QuEChERS-DLLME-高效液相色谱法测定
蔬菜中溴虫腈和氟虫腈残留

白宝清，李美萍，张生万*

（山西大学生命科学学院，山西 太原 030006）

摘 要：建立同时检测蔬菜中溴虫腈和氟虫腈残留的QuEChERS-分散液液微萃取-高效液相色谱方法。样品用乙腈溶液提取，硫酸镁和氯化钠盐析后，加入N-丙基乙二胺和石墨化碳吸附净化，分散液液微萃取富集，用SunFire-C18反相色谱柱分离，以甲醇和水作为流动相梯度洗脱，二极管阵列检测器进行测定，外标法定量。并考察萃取剂和分散剂的类型及体积和萃取时间对萃取效率的影响。该方法在3.0～460 µg/kg范围内线性关系良好，相关系数（R2）不小于0.998 6，检测限0.70～0.86 µg/kg。3个不同加标水平的平均回收率为90.5%～108.5%。相对标准偏差小于10%。结果表明，该方法简便、准确、并且成本较低，适用于蔬菜中溴虫腈和氟虫腈农药残留的测定。

关键词：溴虫腈；氟虫腈；QuEChERS；分散液液微萃取；高效液相色谱

Determination of Chlorfenapyr and Fipronil Residues in Vegetables by QuEChERS Combined with Dispersive Liquid-liquid Microextraction and High Performance Liquid Chromatography

BAI Bao-qing, LI Mei-ping, ZHANG Sheng-wan*

(College of Life Sciences, Shanxi University, Taiyuan 030006, China)

Abstract: A method was developed for simultaneous determination of the residues of chlorfenapyr and fipronil in vegetables using QuEChERS combined with dispersive liquid-liquid microextraction and high performance liquid chromatography. The sample was extracted with acetonitrile, salted out with MgSO4 and NaCl, cleaned up with N-propyl ethylenediamine (PSA) and graphitized carbon, and concentrated by dispersive liquid-liquid microextraction (DLLME) before being analyzed by HPLC. The separation of the target compounds was performed on a SunFire-C18 liquid chromatography column using a mobile phase consisting of acetonitrile and water in a gradient elution mode and the matrix-matched external standard calibration method was used for quantitation. Key DLLME experimental parameters including the type and volume of extractant and disperser solvent and extraction time were optimized. This method had a good linearity in range of
3.0–460 μg/kg with correlation coefficients more than 0.998 6 (R2), and the limits of detectionwere in the range of
0.70–0.86 μg/kg. The average recoveries of chlorfenapyr and fipronil at three spiked concentration levels ranged from 90.5% to 108.5%, with relative standard deviations (RSDs) less than 10%. This method is simple, accurate, low-cost, and applicable for the determination of chlorfenapyr and fipronil residues in vegetables.

Key words: chlorfenapyr; fipronil; QuEChERS; dispersive liquid-liquid microextraction; high performance liquid chromatography

中图分类号：O657.7 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）24-0254-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201424049

溴虫腈是吡咯类杀虫、杀螨剂，昆虫取食或接触溴虫腈后在体内多功能氧化酶作用下转变为具有杀虫活性的化合物。氟虫腈是苯基吡唑类新型高活性杀虫剂[1]，其作用机制在于阻碍昆虫γ-氨基丁酸控制的氯化物代谢，因而对叶蝉、鳞翅目幼虫、蚜虫、蝇类和飞虱等害虫有很高的杀虫活性，对作物无药害。两种农药具有防虫效果好、用量低、起效时间长等优点，已经在农作物生产中广泛使用。随着溴虫腈和氟虫腈使用范围的逐渐扩大和用量的不断增加，其残留的毒副作用也逐步显现。它们在食品和环境中半衰期长，残留物能够在生物体中富集，对生物体的健康具有较大毒害风险。由于溴虫腈和氟虫腈在青菜、白菜、大豆、黄瓜、苋菜、小松菜、四季豆、大葱、胡萝卜等蔬菜上的广泛使用，对蔬菜虫害的控制起到了很重要的作用，但同时也不可避免地产生了农药残留问题。随着人们生活水平的提高，蔬菜中农药残留问题已日渐受到重视，目前国际上对溴虫腈和氟虫腈在食品中的最大残留限量标准也日益严格。因此，建立蔬菜中简单、准确、成本低的检测方法具有十分重要的意义。

