茶叶籽中黄酮的分离及HPLC-MS联用分析

杨安琪,吕丽爽,王华清,李建林,郑铁松*

(南京师范大学金陵女子学院食品科学与营养系,江苏 南京 210097)

 

摘 要:用大孔吸附树脂HPD826分离纯化茶叶籽总黄酮的粗提物,对影响HPD826树脂动态吸附、解吸的各因素进行系统研究。最终确定最佳条件为:上样液质量浓度1.8 mg/mL、上样速率2 mL/min、体积分数50%乙醇作为洗脱剂、洗脱剂流速1 mL/min。纯化后的茶叶籽黄酮纯度为40.81%,比纯化前提高了7.63 倍。通过高效液相色谱-质谱联用分析大孔吸附树脂纯化后样品,初步确定茶叶籽中4 种黄酮的结构,均为柚皮素的多糖苷。

关键词:茶叶籽;总黄酮;纯化;高效液相色谱-质谱联用

 

Purification of Total Flavonoids from Tea (Camellia sinensis L.) Seeds and Composition Analysis by HPLC-MS

 

YANG An-qi, LÜ Li-shuang, WANG Hua-qing, LI Jian-lin, ZHENG Tie-song*

(Department of Food Science and Nutrition, Ginling College, Nanjing Normal University, Nanjing 210097, China)

 

Abstract: HPD826 resin was selected to purify flavonoids from tea seeds and the optimum chromatographic conditions were determined as follows: sample concentration 1.8 mg/mL, sample loading flow rate 2 mg/mL, and 50% ethanol as the eluent at a flow rate of 1 mL/min. Under these conditions, the purity of flavonoids from tea seeds was increased 7.63 times to 40.81% compared with that before optimization. The composition and structures of the extracted flavonoids were analyzed by HPLC-MS. The four flavonoid compounds purified from tea seeds were all characterized as aglycon naringenin.

Key words: tea seed; total flavonoids; purification; high performance liquid chromatography-mass spectrometry (HPLC-MS)

中图分类号:TS201.2 文献标志码:A 文章编号:1002-6630(2014)24-0228-07

doi:10.7506/spkx1002-6630-201424044

茶叶籽是茶树(Camellia sinensis (L.) O. Kuntze, Theaceae)的种子,为茶叶生产的副产品[1-3]。茶叶籽资源丰富,但长期以来,人们对于茶叶的种植、加工和研究较多,而对茶叶籽这一茶叶生产副产品的开发利用不太重视,造成了资源的极大浪费。茶叶籽中富含山奈酚和柚皮素类的黄酮类化合物[2-8]。Gao Dafeng等[4]利用SephadexLH-20、硅胶柱层析从油茶饼粕中分离出8 种黄酮类化合物均为山奈酚衍生物。Chen[5]采用异丙醇盐析法从油茶籽饼粕中分离出7 种黄酮苷,其中3 种为山奈酚的糖苷,3 种为柚皮素的糖苷。Du[6]采用硅胶H柱从油茶籽中分离得到2 种山奈酚的衍生物,对肝癌细胞BEL-7402有较好的抑制作用。大孔树脂具有物理化学稳定性高、选择性好、可重复使用、能耗低、分离设备简单方便、适合工业化生产等优点,是一类有效的分离纯化黄酮类化合物的方法[9-11]。高效液相色谱-质谱(high performance liquid chromatography-mass spectrometry,HPLC-MS)联用技术是将HPLC对复杂样品的高分离能力与MS的高选择性、高灵敏度有效结合起来,可迅速地分析确定成分的结构,并且所需样品量少,是在缺乏标准品的情况下,分析天然产物等复杂体系中的化合物的重要工具,广泛应用于植物中黄酮类物质的分析[7,12-16]。

本研究将用大孔吸附树脂分离纯化茶叶籽总黄酮的粗提物,从AB-8、D101等12 种常用于分离纯化植物黄酮类化合物的树脂中,筛选出最适合分离纯化茶叶籽黄酮的树脂类型,对其纯化工艺条件进行研究,并用HPLC-MS联用技术分析茶叶籽黄酮的结构,以期为茶叶籽黄酮的深入研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

