）24-0219-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201424042

冷冻贮藏是延长猪肉货架期的最有效的手段之一，但是解冻会导致猪肉持水力的下降、滴水损失增大、嫩度降低等，影响猪肉的表观颜色，造成营养成分的大量流失[1-2]。在我国市场上，很多解冻肉在销售时并未被贴上标签，消费者在购买时难以辨别。目前解冻猪肉的检测方法有感官判别法、生物成像法、酶分析法和光谱技术[3]。光谱技术中的低场核磁共振（low field nuclear magnetic resonance，LF-NMR）检测法属于近年来新兴的解冻猪肉检测方法[4]。Kari[5]、Thierry[6]等发现：解冻肉与新鲜的肉相比，它的横向弛豫时间显著性下降，而且肉在冷冻时的温度越低，弛豫时间下降越显著。根据这一特性，运用LF-NMR技术鉴别解冻猪肉是具有可行性的，但是如何运用LF-NMR技术去检测解冻猪肉，还缺少具体的数据支撑，缺少一个完善的体系[7]。因此，也有必要深入研究建立一种基于LF-NMR技术的解冻猪肉快速检测方法。综上所述，本实验分为2部分，第1部分定量分析了解冻对猪肉营养成分流失的影响，第2部分具体研究运用LF-NMR技术检测解冻猪肉。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

猪肉背部最长肌采购自南京元润食品有限公司，于宰后5 h 内冷藏带回实验室进行分析。

二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量分析试剂盒 美国Thermo公司；M2e酶标仪 美国MD公司；Optima 2100 DV ICP电感耦合等离子体 美国
Perkin Elmer公司；MARS微波消解仪 美国CEM公司；L-8900高速氨基酸分析仪 日本日立公司；CR-300色
差计 日本Konica Minolta公司；PQ001低场核磁共振分析仪 上海纽迈电子科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 流失营养成分测定

1.2.1.1 样品准备

选择10 条宰后5 h内的猪背最长肌，沿肌肉走向垂直的方向分切成质量约为100 g的肉块5 块，1 块空白，其余在－20 ℃冷冻1、3、5、7 d后在0～4 ℃条件下解冻贮藏24 h后收集汁液，用于计算汁液流失率并测定汁液中的蛋白质含量、水解氨基酸含量和矿物元素含量。

1.2.1.2 蛋白质含量测定

BCA蛋白定量分析试剂盒，按V（A）∶V（B）=1∶50配制A-B混合液，与待测液在酶标仪中放置反应30 min（温度37 ℃，振荡1～2 次），选择在562 nm波长处测定。

1.2.1.3 矿物元素含量测定

称取0.50 g样品，放入消解罐内，加入10 mL质量分数65%浓硝酸，晃匀静置20 min，盖紧消解管，在微波消解仪内，参数如表1所示。

表 1 MARS参数

Table 1 Parameters of MARS

消解完成后冷却至70 ℃以下打开消解管，在100 ℃水浴中排酸至没有黄烟流出，少量多次用质量分数2%稀硝酸转移到50 mL容量瓶中，用质量分数2%稀硝酸定容，再转移到50 mL离心管中保存待测。使用电感耦合等离子体检测样品中Zn、P、Fe、Mn、Mg、Ca、Cu、Na和K的含量[8-9]。

1.2.1.4 氨基酸含量测定

参照GB/T 5009.124—2003《食品中氨基酸的测定》[10]，略有改动。称取0.50 g样品置于50 mL离心管中，添加10 mL 6mol/L盐酸溶液，晃匀。用氮气置换离心管中的空气，盖上盖子，用封口膜封口。将离心管置于110 ℃鼓风干燥箱中恒温水解22 h，冷却后用蒸馏水少量多次转移到50 mL容量瓶中，用蒸馏水定容。摇匀，过滤，取200 μL至5 mL离心管中，氮吹至干，加2 mL 0.02 mol/L盐酸溶液，涡旋仪振荡，过0.45 μm滤膜，装瓶待测。

