2 种米曲霉发酵酱油风味物质比较

赵国忠1，姚云平1，曹小红2，陈 卫1,*

（1.江南大学食品学院，食品科学与技术国家重点实验室，江苏 无锡 214122；

2.天津科技大学 教育部食品营养与安全重点实验室，天津 300457）

摘 要：为进一步比较传统菌株米曲霉沪酿3.042和前期实验诱变菌株米曲霉100-8酿造酱油的差异。通过高效液相色谱、气相色谱-质谱联用仪比较酱油中有机酸、氨基酸和风味物质成分的差异。通过发酵终期酱油有机酸的结果比较发现：米曲霉100-8发酵的酱油中苹果酸含量增加，柠檬酸和琥珀酸含量下降。通过酱油发酵在大曲阶段和后期阶段的氨基酸比较发现，使用米曲霉100-8菌株发酵的酱油大曲及其后期发酵为酱油阶段，天冬氨酸、谷氨酸和精氨酸这3 种氨基酸含量都明显升高。这些有机酸和氨基酸含量之间比例的差异性是造成酱油风味不同的原因之一。对风味物质成分的分析发现：与对照相比，米曲霉100-8发酵的酱油中醇、醛、酸和吡嗪类物质都有所增加，其中风味物质增多最明显的是吡嗪类。通过米曲霉100-8酿造的酱油与传统米曲霉沪酿3.042比较，其有机酸、氨基酸和风味物质都有明显的不同。

关键词：米曲霉；酱油；有机酸；氨基酸；风味物质

Comparison of Flavor Compounds in Soy Sauces Fermented by Two Aspergillus oryzae Strains

ZHAO Guo-zhong1, YAO Yun-ping1, CAO Xiao-hong2, CHEN Wei1,*

(1. State Key Laboratory of Food Science and Technology, School of Food Science and Technology, Jiangnan University,

Wuxi 214122, China; 2. Key Laboratory of Food Nutrition and Safety, Ministry of Education,
Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, China)

Abstract: The contents of organic acids, amino acids and flavor components in soy sauce fermented by Aspergillus oryzae 3.042 were analyzed by high performance liquid chromatography (HPLC) and gas chromatography-mass spectrometry
(GC-MS) in comparison to those of soy sauce fermented by A. oryzae 100-8, a mutant strain. The organic acids, amino acids and flavor components at the end of low-salt solid soy sauce fermentation by A. oryzae 3.042 and 100-8 strains were measured. The content of malic acid in soy paste fermented by A. oryzae 100-8 was increased, while citric acid and succinate were decreased. The contents of asparagic acid, glutamic acid and arginine were increased in fermented koji and soy sauce. The taste of soy sauce was also influenced by different ratios between organic acids and amino acids. The contents of alcohols, aldehydes, acids and pyrazines in soy sauce fermented by A. oryzae 100-8 were enhanced. More pyrazines were detected in soy paste fermented by A. oryzae 100-8. These results seem to provide a theoretical basis for the soy sauce industry.

Key words: Aspergillus oryzae; soy sauce; organic acids; amino acids; flavors

中图分类号：TS264.2 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）24-0249-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201424048

酱油[1]是一种在亚洲国家盛行的具有咸味和独特风味的大豆类传统发酵调味品。酱油的消费市场目前也正在从亚洲国家走向西方市场，在世界各地广泛使用，并逐步实现了酱油的国际化。酱油几乎是中国每家每户佐餐的必需品，担当着基础调味料的重要角色。中国每年的酱油产量超过500万 t，占世界总产量的55%以上[2-3]。酱油是由豆粕和麸皮（或大豆和小麦）的混合原料通过米曲霉制曲发酵，后期添加酵母和乳酸菌厌氧发酵，再用盐水淋洗而成的。发酵而成的酱油，经过复杂的生物化学作用，具有其独特的风味，营养价值丰富。