茶叶籽(储叶种)由溧水县健茗茶厂提供;聚酞胺(60~90目) 浙江省台州市路桥四甲生化塑料厂;D101型、AB-8型、NKA-9型、X-5型大孔树脂 南开大学化工厂;DM130型、HPD450型、HPD600型、HPD722型、HPD750型、HPD826型大孔树脂 沧州宝恩吸附材料科技有限公司;各种大孔树脂型号、物理性能见表1;亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、无水乙醇、浓盐酸、石油醚等均为国产分析纯。

表 1 大孔树脂的主要物理性质

Table 1 Physical properties of macroporous resins

树脂型号

极性

平均孔径/nm

粒径/mm

比表面/(m2/g)

孔容

DM130

中极性

90~100

0.3~1.25

500~550

 

AB-8

弱极性

130~140

0.3~1.25

480~520

0.73~0.77

NKA-9

极性

155~165

0.3~1.25

250~290

 

HPD450

中极性

90~110

0.3~1.20

500~550

 

HPD600

极性

80

0.3~1.20

550~600

 

HPD722

弱极性

130~140

0.3~1.25

485~530

 

HPD750

中极性

85~90

0.3~1.20

650~700

 

HPD826

氢键

90~100

0.3~1.25

500~600

 

D101

非极性

100~110

0.3~1.25

400

 

ADS-7

强极性

25~30

0.3~1.25

100

 

ADS-17

氢键

25~30

0.3~1.25

90~150

 

X-5

非极性

290~300

0.3~1.25

500~600

1.20~1.24

 

 

1.2 仪器与设备

N-1001型旋转蒸发仪 日本Eyela公司;Cary5000型紫外-可见-近红外分光光度计 美国Varian公司;DBS-100自动部分收集器、DHL-A恒流泵、HD-3型紫外检测仪 上海沪西分析仪器厂;1100 Series高效液相色谱仪、9460型四极杆串联质谱 美国安捷伦公司。

1.3 方法

1.3.1 总黄酮含量测定

采用硝酸铝络合分光光度法[17]。以芦丁为标准品,茶叶籽中总黄酮的提取量以mg/g表示[3]。

1.3.2 茶叶籽黄酮除杂液的制备

茶叶籽粉在液料比为261(mL/g)、乙醇体积分数58%、提取温度82 ℃,提取时间2 h条件下提取2次,粗提液4 ℃冷藏静置12 h后过滤,经旋转蒸发浓缩。浓缩液用石油醚进行萃取以除去色素和油脂等杂质,连续萃取3 次至醚相无色后收集下层浓缩液。再加3 倍体积乙醇,搅拌均匀,4 ℃冷藏静置12 h以除去多糖、蛋白质等水溶性杂质,旋转蒸发浓缩,去除乙醇,用蒸馏水配制成所需的不同黄酮质量浓度的样品液,即为纯化用茶叶籽黄酮除杂液,4 ℃冷藏备用。

1.3.3 紫外光谱扫描

取2~3 mL适当质量浓度的茶叶籽黄酮除杂液于甲醇中,以甲醇作参比,在紫外-可见光分光光度计中扫描,扫描波长范围为200~500 nm。

1.3.4 各种树脂的静态吸附解吸

取一定量预处理好的树脂真空抽滤,准确称量2.0 g树脂于250 mL锥形瓶中,加入茶叶籽黄酮除杂液30 mL,密封后置于振荡培养箱(25 ℃,120 r/min)中振荡24 h。充分吸附后,过滤,测定滤液中总黄酮的质量浓度,计算各树脂的静态吸附率和吸附量。吸附后的树脂过滤抽干,置于250 mL锥形瓶中,加入体积分数60%的乙醇30 mL,密封后置于振荡培养箱(25 ℃,120 r/min)中振荡24 h,使总黄酮解吸附,过滤,测定洗脱液中黄酮质量浓度,计算各树脂的吸附率(%)、吸附量(mg/g)和解吸率(%)[8,11]。