1.2.2 LF-NMR检测解冻猪肉

1.2.2.1 样品准备

选择10 条宰后5 h内的整条猪背最长肌（通脊），沿肌肉走向垂直的方向分切厚度为2.5 cm的肉块8 块，分成4 组，每组2 块肉样，分别在0～4 ℃中贮藏0、24、48、72 h后，各组各取1块于－18 ℃中冻藏24 h后在0～4 ℃中解冻12 h，另一块不处理，然后测定肉色（L*、a*和b*）、LF-NMR横向弛豫时间（T2）。

1.2.2.2 肉色测定

将分切的肉块平放在红色塑料盘上，置于0～4 ℃氧合30～40 min，之后用色差计测定L*（亮度值）、a*（红度值）、b*（黄度值）。测定前，对色差计校正，之后将镜头垂直置于肉面上，镜口紧扣肉面（不能漏光），按下摄像按扭，颜色参数L*、a*、b*即自动存入微机。每个样品至少测定3 个点，取L*、a*、b*的平均值[11]。

1.2.2.3 LF-NMR弛豫时间测定

用刀修整肉块的边沿，并找出肌纤维的自然走向，在肉块的切取过程中，应避免肉眼可见的结缔组织、血管及其他缺陷。用双片刀（间距1 cm）沿肌纤维的自然走向分切成多个1 cm厚的小块；再用锋利的陶瓷刀从1 cm厚的小块中分切出1 cm宽的肉柱（质量为1.5 g），将肉柱放入特定的样品管中，用LF-NMR仪进行横向弛豫时间（T2）的测定，每个肉样平行测定2次，取平均值。在32 ℃、22.4 MHz共振频率下，使用CPMG（carr-purcell-meiboom-gill）脉冲序列（90°脉冲和180°脉冲之间的时间τ＝200 μs），重复扫描8 次，间隔3 s，得到2 000 个回波。

1.3 统计分析

数据处理采用SAS 9.1.2软件分析系统，其中解冻和贮藏时间对实验指标的影响采用析因方差分析（Factorial ANOVA），各处理组间的差异显著性采用Duncan’s Multiple Comparison。

2 结果与分析

2.1 汁液流失率

猪肉解冻后在0～4 ℃环境条件下贮藏24 h后的汁液流失率如表2所示。猪肉冷冻过程中形成的冰晶挤压肌原纤维，改变细胞内部结构，甚至造成细胞膜的破裂，导致解冻过程中汁液流失，保水性下降。所以解冻猪肉的流失率显著增大（P＜0.05）；随着冷冻时间的延长，猪肉的汁液流失率增大，冷冻1 d组与冷冻5、7 d间有显著差异，其余各冷冻组的差异不显著（P＞0.05）。

表 2 汁液流失率

Table 2 Drip loss rates

注：同行不同上标字母表示差异显著（P＜0.05）；相同上标字母表示差异不显著（P＞0.05）。下同。

2.2 营养成分含量变化

在对解冻猪肉流失的汁液成分测定后发现，汁液中除了水分还包含蛋白质和矿物元素。每100 g解冻猪肉所流失的营养成分含量变化如表3所示。

表 3 猪肉营养成分含量变化

Table 3 Changes of nutrients in pork

μg/100g

注：*.蛋白质含量单位为mg/100g。

解冻猪肉的蛋白质和矿物元素的流失量显著增加（P＜0.05），流失的各矿物元素量大小次序与猪肉中的各种元素含量次序是一致的，依次是K、P、Na、Mg、Ca、Fe、Zn、Cu、Mn。随着冷冻时间的延长，蛋白质流失量增加，冷冻1 d与7 d组差异显著（P＜0.05）；随着冷冻时间的延长，矿物元素流失量增加，其中K、P、Ca、Cu、Mn冷冻1d与冷冻5、7d组的流失量之间有显著性差异（P＜0.05）；冷冻时间对Na、Mg、Fe、Zn的流失量作用不显著（P＞0.05）。