酱油风味的形成是一个极为复杂的、有微生物参与的过程，它的形成需要一些必须的化合物，如游离的氨基酸、水溶性肽及美拉德反应产物[4-6]。这些风味化合物主要来源于碳和氮的代谢。随着功能性食品的发展，最近几年人们越来越关注酱油中功能因子的研究，酱油中的许多风味化合物即具有很好的功能特性，包括抗氧化[7-9]、抗癌[10]、降压[11]、抗菌[12]、抗血小板聚集[13]、抗白内障[14]和抗过敏原的功能特性。酱油同样可以被视为是一种功能性食品。关于酱油风味的研究正是目前研究的重点，而风味的形成与发酵微生物有息息相关的联系。本研究通过传统米曲霉沪酿3.042和诱变菌株米曲霉100-8的风味物质成分的比较分析，为酱油风味物质成分的形成代谢途径提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

豆粕和麸皮均为天津市利民调料有限公司提供。

甲醇、乙酸、乳酸、丙酸、柠檬酸、酒石酸、草酸、苹果酸、琥珀酸（均为色谱纯） 天津市科密欧化学试剂开发中心。

1.2 仪器与设备

LC-20AT高效液相色谱仪、QP2010plus气相色谱-质谱联用仪 日本岛津公司；1100高效液相色谱仪 美国安捷伦公司；固相微萃取 上海市实验仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 三角瓶种曲

用接种环挑取3 环米曲霉孢子于灭菌麸皮（含质量分数50%水）中，混匀，30 ℃堆积培养。培养大约15 h第1次摇瓶，将培养基平铺，30 ℃继续培养8 h第2次摇瓶，继续平铺培养。变绿后扣瓶培养直至全部变绿。然后将其装入牛皮纸袋中，50 ℃烘干6 h左右，种曲制成。

1.3.2 竹匾大曲

接种质量分数0.3%的种曲于灭过菌的大曲培养基（m（豆粕）∶m（麸皮）=6∶4），混匀后堆积培养，湿布盖好，30 ℃恒温培养。约15 h后第1次翻曲，30 ℃平铺培养8 h以后，直到大曲培养基全部变白色，第2次翻曲后继续平铺培养。培养到种曲培养基变为黄绿色，大曲即制成。

1.3.3 低盐固态发酵

将大曲按照原料质量比1∶1的比例，拌入50 ℃左右盐度为质量分数12%的盐水，入缸压实，表面铺上塑料隔绝氧气，40 ℃发酵10 d，35 ℃发酵20 d即可。

1.3.4 有机酸测定液相色谱条件

称取10 g大曲或酱醪装入100 mL的三角瓶中，加入50 mL蒸馏水，煮沸5 min，过滤，然后用100 mL容量瓶定容，再用C18萃取小柱过滤，进样针吸取20 μL样品进样。

液相色谱柱：HydrospHere C18柱（250 mm×
4.6 mm）；流动相：0.02 mol/L KH2PO4；流速
0.5 mL/min；进样量20 µL；紫外检测器检测波长215 nm；柱温30 ℃。

1.3.5 氨基酸测定液相色谱条件

样品处理方法同1.3.4节。液相色谱柱：ODS HYPERSIL柱（250 mm×4.6 mm，5 µm）；流动相：A相和B相梯度洗脱；流速1.0 mL/min；进样量20 µL；紫外检测器检测波长338、262 nm；柱温40 ℃。

流动相A相：8.0 g结晶乙酸钠1 000 mL水溶解，再加入225 µL三乙胺，搅拌并滴加体积分数5%醋酸调节pH值为7.2，加5 mL四氢呋喃混合。

流动相B相：12.0 g结晶乙酸钠400 mL水溶解，滴加体积分数5%醋酸调节pH值为7.2，加入800 mL乙腈和800 mL甲醇混合。

1.3.6 固相微萃取-气相色谱-质谱条件

固相微萃取技术可以在一定程度上检测出酱油中的可挥发性物质的成分和相对含量[15]。使用方便，易操作。分别称5 g大曲和酱醪于顶空瓶中，拧好瓶盖，于50 ℃水浴中平衡30 min，将固相微萃取针插入顶空瓶中吸附30 min，然后进行气相色谱-质谱测定。

气相色谱条件：色谱柱：VF-5MS毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25 µm）；升温程序：起始温度40 ℃，保持30 min，以4 ℃/min升至150 ℃，保持1 min，以8 ℃/min升到250 ℃，保持6 min；载气（He）流速1.0 mL/min；进样量0.5 µL；分流比5∶1。