1.3.5 大孔树脂HPD826动态吸附和解吸

取1.6 cm×30 cm玻璃层析柱,装入预处理好的30 mL HPD826型树脂,将浓缩的除杂液加水稀释成一定质量浓度的上样液上柱吸附,控制流速,用紫外检测仪检测流出液,当流出液的吸光度基本没有变化时,认为大孔树脂达到动态吸附平衡,停止进样。收集流出液测定总黄酮含量,分别以吸附率、吸附量或解吸率为指标考察进样质量浓度(0.85、1.30、1.78、2.21、
2.66 mg/mL)、上样流速(1、2、3、4、5 mL/min)、洗脱剂(乙醇)体积分数(20%、30%、40%、50%、60%、70%)及流速(0.5、1、1.5、2、2.5、3 mL/min,体积分数60%乙醇溶液)对树脂性能的影响,确定最佳条件。

将按最佳工艺得到的茶叶籽黄酮纯化液和粗提液减压浓缩,真空冷冻干燥至恒质量。分别精密称取一定质量的2 种样品溶于体积分数60%乙醇中,按黄酮含量计算方法测定其质量浓度,并按下式计算其纯度。

846552.jpg 

式中:ρ为样液中黄酮质量浓度/(mg/mL);V为定容体积/mL;m为样品质量/mg。

1.3.6 茶叶籽黄酮纯化液HPLC-MS分析条件

色谱条件:Zorbax XDB-C18色谱柱(4.6 mm×
250 mm,5 µm);DAD检测器;进样量3 μL;流速0.6 mL/min;柱温25 ℃;检测波长280 nm;流动相A:体积分数0.05%甲酸水溶液;流动相B:乙腈;流动相梯度:0 min(30% B),12 min(30% B),20 min(60% B)。

质谱条件:电喷雾离子(electrospray ionization,ESI)源,正、负离子模式检测;雾化压力20 psi;干燥气体的流速11 L/min;毛细管温度350 ℃;毛细管电压3.5 kV;扫描范围m/z 100~1 500。

2 结果与分析

2.1 样品紫外光谱扫描

对茶叶籽黄酮除杂液进行紫外光谱扫描,其最大吸收波长在280 nm左右,由于提取液经预处理已除去蛋白质,故可排除蛋白质在此波长条件下的干扰,因此在后期的分离纯化过程中采用280 nm波长条件下紫外跟踪检测上样和洗脱过程。

2.2 大孔吸附树脂的静态吸附和解吸

2.2.1 大孔吸附树脂对茶叶籽黄酮静态吸附率和吸附率测定

考察12 种树脂对茶叶籽黄酮的选择性,得到不同树脂的静态吸附率和解吸率,结果见表2。

表 2 各种树脂静态吸附率和解吸率

Table 2 Absorption and desorption rates of different resins

树脂型号

吸附量/(mg/g)

吸附率/%

解吸率/%

AB-8

6.53

28.15

81.73

ADS-17

8.09

34.85

82.74

ADS-7

7.90

34.02

59.86

D101

4.37

18.85

88.21

DM130

7.17

30.90

82.34

HPD450

7.04

30.32

76.51

HPD600

8.57

36.92

73.55

HPD722

6.70

28.87

55.64

HPD750

7.50

32.33

69.39

HPD826

10.12

43.61

83.86

NKA-9

7.52

32.40

76.35

X-5

5.77

24.88

84.77

聚酰胺

15.25

65.74

32.56

 

 