目前溴虫腈和氟虫腈在蔬菜和水果中的主要测定方法为气相色谱法[2-3]、液相色谱法[4-7]、气相色谱-质谱联用法[8-12]、液相色谱-质谱联用法[13-14]，上述方法前处理富集程度低，或者操作步骤繁琐，使用装置昂贵。本方法针对已有报道存在的不足，基于QuEChERS（quick, easy, cheap, effective, rugged, safe）的快速提取[15-17]和分散液液微萃取（dispersive liquid-liquid microextraction，DLLME）[18-19]的快速富集原理，使用高效液相色谱建立分析检测蔬菜中溴虫腈和氟虫腈残留的方法。方法将DLLME良好的萃取富集与高效液相色谱的高分离能力结合起来，具有灵敏度高、重复性好、可操作性强，免去其他方法繁琐的净化步骤，适合大批量蔬菜样品中溴虫腈和氟虫腈残留的定量检测。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

溴虫腈、氟虫腈（含量大于99.8%）标准品、N-丙基乙二胺（primary secondary amine，PSA）、石墨化碳 百灵威科技有限公司；乙腈、甲醇、四氯化碳、四氯乙烯、氯仿、氯苯（均为色谱纯） 德国Merck公司；丙酮、正己烷、乙酸乙酯、MgSO4（均为分析纯）、NaCl（优级纯） 天津市光复科技发展有限公司；水为去离子水。

1.2 仪器与设备

1525高效液相色谱仪（含二极管阵列检测器和工作站） 美国Waters公司；FJ-200型高速分散均质机
上海标本模型厂；HC-3018型高速离心机 安徽中科中佳科技仪器有限公司；DV215CD电子天平 奥豪斯仪器（上海）有限公司；XW-80A旋涡混合器 上海医科大学仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 标准溶液配制

分别准确称取溴虫腈、氟虫腈标准品适量，用甲醇溶解并定容到5 mL，配制成质量浓度为1 mg/mL的标准储备溶液，置于－20 ℃保存。移取标准储备液各500 μL于5 mL的容量瓶中，用甲醇定容到5 mL，制成标准混合液，4 ℃冰箱存放备用。用流动相逐级稀释标准混合液，配制系列工作溶液。

1.3.2 色谱条件

色谱柱：SunFire-C18（250 mm×46 mm，5 μm）；流速：1 mL/min；柱温：室温；检测波长：溴虫腈和氟虫腈分别在260、280 nm波长处检测；进样量：20 μL；流动相：乙腈-水；梯度洗脱程序：在0～6 min，乙腈由30%线性递增至70%，6～8 min，乙腈70%，8～10 min，乙腈由70%线性递增至80%，10～17 min，乙腈80%，17～20 min，乙腈由80%线性递减到30%，20～30 min，乙腈30%。色谱峰保留时间定性，外标法定量，进样体积20 μL。

1.3.3 样品前处理

称取匀浆粉碎样品10 g 于50 mL聚四氟乙烯离心管中，加入乙腈10 mL，涡旋2 min；加入2.0 g MgSO4和1.0 g NaCl，剧烈振荡1 min，于5 000 r/min离心2 min；取上清液6 mL，加入100 mg PSA和75 mg石墨化碳，涡旋3 min，于5 000 r/min离心5 min；取上层溶液1 mL于10 mL具塞尖底离心试管中，加入5 mL去离子水，再加入30 μL四氯化碳，振荡30 s，形成均匀的乳浊液，于5 000 r/min离心5 min 使之分层，用注射器吸取底部有机溶液于1.5 mL离心管中，用氮气吹干，加入和四氯化碳等体积的甲醇复溶，供高效液相色谱分析。