质谱条件：电子电离源；电子能量70 eV；传输线温度280 ℃；离子源温度220 ℃；激活电压1.5 V；质量扫描范围m/z 43～500。

分析方法：惠普化学工作站软件对照NIST 05库进行数据收集，谱库初步鉴定物质成分，结合保留时间、质谱、试剂成分和保留指数定性。面积归一化法相对定量。

2 结果与分析

2.1 大曲和酱油中主要有机酸测定

表 1 酱油中各有机酸含量

Table 1 Contents of organic acids in soy sauce

g/100 mL

米曲霉100-8是经过米曲霉3.042菌株诱变而来的菌株，米曲霉100-8菌株分泌蛋白酶的能力比米曲霉3.042菌株强。2个菌株发酵的酱油风味也不同。因此，分别对不同培养时间段（24、30、36 h）的酱油发酵大曲和后期阶段的酱油的有机酸含量进行测定[16]。经测定发现大曲中的有机酸含量极微，很难检测出来，酱油中的有机酸产生比较明显。依据有机酸出峰时间、峰面积和标准曲线回归方程的方法计算酱油中各有机酸含量。结果如表1所示。

由表1可以看出，发酵终期米曲霉100-8发酵的酱油中酒石酸、甲酸、苹果酸、乳酸和丙酸的含量都增多，而柠檬酸和琥珀酸的含量减少。苹果酸和柠檬酸在食品中是2 种重要的酸类物质。在大多数水果比如苹果、桃、菠萝、甜瓜、西瓜、葡萄和西红柿中，苹果酸含量较高，通常与柠檬酸一起组成了水果中的主要酸类物质[17]。不同的水果中这2 种酸的比例的不同，也导致了其风味口感的不同。琥珀酸作为食品中的添加剂，可以增强食品风味[18]。目前未见到在米曲霉中酒石酸的生成途径，在其他物种比如植物中酒石酸有的是由抗坏血酸经过酶的作用转化生成的，在豆科植物中，酒石酸也可由D-葡萄糖转化生成[19]。柠檬酸、苹果酸和酒石酸主要是食品中酸味成分的主要来源，构成了食品中的酸性口味[20]。

结合米曲霉发酵过程中的三羧酸循环（tricarboxylic acid cycle，TCA）途径，苹果酸、柠檬酸和琥珀酸的产生主要由TCA循环途径产生（图1）。根据转录组数据[21]
也发现在TCA循环的上游通路中，乌头酸梅和异柠檬酸脱氢酶表达上升了2 倍以上（用圆形表示），其他酶上升也较为明显（用五角星表示），由于这些酶的表达升高，促进了柠檬酸和琥珀酸的降解，导致这2 种酸的下降，而苹果酸处于TCA循环的下游。上游中酶表达量的增大促进了下游苹果酸合成的增多。转录组数据同样观察到丙酮酸脱羧酶的增多，直接促进下游循环草酰乙酸含量的增大，而苹果酸脱氢酶的表达下降（用三角形表示）。苹果酸在草酰乙酸的上游，正是下游草酰乙酸的增多，苹果酸脱氢酶的降低，上游柠檬酸和琥珀酸的减少这两方面的双重作用使得苹果酸含量增多。米曲霉100-8糖酵解途径中丙酮酸的产生增加，当加入盐水进入后期厌氧发酵以后，导致丙酮酸在酶的作用下生成的乳酸较多。转录组分析结果和发酵实验中的结果相吻合。

图 1 酸类物质在TCA循环中的代谢通路[21]

Fig.1 Acid metabolism in TCA cycle[21]

2.2 大曲和酱油中氨基酸的测定结果

通过对大曲中不同时间段的氨基酸含量的测定[22]，如图2A所示，横轴以上柱状图表示米曲霉沪酿3.042发酵的大曲所测氨基酸的含量，横轴以下柱状图表示米曲霉100-8发酵大曲所测氨基酸含量。其中，谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、苏氨酸和精氨酸在米曲霉100-8发酵大曲中有较为明显的升高。由图2B可知，在米曲霉100-8发酵的酱油中，谷氨酸、天冬氨酸、蛋氨酸、缬氨酸、精氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、丙氨酸和甘氨酸的含量有所增高。