树脂的吸附能力由树脂的极性、孔径、比表面积等多方面因素决定,对其性能的评价要从吸附量、解吸率以及动力学等方面综合考虑。本实验所选的树脂有非极性、弱极性、中极性、极性和氢键等类型。通过表2可以看出,非极性和弱极性的树脂吸附量很低,而氢键和极性的树脂吸附量相对较高,这可能是由于茶叶籽黄酮的极性相对较大,更有利于氢键和极性树脂吸附[18-19]。从表2可知,所选树脂中吸附量超过10 mg/g的仅聚酰胺和HPD826树脂2 种,且均为氢键吸附型树脂,说明氢键吸附型树脂更有利于茶叶籽黄酮的纯化。而聚酰胺树脂虽然吸附量最高,但解吸率仅32.56%,死吸附较大。而HPD826树脂对茶叶籽黄酮不仅有较好的吸附性而且有良好的解吸性,可以作为纯化茶叶籽黄酮的材料。进一步的实验表明,HPD826树脂吸附3 h基本已达到吸附饱和,属于快速平衡型。该结果与刘江波等[18]的报道一致。综合上述实验结果,选择吸附、解吸效果较好的、且吸附速率较大的HPD826大孔吸附树脂进行茶叶籽黄酮纯化实验。

2.2.2 大孔吸附树脂HPD826的动态吸附和解吸

2.2.2.1 进样质量浓度的确定

从图1可以看出,随着进样质量浓度的增加,黄酮吸附量也随之增加。但当进样质量浓度增加到1.78 mg/mL
以后,进样质量浓度再增加,黄酮吸附量反而逐渐下降。这是因为进样质量浓度较低时,提高进样质量浓度可增加黄酮分子与大孔树脂的接触,加速黄酮分子进入树脂内部并迅速扩散[11,20]。但随着进样质量浓度的增大,与黄酮竞争吸附的杂质量也随之加大[11,20]。综合考虑应选择进样质量浓度为1.8 mg/mL左右进行上柱为宜。

846527.jpg 

图 1 进样质量浓度对树脂性能的影响

Fig.1 Effects of sample concentration on the absorption
efficiency of HPD826

2.2.2.2 进样流速的确定

846518.jpg 

图 2 进样流速对树脂性能的影响

Fig.2 Effect of sample loading flow rate on the absorption
efficiency of HPD826

不同进样流速的吸附量如图2所示,随着流速的增大,树脂对茶叶籽总黄酮的吸附量逐渐降低。树脂对黄酮的吸附需要一个扩散和接触的过程,进样流速过快,目标分子与树脂还未充分接触就已下移到下一个吸附层面,以至于很快通过层析柱流出柱外,这样就无法形成有效的吸附,从而影响分离效果[20-21]。较小的流速则有利于黄酮分子充分与树脂接触结合,被树脂吸附。但流速太小,会造成操作周期长,因此要选择合适的流速[18,20,22-23]。从结果来看,当流速大于2 mL/min时,吸附量迅速下降,因此选择2 mL/min的流速为上样速度。

2.2.2.3 洗脱剂乙醇体积分数的确定

846507.jpg 

图 3 乙醇体积分数对树脂性能的影响

Fig.3 Effect of ethanol concentration on the desorption
efficiency of HPD826

从图3可看出,随着乙醇体积分数的增加,茶叶籽黄酮的解吸率逐渐增加,当乙醇体积分数达到50%时,解吸率的变化趋于平缓,乙醇体积分数60%时解吸率达到最大,再增加乙醇体积分数解吸率反而成下降趋势。虽然用体积分数60%的乙醇洗脱时解吸率最高,但乙醇体积分数越高,洗脱液中醇溶性杂质就越多,成本也更高。所以综合考虑解吸率、纯度和成本等因素,选择体积分数50%乙醇作为本实验的洗脱剂。

2.2.2.4 洗脱剂流速的确定

846497.jpg 

图 4 洗脱流速对树脂性能的影响

Fig.4 Effect of ethanol flow rate on the desorption efficiency of HPD826

从图4可看出,随着洗脱流速的增大,茶叶籽黄酮的解吸率逐渐降低,乙醇还没有把大孔吸附树脂吸附的黄酮完全洗脱就流出了柱子,造成了原料的浪费。另外,流速太低又使生产周期延长,降低效率。通常情况下控制洗脱流速为吸附流速的1/3~1/2[22-23]。因此,洗脱液流速选择1 mL/min。