2.3 氨基酸含量变化

解冻猪肉在0～4 ℃环境条件下贮藏24 h后，每100 g猪肉流失的氨基酸含量如表4所示。解冻会导致17 种氨基酸（包括必需氨基酸赖氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸）的流失量显著增大（P＜0.05）。随着冷冻时间的延长，氨基酸的流失量增大，其中以谷氨酸和天冬氨酸的增大趋势最为显著；冷冻7 d组的流失量显著大于1、3 d 组（P＜0.05）。

表 4 猪肉流失氨基酸量

Table 4 Changes of amino acids in pork

mg/100 g

2.4 运用LF-NMR技术检测解冻猪肉

表 5 不同处理猪肉实验结果析因方差分析表

Table 5 Factorial ANOVA of the measurements

注：t2b、A2b、P2b分别代表猪肉LF-NMR检测中结合水的出峰时间、峰面积及结合水占猪肉中总水分的比例；t21、A21、P21分别代表猪肉中不易流动水的出峰时间、峰面积和峰面积比；t22、A22、P22分别代表猪肉中自由水的出峰时间、峰面积和峰面积比。

从表5可以看出，结合水的峰面积和峰面积比会因为冻结解冻而显著增大（P＜0.05）。但是，解冻对结合水的出峰时间没有显著影响（P＞0.05），冷冻前的贮藏时间对结合水的t2b、A2b、P2b 3项指标也没有显著性影响（P＞0.05）。因此，结合水的指标不适合作为解冻猪肉的检测指标。

冷冻前的贮藏时间对t21、A21、P21 3 项指标无显著性的影响，但冻结解冻会导致t21显著减小（P＜0.05），增大不易流动水的稳定性（出峰时间缩短）；不易流动水的峰面积和峰面积比也会因为冻结解冻而显著减小
（P＜0.05）。冻结解冻对不易流动水的3项指标均有显著影响（P＜0.05），而且不易流动水是肉中水分的主要存在形式，便于检测，因此，t21、A21、P21可以作为解冻猪肉的检测指标。

解冻会造成自由水的流失，表现为A22、P22的显著减小（P＜0.05）；冷冻前的贮藏时间越长，t22、A22、P22有增大的趋势。但解冻对自由水的出峰时间没有显著的影响（P＞0.05），且自由水只占猪肉中水分的很小一部分，受外界干扰程度大。为了检测的准确性，自由水的指标不适合用于解冻猪肉的检测。

色差的3 项指标中，只有a*（红度值）会因为解冻而显著增大（P＜0.05），而L*（亮度值）和b*（黄度值）的变化规律性不显著，不如a*明显。因此，可以将a*作为用LF-NMR检测解冻猪肉的辅助性检测指标。

综上所述，LF-NMR横向弛豫时间T2的不易流动水的3 项指标（t21、A21、P21）和颜色参数a*值可作为判定解冻猪肉的指标。对这4 项指标的具体分析结果如图1所示。

图 1 解冻随贮藏时间对t21（A）、A21（B）、P21（C）和a*（D）的影响

Fig.1 Changes of t21, A21, P21 and a* with storage time for thawed and non-frozen pork

由图1A可知，解冻猪肉在冻结过程中内部形成冰晶，对肌原纤维结构造成挤压，导致部分不易流动水流出，存留在其中的不易流动水更加稳定，表现为出峰时间的前移。如图1B和图1C所示，解冻肉的结构在冻融过程中受到冰晶的挤压和低温的破坏，部分不易流动水流出，造成不易流动水的峰面积和峰比例显著下降
（P＜0.05）。如图1D所示，解冻肉中的肌红蛋白在与氧气反应后，生成氧合肌红蛋白，表现为鲜红色，使解冻肉的a*显著高于正常猪肉。