A图横轴以上柱状图为米曲霉沪酿3.042，横轴以下柱状图为米曲霉100-8。

图 2 大曲（A）及酱油（B）中氨基酸的含量比较

Fig.2 Comparison of amino acid contents in soy sauce and koji

综上所述，米曲霉100-8发酵酱油中呈鲜味的氨基酸：天冬氨酸、谷氨酸含量都增多；呈甜味的氨基酸：脯氨酸、丙氨酸、甘氨酸含量增多；呈苦味的氨基酸：蛋氨酸、精氨酸、异亮氨酸含量也相应的增多。氨基酸的含量是酱油风味的一个指标，不同的氨基酸会形成不同的口味，在生产中提高产品氨基酸的含量可以直接提高酱油的风味。

2.3 大曲和酱油中香气成分的测定

图 3 大曲和酱油中风味香气成分总量比较

Fig.3 Comparison of total contents of flavor components in
soy sauce and koji

通过对相同质量的大曲和酱油的分析（图3）可以看出，酱油中的总含量远大于大曲中的风味总物质含量，可见酱油的酿造过程是其风味物质不断形成积累的过程。

对发酵酱油的香气成分分析结果如表2所示。利用气相色谱-质谱联用检测到酱油中的风味物质种类都超过55 种，主要包括酯类、醇类、醛类、酸类、酮类、吡嗪、呋喃和酚类等。

表 2 香气成分测定比较分析

Table 2 Comparative analysis of flavor components

注：－.未检测出。

图 4 酱油中部分风味成分物质的比较

Fig.4 Comparison of flavor components in soy sauces fermented by the two strains

由酱油中风味物质的变化（图4）可以看出，米曲霉100-8发酵的酱油中吡嗪类物质、醇类物质、醛类物质和酸类物质的含量增加较明显。酯类物质变化不明显，含量稍微有所下降。吡嗪类峰面积增大6.9 倍，酸类物质增大1 倍，醇类和醛类物质都增大0.31 倍。醛类物质含量的增加在一定程度上促进了醇类物质的产生。米曲霉100-8发酵酱油比米曲霉沪酿3.042发酵的酱油增多了11 种醇，分别为：2,6-二甲基-4-庚醇、2-甲基-5-（1-甲基乙烯基）环己醇、桉叶油醇、Z-4-十二烯醇、2,2-二甲基丙基环己醇、3,7-二甲基-2,6-辛二烯-1-醇、顺-3-壬烯-1-醇、顺-9-萘烷醇、1-十三烷醇、反-2-甲基环戊醇和2-己基-1-葵醇。酸类、醇类、醛类物质的增多，证明由米曲霉100-8发酵的酱油中，基础风味物质成分有所增加。

在米曲霉100-8发酵的酱油中，吡嗪和2,3,5,6-四甲基吡嗪被发现。此外，2-甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪和三甲基吡嗪类含量上升较为明显，对酱油风味影响巨大。吡嗪类物质具有强烈的香气，而且其香气的透散性好，对香气具有独特的显著贡献[23-24]。吡嗪类物质也是加热食品中所具有的比较典型的香味成分，可以赋予其独特的焙烤和坚果风味。吡嗪类物质可以由美拉德反应产生[25]。主要美拉德反应的作用下葡萄糖和蛋白质反应生成3-脱氧葡糖醛酮，3-脱氧葡糖醛酮和氨基酸进一步反应生成希胺醇，最终得到吡嗪类化合物。

3 结 论

通过对米曲霉沪酿3.042和米曲霉100-8发酵大曲和酱油的有机酸、氨基酸和香气物质成分的测定，发现2 种菌株发酵产生酱油的不同风味物质，找到了米曲霉100-8的优势。通过高效液相色谱分析发现由于米曲霉100-8糖酵解代谢酶类物质的增加，生成了较多的丙酮酸，进入TCA循环以后，根据代谢酶的升高和降低，分析了部分有机酸的含量变化。酱油中氨基酸总量的提高对酱油品质和风味都有好处。通过气相色谱-质谱联用仪测定酱油香气物质的比较，发现米曲霉100-8发酵酱油产生的酸类、醇类、醛类、吡嗪类物质增多比较明显，对酱油的风味影响较大。其中变化最明显的是吡嗪类物质的增多，该类化合物主要是由美拉德反应生成的。

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