2 结果与分析

2.1 QuEChERS提取剂的选择

QuEChERS前处理中常用甲醇、乙腈、乙酸乙酯和正己烷与丙酮混合液作为农药残留的提取剂[20-21]，在样品中添加一定量溴虫腈和氟虫腈标准混合溶液，分别用相同体积的乙腈、丙酮-正己烷（3∶7，V/V）、甲醇和乙酸乙酯提取，如图1所示，结果表明，与甲醇、乙酸乙酯、正己烷与丙酮混合液相比，乙腈的提取效果优于其他。并且乙腈提取蔬菜中色素、蜡质、脂肪等非极性成分的能力相对较弱，更容易通过后续加入吸附剂除去基质的干扰物质。

图 1 QuEChERS提取剂的选择

Fig.1 Screening of extractant for QuEChERS

2.2 吸附剂的优化

比较乙腈提取液中加入PSA和石墨化碳和不加PSA和石墨化碳时对色谱分离效果的影响，如图2所示。并对PSA和石墨化碳用量进行了考察，结果如表1所示。

表 1 PSA和石墨化碳用量对回收率的影响

Table 1 Effect of PSA and graphitized carbon amounts on the recoveries of fipronil and chlorfenapyr

A.加PSA和石墨化碳；B.未加PSA和石墨化碳。

图 2 PSA和石墨化碳对净化效果的影响

Fig.2 Effect of PSA and graphitized carbon on clean-up efficiency

由图2可知，不加吸附剂PSA和石墨化碳时，乙腈提取液中色素、蜡质和脂肪等成分会干扰目标化合物出峰，加入PSA和石墨化碳以后，可以有效地除去基质中的干扰物对待测物色谱峰的影响，同时减少杂质对仪器和色谱柱的损害[22]。由表1可知，当PSA和石墨化碳加入量较小时，虽然对溴虫腈和氟虫腈吸附很小，但不能有效地除去基质中的干扰物，随着加入量的增加，能够有效地除去干扰物的影响，但对溴虫腈和氟虫腈吸附也同时增大。故实验选择PSA和石墨化碳的加入量分别为100 mg和75 mg用于净化，能够较好地兼顾两者。

2.3 DLLME方法的优化

2.3.1 萃取剂的选择

对相同体积的四氯化碳、三氯甲烷、氯苯、四氯乙烯4 种萃取剂对溴虫腈和氟虫腈萃取富集效果进行了考察，结果如图3所示。表明同等条件下四氯化碳的萃取效果最好，故选择四氯化碳作为萃取剂。

图 3 萃取剂的选择

Fig.3 Selection of extraction solvent

2.3.2 萃取剂用量的选择

在DLLME过程中，萃取剂的用量对目标分析物的萃取效率有重要的影响。分别对30、40、50、50、100 μL体积的四氯化碳作为萃取剂，1.0 mL乙腈作为分散剂体系进行实验，如图4所示。溴虫腈与氟虫腈的萃取效率随着四氯化碳用量的增加而减少。由于20 μL是实验中高效液相色谱仪的进样量，不宜选择20 μL作为萃取体积。因此，四氯化碳的最佳用量为30 μL。

图 4 萃取剂用量的选择

Fig.4 Effect of the amount of extraction solvent on peak area

2.3.3 分散剂用量的选择

分散剂乙腈用量直接影响四氯化碳能否有效地在水中分散，进而影响对待测物的萃取效果，实验考察乙腈体积在0.5～2.0 mL范围内对待测物的萃取富集效果，如图5所示。结果表明在0.5～1.0 mL范围内，待测物的萃取富集效果随着乙腈体积的增加而增加，在乙腈体积为1.0 mL时达到最大值，之后萃取效果随着乙腈用量的增加而降低。原因是随着乙腈用量的增加，待测物在水中的溶解度也随之增大，萃取效率降低。因此实验中乙腈的最佳用量为1.0 mL。

图5 分散剂用量的选择

Fig.5 Effect of the amount of disperser solvent on peak area

2.3.4 萃取时间的选择

考察萃取时间在10～120 s范围内对待测物萃取效果的影响，如图6所示。萃取时间为10 s时，体系不能有效地建立平衡。萃取时间在10～30 s内萃取效率逐渐增大，当萃取时间大于30 s后萃取效果基本趋于稳定，故选择30 s作为最佳萃取时间。