2.2.2.5 动态洗脱曲线

851190.jpg 

图 5 动态洗脱曲线

Fig.5 Dynamic elution curve of HPD826 resin

动态洗脱曲线如图5所示,该洗脱曲线峰形良好,无明显拖尾现象,表明用体积分数50%乙醇溶液以2 mL/min
的速度洗脱效果良好。先用蒸馏水洗柱可以除去多糖、茶皂素等水溶性杂质。再用体积分数50%乙醇洗脱,6 h后洗脱液的吸光度降到与乙醇洗脱前基本相同且长时间保持不变,可认为树脂上的黄酮已基本被洗脱下来,可以停止洗脱。

2.2.2.6 大孔树脂HPD826纯化效果

茶叶籽黄酮粗提物,经初步除杂、大孔树脂纯化、真空浓缩干燥得到的茶叶籽黄酮纯化物的纯度为40.81%,比纯化前4.73%提高了7.63 倍,说明HPD826树脂纯化效果较好,适合茶叶籽黄酮的富集纯化。

2.2.3 HPLC-MS分析鉴定茶叶籽黄酮纯化液

茶叶籽黄酮纯化液经HPLC-MS联用仪分析,所得HPLC图和总离子流图如图6所示,根据一、二级质谱图和紫外吸收光谱图分析其中主要成分,结合文献[7]初步确定图中4 个峰均为黄酮类化合物。

846480.jpg 

846471.jpg 

图 6 纯化液总离子流图(A)和高效液相色谱图(B)

Fig.6 Total ion chromatogram (A) and HPLC chromatogram (B) of purified flavonoids

2.2.3.1 化合物Ⅰ的结构分析

为更确切地获得目标分子的质谱信息,本实验采用正、负离子双重模式获得电喷雾电离质谱图。在HPLC条件下,ESI正离子模式(ESI+-MS)中,会出现[M+Na]+、[M+K]+、[M+H]等离子峰[9,13,15];ESI负离子模式(ESI--MS)中,会出现[M+Cl]-、[M-H]-等离子峰[24-26]。化合物Ⅰ的一、二级质谱图见图7(A、B、C),在ESI+-MS图中离子峰m/z 897.4为[M+Na]+峰,
m/z 913.3为[M+K]+峰,在ESI-MS图中,m/z 873.4为准分子离子峰[M-H]-,m/z 909.3为[M+Cl]-峰,说明化合物Ⅰ的相对分子质量为874.4。继续对m/z 873.4离子进行二级质谱分析,碎片离子m/z 271.0[M-H-162-132-162-146]-为[M-H]-脱去4 个糖配基的产物,
m/z 753.1[M-H-120]-为[M-H]-通过逆狄尔斯-阿德尔(Retro Diels-Alder,RDA)裂解反应脱去B环产生,此碎片说明该分子母核B环上有—OH取代,另有m/z 150.8的碎片离子,这与柚皮素的裂解规律一致[27-28],联系该物质的紫外吸收光谱,推测其可能为苷元为柚皮素的四糖苷。此外,在ESI-MS-MS图谱中,碎片离子m/z
710.2[M-H-162]-为[M-H]-脱去一分子葡萄糖基的产物,碎片离子m/z 577.2[M-H-162-132-H]-为m/z 710.2脱去一分子吡喃木糖基的产物。结合文献[7]推断该物质为柚皮素-7-O-[β-D-吡喃木糖基(1→6)][β-D-葡萄糖基(1→3)-α-L-鼠李糖基(1→2)]-β-D-葡萄糖苷(naringenin-7-O-[β-D-xylopyranosyl(1→6)][β-D-glucopyranosyl(1→3)-α-L-rhamnopyranosyl(1→2)]-β-D-glucopyranoside)。

846463.jpg 

846445.jpg 

846437.jpg 

846428.jpg 

图 7 化合物Ⅰ的一级(A、B)、二级(C)质谱图及紫外吸收光谱图(D)

Fig.7 Primary (A, B) and secondary (C) MS spectra as well as ultraviolet (UV) spectrum (D) of compound Ⅰ