3 讨 论

冻结解冻作为一种有效的延长货架期的贮藏手段，也会对猪肉的食用品质造成不利影响。有研究[12-13]表明，猪肉的品质会随着冻结解冻而变得越来越差，表现为蛋白溶解度降低、蒸煮损失增加、滴水损失增加和嫩度变差等。冷冻时产生的冰晶不断挤压细胞结构，作用于肌原纤维结构，并对肌肉细胞膜和细胞器造成机械损伤，使蛋白质变性，破坏猪肉的完整性，导致猪肉的保水性显著下降[14-15]，流失更多的水分和营养物质。本实验的结果与此相一致：解冻之后，猪肉的汁液流失率会显著增大，流失更多的蛋白质、矿物元素。17 种氨基酸（谷氨酸和天冬氨酸最为显著）的流失量也会增大。

本实验还研究了应用LF-NMR技术检测解冻猪肉的可行性，猪肉肌肉中的水分主要是以自由水、不易流动水和结合水这3 种形式存在[16]。自由水指的是肌肉中能够自由流动，存在于细胞外间隙中的水，它仅靠毛细管作用力而保持，约占总水分的15%；不易流动水是指那些存在于肌原纤维、纤丝中约占总水分80%的水分，由于它们与蛋白质的亲水基团相距较远，导致分子排列虽然有一定朝向性但排列的秩序不够统一，会随着蛋白质结构或者电荷的变化而变化；结合水是指与蛋白质大分子之间通过静电引力而紧密结合的一部分水分子，大约占总水分的1%～4%，它们的状态非常稳定，基本不会受到肌肉蛋白质结构变化的影响，也不会受到外力的影响。LF-NMR的横向弛豫时间（T2值）的差异可有效区分肉品中水分的3 种分布状态：T2b=1～10 ms反应和大分子紧密相连的水[17]，可认为其对应结合水；T21=30～60 ms反应位于高度组织化的蛋白质结构内部的水[12]或细胞内水，可认为其对应不易流动水；T22=100～400 ms为肌原纤维蛋白外部的水[18]或细胞外水，对应于自由水。本实验在横向弛豫测定中发现：猪肉在冷冻过程中，一方面，形成的冰晶不断挤压肌原纤维，使它们的结构更加紧致，也使存在于其间的不易流动水的稳定性增强，另一方面，解冻后不易流动水总量下降，稳定性增大，表现为弛豫时间的提前（t21的下降）；解冻后猪肉内部的机械损伤使保水性能下降，流失大量不易流水和自由水。在动态平衡的影响下，一部分不易流动水又转换成为自由水，导致不易流动水的总量和所占比例大幅下降，表现为A21、P21的下降[19]。在色差测定中，发现解冻猪肉中的肌红蛋白在与氧气发生反应之后，生成鲜红色的氧合肌红蛋白，使a*变化显著。因此，本实验最终在结合水、不易流动水、自由水的出峰时间、峰面积、峰面积比指标中（t2b、A2b、P2b；t21、A21、P21；t22、A22、P22），挑选出了t21、A21、P21和色差a*作为检测解冻猪肉的指标[20-21]。

综上所述，基于LF-NMR技术，利用t21、A21、P21、a*这4 项指标检测解冻猪肉具有可行性。但是在实际推广运用前还需要对t21、A21、P21、a*进行有效域值的划分，尚有待进一步研究。

4 结 论

解冻会导致猪肉的品质下降，汁液流失率增大，蛋白质、矿物元素和氨基酸的流失量增大。解冻会导致猪肉LF-NMR弛豫时间T2中第2个峰（T21）的峰时间（t21）、峰面积（A21）和峰面积比（P21）减小，并导致色差测定中的红度值（a*）增大。可以利用LF-NMR技术中的t21、A21、P21以及色差测定值a*这4 项指标组合，检测解冻猪肉。

参考文献：

[1] 靳青青, 马兆立, 李温静, 等. 解冻方法及解冻时间对冻结猪肉品质的影响[J]. 肉类工业, 2013(11): 7-11.