图 6 萃取时间的选择

Fig.6 Effect of extraction time on peak area

2.4 色谱条件的优化

实验比较了甲醇-水、乙-水腈两流动相体系，结果表明以甲醇-水溶液作为流动相体系时，溴虫腈和氟虫腈色谱峰峰形比较好，信号响应也相应增强。所以确定流动相为甲醇-水溶液，并且优化了流动相梯度比例。考察了溴虫腈和氟虫腈的210～400 nm范围内两组分的紫外吸收情况，检测波长为280 nm时，空白样品色谱图如7所示，加标样品的色谱图如图8所示，结果表明溴虫腈和氟虫腈标准品分别在260 nm和280 nm波长处灵敏度高，基质干扰小。故选择260 nm和280 nm作为最佳检测波长。

图 7 空白样品色谱图

Fig.7 Chromatogram of blank sample

图 8 加标样品色谱图

Fig.8 Chromatogram of spiked sample

2.5 方法的线性关系、检出限、定量限

表 2 方法的回归方程、检测限、定量限和重复性

Table 2 Standard curve equations, LOD, LOQ and repeatability for fipronil and chlorfenapyr

图 9 溴虫腈和氟虫腈的最低量（3 μg/kg）色谱图

Fig.9 Chromatogram of chlorfenapyr and fipronil at the lowest concentration level

图 10 溴虫腈和氟虫腈的最高量（460 μg/kg）色谱图

Fig.10 Chromatogram of chlorfenapyr and fipronil at the highest concentration level

试以分析物的峰面积Y对分析物的含量X/（μg/kg）作标准曲线，如表2所示。结果表明溴虫腈和氟虫腈农药在3.0～460 μg/kg范围内均呈良好的线性关系，其相关系数均不小于0.998 6，检测波长为280 nm时，溴虫腈和氟虫腈的最低添加量为3.0 μg/kg的加标色谱图如图9所示，最高添加量460 μg/kg的加标色谱图如图10所示，结果表明方法的检测限（按信噪比RSN=3计） 分别为0.70～
0.86 µg/kg，定量限（按RSN=10计）分别为3.0～3.5 μg/kg。说明该方法具有富集效果好，富集倍数35 倍、灵敏度高等优点，能够满足蔬菜中农药残留的检测要求。

2.6 回收率和精密度

分别在10 g捣碎的蔬菜样品中添加5、50、150 μg/kg溴虫腈和氟虫腈混合溶液，按上述最佳实验条件萃取后进样分析。每个添加水平平行测定3 次，以峰面积计算3 种添加水平的回收率及相对标准偏差（relative standard deviation，RSD），测定结果见表3。表明溴虫腈和氟虫腈回收率在90.5%～108.5%范围内，RSD小于10%。

表 3 黄瓜、豆角样品的回收率和精密度（n=3）

Table 3 Recovery rates and precision of fipronil and chlorfenapyr from spiked samples of cucumber and green bean (n = 3)

2.7 实际样品测定

按照最优的实验方法分别对市场上购买的10 个黄瓜样品和15 个豆角样品进行了分析检测，结果均未检出溴虫腈和氟虫腈农药残留。

3 结 论

建立QuEChERS-DLLME-HPLC法同时测定蔬菜中溴虫腈和氟虫腈残留的方法。样品前处理采用QuEChERS提取净化，DLLME萃取富集的技术，探讨了吸附剂PSA和石墨化碳用量对基质中干扰杂质的净化效果，萃取剂种类与体积、分散剂体积以及萃取时间对萃取效果的影响；方法的线性相关系数、回收率、RSD等各项参数指标，表明方法的灵敏度和精确度均满足实际样品检测的需要。同时本方法重复性好、检出限低、富集倍数高。相对于较昂贵的液相色谱-质谱联用和气相色谱-质谱联用而言，高效液相色谱法更易在普通实验室进行，可以作为溴虫腈和氟虫腈残留的检测方法。

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