2.2.3.2 化合物Ⅱ的结构分析

化合物Ⅱ的一、二级质谱图见图8(A、B、C),在ESI+-MS图中离子峰m/z 735.3为[M+Na]+峰,m/z
751.3为[M+K]+峰,在ESI-MS图中,m/z 711.2为准分子离子峰[M-H]-,m/z 747.1为[M+Cl]-峰,说明化合物Ⅱ的相对分子质量为712.2。继续对m/z 712.2离子进行二级质谱分析,碎片离子m/z 271.0[M-H-132-162-146]-为[M-H]-脱去3 个糖配基的产物,m/z 591.2[M-H-120]-为[M-H]-通过RDA裂解反应脱去B环产生,此碎片说明该分子母核B环上有-OH取代,另有m/z 150.8和119.1的碎片离子,这与柚皮素的裂解规律一致[27-28],联系该物质的紫外吸收光谱,推测其可能为苷元为柚皮素的三糖苷。此外,在ESI-MS-MS图谱中,碎片离子m/z 458.7[M-H-120-132]-为m/z 591.2脱去一分子吡喃木糖基的产物。结合文献[7],推测其结构为柚皮素-7-O-α-L-鼠李糖基(1→2)-[β-D-吡喃木糖基(1→6)]-β-D-葡萄糖苷(aringenin-7-O-α-L-rhamnopyranosyl(1→2)-[β-D-xylopyranosyl(1→6)]-β-D-glucopyranoside)。

846420.jpg 

846410.jpg 

846401.jpg 

846392.jpg 

图 8 化合物Ⅱ的一级(A、B)、二级(C)质谱图及紫外吸收光谱图(D)

Fig.8 Primary (A, B) and secondary (C) MS spectra as well as UV spectrum (D) of compound Ⅱ

2.2.3.3 化合物Ⅲ的结构分析

化合物Ⅲ的一、二级质谱图见图9,在ESI+-MS图中离子峰m/z 765.0为[M+Na]+峰,m/z 781.2为[M+K]+峰,在ESI--MS图中,m/z 741.3为准分子离子峰[M-H]-,
m/z 777.3为[M+Cl]-峰,说明化合物Ⅲ的相对分子质量为742.3。继续对m/z 741.3离子进行二级质谱分析,碎片离子m/z 271.0[M-H-162-162-146]-为[M-H]-脱去3个糖配基的产物,m/z 621.3[M-H-120]-为[M-H]-通过RDA裂解反应脱去B环产生,此碎片说明该分子母核B环上有-OH取代,另有m/z 151.0的碎片离子,这与柚皮素的裂解规律一致[27-28],联系该物质的紫外吸收光谱,推测其可能为苷元为柚皮素的三糖苷。此外,在ESI-MS-MS图谱中,碎片离子m/z 579.2[M-H-162]-为[M-H]-脱去一分子葡萄糖基的产物,碎片离子m/z
433.1[M-H-162-146]-为m/z 579.2脱去一分子鼠李糖基的产物。结合文献[7],推测其结构为柚皮素-7-O-β-D-葡萄糖基(1→3)-α-L-鼠李糖基(1→2)-β-D-葡萄糖苷(naringenin-7-O-β-D-glucopyranosyl(1→3)-α-L-rhamnopyranosyl(1→2)-β-D-glucopyranoside)。

846384.jpg 

846376.jpg 

846366.jpg 

846358.jpg 

图 9 化合物Ⅲ的一级(A、B)、二级(C)质谱图及紫外吸收光谱图(D)

Fig.9 Primary (A, B) and secondary (C) MS spectra as well as UV spectrum (D) of compound Ⅲ

2.2.3.4 化合物Ⅳ的结构分析

化合物Ⅳ的一、二级质谱图见图10(A、B、C),在ESI+-MS图中离子峰m/z 589.2为[M+Na]+峰,m/z
605.2为[M+K]+峰,在ESI--MS图中,m/z 565.2为准分子离子峰[M-H]-,m/z 601.2为[M+Cl]-峰,说明化合物Ⅳ的相对分子质量为566.2,继续对m/z 565.2离子进行二级质谱分析,产生碎片离子m/z 271.0为[M-H-132-162]-离子,另有m/z 151.1、176.9、119.0的碎片离子,这与柚皮素的裂解规律一致[27-28],联系紫外吸收光谱,推测其可能为柚皮素的二糖苷。此外,在ESI-MS中还得到m/z 435.2的碎片离子,表明该物质的外侧糖基可能为木糖。结合文献[7],推测其结构为柚皮素-7-O-β-D-吡喃木糖基(1→6)-β-D-葡萄(naringenin-7-O-β-D-xylopyranosyl(1→6)-β-D-glucopyranoside)。