[2] SHANKS B C, WΜLF D M, MADDOCK R J. The effect of freezing on Warner-Bratzler shear force values of beef longissimus steaks across several post-mortem aging periods[J]. Journal of Animal Science, 2002, 80: 2112-2125.

[3] 戚军. 反复冻融对羊肉品质的影响研究[D]. 南京: 南京农业大学, 2009: 8-13.

[4] 张学文, 张立福, 黄长平, 等. 基于FISS成像光谱数据的鲜-解冻肉识别研究[J]. 光谱学与光谱分析, 2011, 31(8): 2187-2190.

[5] KARI T, TOMAS I. Differentiation of frozen and unfrozen beef using near-infrared spectroscopy[J]. Science of Food and Agriculture, 1997, 73(4): 525-532.

[6] THIERRY M G, ALAN D P, JEAN J T, et al. Authentication of the effect of freezing/thawing of pork by quantitative magnetic resonance imaging[J]. Magnetic Resonance in Chemistry, 1997, 35(13): 112-118.

[7] 周爱梅, 曾庆孝, 刘欣, 等. 冷冻鱼糜蛋白在冻藏中的物理化学变化及影响因素[J]. 食品科学, 2003, 24(3): 153-157.

[8] 耿薇, 古元梓, 魏永生, 等. 微波消解-ICP-OES法测定甜荞麦中的矿物元素[J]. 河南化工, 2012, 29(1): 45-47.

[9] 魏刚才, 谢红兵, 常新耀, 等. 野猪肉和家猪肉中Ca、Cu、Fe和Zn的测定及比较[J]. 光谱实验室, 2008, 25(6): 1140-1142.

[10] 中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所. GB/T 5009.124—2003 食品中氨基酸的测定[S]. 北京: 中国国家标准化管理委员会, 2003.

[11] 王晓宇. 冷却猪肉食用品质评定方法的标准化[D]. 南京: 南京农业大学, 2012: 23-24.

[12] 夏秀芳, 孔保华, 郭园园, 等. 反复冷冻-解冻对猪肉品质特性和微观结构的影响[J]. 中国农业科学, 2009, 42(3): 982-988.

[13] 余小领, 李学斌, 赵良, 等. 常规冷冻冻藏对猪肉保水性和组织结构的影响[J]. 农业工程学报, 2008, 24(12): 264-268.

[14] 余小领. 冷冻和解冻工艺对猪肉保水性和组织结构的影响研究[D]. 南京: 南京农业大学, 2007: 18-24.

[15] 余小领, 李学斌, 闫利萍, 等. 不同冻结和解冻速率对猪肉保水性和超微结构的影响[J]. 农业工程学报, 2007, 23(8): 261-265.

[16] 周光宏. 肉品学[M]. 北京: 中国农业科技出版社, 1999: 162-164.

[17] BEZRTRAM H C, KARLSSON A H, ANDERSEN H J. The significance of cooling rate on water dynamics in porcine muscle from heterozygous carriers and non-carriers of the halothane gene: a low-field NMR relaxation study[J]. Meat Science, 2003, 65(4): 1281-1291.

[18] BERTRAM H C, KARLSSON A H, RASMUSSEN M, et al. Origin of multiexponential T2 relaxation in muscle myowater[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2001, 49(6): 3092-3100.

[19] 韩敏义. 猪肉肌原纤维蛋白凝胶功能特性和结构关系研究[D]. 南京: 南京农业大学, 2009: 10-17.

[20] 夏天兰, 刘登勇, 徐幸莲, 等. 低场核磁共振技术在肉与肉制品水分测定及其相关品质特性中的应用[J]. 食品科学, 2011, 32(21): 253-256.

[21] LI Chunbao, LIU Dengyong, ZHOU Guanghong, et al. Meat quality and cooking attributes of thawed pork with different low field NMR T21[J]. Meat Science, 2012, 92(2): 79-83.