846343.jpg 

846335.jpg 

846326.jpg 

846317.jpg 

图 10 化合物Ⅳ的一级(A、B)、二级(C)质谱图及紫外吸收光谱图(D)

Fig.10 Primary (A, B) and secondary (C) MS spectra as well as
UV spectrum (D) of compound Ⅳ

3 结 论

通过考察12 种树脂对茶叶籽总黄酮的吸附、解吸特性,综合考虑吸附率、解吸率、静态动力学等因素,HPD826树脂有较高的吸附率和解吸率,适合用来纯化茶叶籽总黄酮。对影响HPD826树脂吸附解吸的各因素进行了系统研究,最终确定最佳条件为:上样液质量浓度为1.8 mg/mL、上样流速2 mL/min、体积分数50%的乙醇作为洗脱剂、洗脱剂流速1 mL/min。此条件下的洗脱曲线峰形对称,分离较为完全。样品纯化后的茶叶籽黄酮纯度为40.81%,比纯化前提高了7.63 倍,说明HPD826树脂纯化效果较好。通过HPLC-MS对茶叶籽黄酮做了分析,初步确定茶叶籽中的4 种黄酮结构,均为柚皮素的多糖苷。

参考文献:

[1] 曹国锋, 邬冰, 钟守贤. 茶叶籽油、油茶籽油与茶树油的区别[J]. 中国油脂, 2008, 33(8): 17-20.

[2] 侯留鑫, 王华清, 郑铁松, 等. 一种新型茶叶籽黄酮单体的分离鉴定及其抗氧化活性研究[J]. 食品科学, 2013, 34(21): 115-120.

[3] 王华清, 李起弘, 郑铁松. 茶叶籽中总黄酮的提取及结构的初步鉴定[J]. 食品工业科技, 2012, 33(7): 282-286.

[4] GAO Dafeng, XU Min, ZHAO Ping, et al. Kaempferol acetylated glycosides from the seed cake of Camellia oleifera[J]. Food Chemistry, 2011, 124(2): 432-436.

[5] CHEN J H, WU H Y, LIAU B C, et al. Identification and evaluation of antioxidants defatted Camellia oleifera seeds by isopropanol salting-out pretreatment[J]. Food Chemistry, 2010, 121(4): 1246-1254.

[6] DU L C, WU B L, CHEN J M. Flavonoid triglycosides from the seeds of Camellia oleifera Abel[J]. Chinese Chemical Letters, 2008, 19(11): 1315-1318.

[7] LI N, MORIKAWA T, MATSUDA H, et al. New flavanone oligoglycosides, theaflavanosides Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ, and Ⅳ, with hepatoprotective activity from the seeds of tea plant (Camellia sinensis)[J]. Heterocycles, 2007, 71(5): 1193-1201.

[8] PARK J S, RHO H S, KIM D H, et al. Enzymatic preparation of kaempferol from green tea seed and its antioxidant activity[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2006, 54(8): 2951-2956.

[9] WAN P F, SHENG Z L, HAN Q, et al. Enrichment and purification of total flavonoids from Flos Populi extracts with macroporous resins and evaluation of antioxidantactivities in vitro[J]. Journal of Chromatography B, 2014, 945/946: 68-74.

[10] KIM J, YOON M, YANG H, et al. Enrichment and purification of marine polyphenol phlorotannins using macroporous adsorption resins[J]. Food Chemistry, 2014, 162: 135-142.

[11] 邓荣华, 郭宇星, 李晓明, 等. 芦蒿秸秆总黄酮富集纯化及产物鉴定[J]. 食品科学, 2013, 34(9): 85-89.

[12] ZHANG J Y, LU J Q, GAO X Y, et al. Characterization of thirty-nine polymethoxylated flavonoids (PMFs) in the branches of Murraya paniculata by HPLC-DAD-ESI-MS/MS[J]. Chinese Journal of Natural Medicines, 2013, 11(1): 63-70.

[13] 李晨, 姜子涛, 李荣. 高效液相色谱-串联质谱联用技术鉴定樱桃叶中的黄酮成分[J]. 食品科学, 2013, 34(16): 226-229.

[14] de RIJKE E, OUT P, NIESSEN W, et al. Analytical separation and detection methods for flavonoids[J]. Journal of Chromatography A, 2006, 1112(1): 31-63.

[15] BERTIN R L, GONZAGA L V, BORGES G S C, et al. Nutrient composition and, identification/quantification of major phenolic compounds in Sarcocornia ambigua (Amaranthaceae) using HPLC-ESI-MS/MS[J]. Food Research International, 2014, 55: 404-411.

[16] KRUGER A, GANZERA M. Oroxylum indicum seeds-Analysis of flavonoids by HPLC-MS[J]. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2012, 70: 553-556.

[17] 李敏, 杨建华, 李渊, 等. 酒花黄酮提取工艺和含量测定[J]. 食品科学, 2011, 32(6): 16-19.

[18] 刘江波, 傅婷婷, 吕秀阳. 大孔树脂分离纯化三叶青总黄酮的工艺研究[J]. 中国药学杂志, 2011, 46(4): 287-292.

[19] 张素华, 王正云. 大孔树脂纯化芦笋黄酮工艺的研究[J]. 食品科学, 2006, 27(2): 182-186.

[20] 徐怀德, 陈佳, 包蓉, 等. 大孔吸附树脂分离纯化洋葱皮黄酮的研究[J]. 食品科学, 2011, 32(12): 133-138.

[21] 尹忠平, 上官新晨, 张月红, 等. 大孔树脂吸附纯化青钱柳叶三萜化合物[J]. 食品科学, 2011, 32(6): 61-65.

[22] 王孟楚, 李超. AB-8型大孔吸附树脂分离纯化鼠曲草总黄酮工艺[J]. 食品科学, 2011, 32(24): 88-91.

[23] 李超, 王乃馨, 郑义, 等. AB-8型大孔吸附树脂分离纯化大叶金花草总黄酮[J]. 食品科学, 2011, 32(16): 31-35.

[24] 张永, 严安定, 高建. 液质联用技术鉴定甘草提取物中的主要化学成分[J]. 中草药, 2012, 34(6): 1111-1115.

[25] 彭红, 林鹿, 刘玉环, 等. 负离子模式下纤维低聚糖的ESI-MS分析[J]. 食品科学, 2009, 30(12): 147-149.

[26] 王源园, 张尊建, 徐向阳, 等. 密花石斛与马鞭石斛不同药用部位的色谱指纹图谱研究[J]. 中药材, 2005, 28(7): 563-566.

[27] 杨洁, 陈纯, 邢建军, 等. 油菜蜂花粉中黄酮类化合物的提取与鉴定[J]. 食品科学, 2010, 31(22): 273-278.

[28] FABRE N, RUSTAN I, de HOFFMANN E, et al. Determination of flavone, flavonol, and flavanone aglycones by negative ion liquid chromatography electrospray ion trap mass spectrometry[J]. Journal of the American Society for Mass Spectrometry, 2001, 12(6): 707-715.

 

收稿日期:2014-06-26

基金项目:江苏省自然科学基金项目(BK2012850);江苏省高校自然科学研究项目(12KJB5500005);

浙江省自然科学基金项目(LY12C15001)

作者简介:杨安琪(1991—),女,硕士研究生,研究方向为食品化学与加工。E-mail:yanganqi91528@163.com

*通信作者:郑铁松(1963—),男,教授,博士,研究方向为食品生物化学。E-mail:tiesongzheng@sina.com